酶法合成麥芽糖醇脂肪酸單酯的抑菌性*

何志勇，王潔，曾茂茂，秦昉，陳潔

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

脂肪酸酯不僅是一類優(yōu)良的表面活性劑，還具有較好的防腐抗菌功能。目前國內(nèi)外研究較多的主要是蔗糖酯類和甘油單脂肪酸酯類的抑菌性［1-5］，且研究發(fā)現(xiàn)，糖酯的酯化度會影響其抑菌性，蔗糖單酯的抑菌能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于二酯或多酯［6］。麥芽糖醇脂肪酸酯是由麥芽糖醇與脂肪酸反應(yīng)而成的一類新型優(yōu)良的非離子型表面活性劑［7］，但有關(guān)其抗菌功能性質(zhì)的研究較少。而且現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的大多是麥芽糖醇酯混合物的性質(zhì)［8-9］，這樣麥芽糖醇酯抑菌性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成的關(guān)系就不是很清楚。因此，為了探討不同脂肪酸?；筒煌H水基團(tuán)對糖酯抑菌性質(zhì)的影響，本論文通過脂肪酶NOV435催化合成系列麥芽糖醇脂肪酸酯，經(jīng)過分離純化制備獲得高純度麥芽糖醇脂肪酸單酯產(chǎn)品，并重點(diǎn)研究不同單酯對細(xì)菌和酵母的抑菌性能，分析單酯結(jié)構(gòu)與抑菌功能的關(guān)系，為其在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固定化脂肪酶Novozym435購于丹麥諾維信公司;麥芽糖醇購于Roquette公司;4?分子篩、柱層析硅膠(200～300目)，月桂酸、辛酸、油酸、硬脂酸、二甲基亞砜(DMSO)、正己烷、叔戊醇、異丙醇等均為分析純，蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉為生化試劑，均購于中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;甲醇為色譜純，購于百靈威;大腸桿菌(Eschericheae coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)為江南大學(xué)食品學(xué)院提供;變異鏈球菌(Streptococcus mutans)購于上海信然生物化學(xué)有限公司。

SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(LCMS)、Waters1525高效液相色譜儀，美國Waters公司;自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司;酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司;厭氧培養(yǎng)箱，英國Electrotek公司;無菌操作臺，蘇靜集團(tuán)安泰公司;振蕩培養(yǎng)箱，常州國華電器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;AVANCE III 400MHz核磁共振譜儀，德國Brucker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 非水相酶法合成麥芽糖醇脂肪酸酯

取10 mmol麥芽糖醇、40 mmol脂肪酸(月桂酸、辛酸、油酸、硬脂酸)于250 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL DMSO，50℃下平衡2 h，待完全溶解后，加入80 mL叔戊醇，50℃下平衡2 h，再加入1.0 g固定化脂肪酶Novozym435，反應(yīng)12 h后加入6 g 4 ?分子篩，密封后放入50℃恒溫水浴振蕩(150 r/min)中反應(yīng)72 h。其中油酸麥芽糖醇酯合成時需避光反應(yīng)。

1.2.2 麥芽糖醇脂肪酸單酯的分離制備

將反應(yīng)液用濾紙過濾除去固定化酶和分子篩，上硅膠柱層析分離。流動相分別為V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(甲醇)=4∶4∶2(月桂酸酯)，V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(甲醇)=3∶4∶3(辛酸酯)，V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(甲醇)=5∶3∶2(油酸酯)，V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(甲醇)=5∶4∶1(硬脂酸酯)，流速為 2 mL/min。洗出液經(jīng)HPLC檢測后，分段收集相應(yīng)組分。色譜分析條件:色譜柱 Lichrospher C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動相分別為V(甲醇)∶V(水)=85∶15 溶液(月桂酸酯)，V(甲醇)∶V(水)=74∶26 溶液(辛酸酯)，V(甲醇)∶V(水)=96∶4溶液(油酸酯、硬脂酸酯)，柱溫30℃，采用示差折光檢測器，檢測池溫度30℃，檢測器靈敏度為64。

將經(jīng)過硅膠柱層析分離后的收集液蒸干，用色譜純甲醇復(fù)溶，利用半制備HPLC制備。半制備條件:色譜柱 Lichrospher C18(5 μm，20.0 mm ×250 mm)，流速8 mL/min，進(jìn)樣量 500 μL，柱溫 30 ℃，流動相同上。采用示差折光檢測器，檢測池溫度30℃，靈敏度為64，分流比為1.5∶6.5。經(jīng)半制備得到的餾出液蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑，凍干備用。最終制備的產(chǎn)品分別經(jīng)MS［10］、FT-IR［11］和 NMR［10］分析鑒定為純度較高(＞95%)的麥芽糖醇月桂酸單酯、麥芽糖醇辛酸單酯、麥芽糖醇油酸單酯和麥芽糖醇硬脂酸單酯。

1.2.3 麥芽糖醇脂肪酸單酯的抑菌性

參照文獻(xiàn)［12］的方法，配制營養(yǎng)肉湯(LB)培養(yǎng)基、營養(yǎng)(LB)瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基、TPY固體培養(yǎng)基、TPY液體培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)。并將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變異鏈球菌和酵母菌接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化和擴(kuò)大化培養(yǎng)。

將麥芽糖醇脂肪酸單酯純品用無水乙醇配制成濃度為80 mg/mL的儲存液(-20℃保存)，用相應(yīng)培養(yǎng)基將儲存液稀釋成濃度為8 mg/mL，再依次2倍稀釋，最終單酯濃度為0.062 5～6 mg/mL。

挑取斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)過夜;酵母菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，150 r/min 30℃振蕩培養(yǎng)過夜;變異鏈球菌接種到TPY液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)過夜。分別用生理鹽水將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至5×105CFU/mL作為初始菌液。取100 μL初始菌液置于96孔板上，加入100 μL不同濃度的各單酯溶液。以不添加單酯樣品的作為陽性對照，不加入菌液的作為陰性對照。培養(yǎng)18 h后，用酶標(biāo)儀測定600 nm下各孔的濁度(OD600)。相比OD陰性值，OD試驗(yàn)值幾乎沒有增長，則此時麥芽糖醇單酯的濃度即為最低抑菌濃度(MIC)，并計算抑菌率。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥芽糖醇脂肪酸單酯的分離制備

麥芽糖醇脂肪酸酯經(jīng)酶法合成后，按各自硅膠柱分離條件反復(fù)分離純化，收集單酯洗脫液，經(jīng)HPLC分析，結(jié)果如圖1所示，各洗脫液中不含脂肪酸，主要為2組單酯峰(1和2)，其中(a)為麥芽糖醇月桂酸單酯(7.8、8.3 min)，(b)為麥芽糖醇辛酸單酯(4.7、5.6 min)，(c)為麥芽糖醇油酸單酯(7.3、8.0 min)，(d)為麥芽糖醇硬脂酸單酯(7.6、8.3 min)。經(jīng)MS分析，組分1和2為麥芽糖醇脂肪酸單酯的兩種同分異構(gòu)體。并利用半制備HPLC對麥芽糖醇脂肪酸單酯進(jìn)一步純化制備，獲得足夠量較純的單酯產(chǎn)品，用于后續(xù)的抑菌性能測試。

2.2 麥芽糖醇脂肪酸單酯的抑菌效果

根據(jù)GB2760規(guī)定，通常商業(yè)蔗糖酯使用濃度一般為0.1% ～0.5%，部分情況下還會更高。因此，該抑菌實(shí)驗(yàn)中麥芽糖醇脂肪酸酯的質(zhì)量濃度設(shè)定為0.062 5～6 mg/mL，以確保其在合適的使用量范圍內(nèi)。

圖2為麥芽糖醇脂肪酸單酯對大腸桿菌的抑制效果。從圖2可以看出，隨著濃度增加，麥芽糖醇月桂酸單酯對大腸桿菌的抑制作用明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度為2.0 mg/mL時，即可達(dá)到完全抑制的效果;麥芽糖醇辛酸單酯和麥芽糖醇油酸單酯對大腸桿菌的抑制率增長相對比較緩慢，濃度為6.0 mg/mL時才能達(dá)到完全抑制;麥芽糖醇硬脂酸單酯對大腸桿菌的抑制能力稍差，6.0 mg/mL時抑菌率為75%。

麥芽糖醇脂肪酸單酯對枯草芽孢桿菌的抑制效果如圖3所示，各測試樣品均顯示較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)麥芽糖醇月桂酸單酯、麥芽糖醇辛酸單酯、麥芽糖醇油酸單酯和麥芽糖醇硬脂酸單酯質(zhì)量濃度分別為0.5、4.0、6.0和6.0 mg/mL時就可完全抑制枯草芽孢桿菌的生長。

各麥芽糖醇脂肪酸單酯產(chǎn)品對變異鏈球菌也顯示很強(qiáng)的抑制效果。由圖4可知，麥芽糖醇月桂酸單酯、麥芽糖醇辛酸單酯、麥芽糖醇油酸單酯和麥芽糖醇硬脂酸單酯完全抑制變異鏈球菌生長的質(zhì)量濃度分別為0.25、1.0、2.0 和 4.0 mg/mL。

圖1 硅膠柱分離后麥芽糖醇脂肪酸單酯的HPLC圖Fig.1 The HPLC of monoacyl maltitols separated by silica gel column，(a)monolauroyl maltitol;(b)mono octanoyl maltitol;(c)mono oleoyl maltitol;(d)mono stearoyl maltitol

圖2 麥芽糖醇脂肪酸酯對大腸桿菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Eschericheae coli

圖3 麥芽糖醇脂肪酸酯對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Bacillus subtilis

圖4 麥芽糖醇脂肪酸酯對變異鏈球菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Streptococcus mutans

圖5為麥芽糖醇脂肪酸單酯對解脂亞羅酵母的抑制效果。與抑制細(xì)菌效果比較，各單酯對酵母抑制作用相對較弱，濃度在6.0 mg/mL時，麥芽糖醇辛酸單酯、麥芽糖醇月桂酸單酯、麥芽糖醇油酸單酯和麥芽糖醇硬脂酸單酯對解脂亞羅酵母的抑制率分別為16.7%、29.3%、20.1%和10%以下。

綜合以上結(jié)果并比較不同?；湹柠溠刻谴紗熙Ω魑⑸锏腗IC值(表1)發(fā)現(xiàn)，麥芽糖醇月桂酸單酯對各試驗(yàn)菌均呈現(xiàn)最強(qiáng)的抑菌能力，麥芽糖醇辛酸單酯和麥芽糖醇油酸單酯次之，麥芽糖醇硬脂酸單酯抑菌作用最弱。另外，結(jié)果也顯示，與蔗糖酯［1］類似，4種麥芽糖醇脂肪酸單酯對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制能力要強(qiáng)于對革蘭氏陰性細(xì)菌。

圖5 麥芽糖醇脂肪酸酯對酵母菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Yarrowia lipolytica

表1 不同?；滬溠刻谴贾舅釂熙ΤＲ娢⑸锏腗IC值mg/mLTable 1 MIC of monoacyl maltitols with different fatty acid acyls

不同親水基月桂酸單酯對微生物的MIC值見表2。麥芽糖醇月桂酸單酯對枯草芽孢桿菌和變異鏈球菌等革蘭氏陽性菌的抑制作用明顯強(qiáng)于麥芽糖月桂酸單酯和蔗糖月桂酸單酯，尤其是對變異鏈球菌顯示了很強(qiáng)的抑制能力，有可能是由于相對麥芽糖和蔗糖而言麥芽糖醇本身對這類菌就有一定的抑制效果。而在對酵母菌抑制性能方面，麥芽糖和蔗糖基的月桂酸單酯要強(qiáng)于麥芽糖醇月桂酸單酯。

表2 不同親水基月桂酸單酯對常見微生物的MIC值 mg/mLTable 2 MIC of mono lauroyl esters with different hydrophilic radicals

3 結(jié)論

通過脂肪酶NOV435催化合成并結(jié)合硅膠柱分離及半制備HPLC，獲得了4種麥芽糖醇脂肪酸單酯產(chǎn)品，測試了其對不同細(xì)菌和酵母的抑制效果。結(jié)果表明，麥芽糖醇脂肪酸單酯對革蘭氏陽性菌中枯草芽孢桿菌和變異鏈球菌具有很強(qiáng)的抑制效果，對革蘭氏陰性菌中大腸桿菌有較好的抑制作用，對酵母菌抑制能力相對較弱。不同脂肪酸?；鶎溠刻谴贾舅釂熙ヒ志杂幸欢ㄓ绊?，月桂酸單酯抑菌能力最強(qiáng)，辛酸單酯和油酸單酯次之，硬脂酸單酯較弱。與麥芽糖和蔗糖等親水基月桂酸單酯相比，麥芽糖醇月桂酸單酯對枯草芽孢桿菌和變異鏈球菌有更強(qiáng)的抑制作用。綜合而言，麥芽糖醇脂肪酸單酯具有優(yōu)良的抑菌性能，在食品行業(yè)中將有很好的應(yīng)用前景。

［1］ Kumari S D，Aranzazu G S，F(xiàn)errer M，et al.Effect of carbohydrate fatty acid esters on Streptococcus sobrinus and glucosyltransferase activity ［J］.Carbohydrate Research，2004，339(6):1 029-1 034.

［2］ Kabara J J.Fatty acids and derivatives as antimicrobial agents［J］.Champaign IL:American Oil Chemists Society，1978，18:72-75.

［3］ Kabara J J，Vrable R.Antimicrobial lipids:Natural and synthetic acids and monoglycerides ［J］.Lipids，1977，12:753-759.

［4］ Furukawa S，Akiyoshi Y，Ogihara H，et al.Sugar fatty acid esters inhibit biofilm formation by food-borne pathogenic bacteria［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，138(1/2):176-180.

［5］ Ferrer M，Soliveri J，Plou F J，et al.Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B，and their antimicrobial properties ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2005，36(4):391-398.

［6］ Veronique M S，Michele G，Philippe M，et al.Shear-induced phase transitions in sucrose ester surfactant［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2004，270(2):270-275.

［7］ 王潔，曾茂茂，何志勇，等.麥芽糖醇脂肪酸單酯表面性質(zhì)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(11):65-68.

［8］ Maguire A，Rugg-Gunn A J，Wright W G.Adaptation of dental plaque to metabolise maltitol compared with other sweeteners［J］.Journal of Dentistry，2000，28(1):51-59.

［9］ 張灝，王振虎，彭冬梅，等.麥芽糖醇脂肪酸酯的酶催化合成及表面張力測定［J］.食品科學(xué)，2010，31(18):153-156.

［10］ 孫月娥，夏文水，陳潔，等.魚油海藻糖酯的合成與表面性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(3):290-292.

［11］ 劉巧瑜，賈承勝，蔣平平，等.麥芽糖月桂酸酯的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定［J］.食品科學(xué)，2007，28(10):464-467.

［12］ 錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1999:10-12.

［13］ 劉巧瑜，張曉鳴.麥芽糖單酯和蔗糖單酯的抑菌性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(7):313-315.