姜黃素介導(dǎo)的光動力冷殺菌方法對牡蠣殺菌的效果研究

曹斌斌，武 娟，許川山，梁榮能，李兆杰　，王玉明，薛 勇，薛長湖，唐慶娟,*（.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 66003；.香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，香港 999077）

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姜黃素介導(dǎo)的光動力冷殺菌方法對牡蠣殺菌的效果研究

曹斌斌1，武 娟1，許川山2，梁榮能2，李兆杰1，王玉明1，薛 勇1，薛長湖1，唐慶娟1,*
（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，香港 999077）

摘 要：通過光動力療法（photodynamic therapy，PDT）對牡蠣肉勻漿及牡蠣腸道中的細菌進行殺滅處理，探究PDT可否殺滅牡蠣中的細菌。結(jié)果表明，以姜黃素為光敏劑的光動力冷殺菌處理對牡蠣中細菌具有非常好的滅活效果，3、6 h光敏劑富集組對牡蠣的殺菌率可達90%以上。同時該方法處理簡便，且具有廣譜殺菌特性。

關(guān)鍵詞：光動力方法；冷殺菌；牡蠣；姜黃素；菌落總數(shù)

引文格式：

曹斌斌,武娟,許川山,等.姜黃素介導(dǎo)的光動力冷殺菌方法對牡蠣殺菌的效果研究[J].食品科學(xué),2016,37(5):46-49.

CAO Binbin,WU Juan,XU Chuanshan,et al.Inactivation effect of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization on bacteria in oysters[J].Food Science,2016,37(5):46-49.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

我國牡蠣多為近海養(yǎng)殖，水體極易被污染，牡蠣在濾食水中食物的同時大量富集養(yǎng)殖水域中各類微生物，導(dǎo)致牡蠣衛(wèi)生質(zhì)量較差、貨架期較短，容易引發(fā)食品安全問題[1]。傳統(tǒng)的熱力殺菌方法雖然可以有效滅活微生物，但所需的高溫會導(dǎo)致食品產(chǎn)生色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的改變和損失[2]，導(dǎo)致加工后的牡蠣難以滿足消費者生食貝類的飲食要求。所以，各類冷殺菌方法常被用于牡蠣加工保鮮中，目前已應(yīng)用的冷殺菌技術(shù)主要有涂膜保鮮[3-5]、凍藏保鮮[6-7]、臭氧殺菌保鮮[8]、超高壓殺菌保鮮[9]等技術(shù)。但是，這些技術(shù)或殺菌效果不理想，或?qū)е履迪牋I養(yǎng)丟失嚴重，或成本太高。因此，開發(fā)一種能有效滅活微生物又能保持牡蠣的營養(yǎng)和品質(zhì)，成本低廉的新型冷殺菌技術(shù)是牡蠣加工行業(yè)迫切的要求[10]。

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）亦稱光化學(xué)療法或光輻射療法（photodynamic inactivation，PDI），是一種可選擇性滅活惡性腫瘤細胞和致病性微生物（包括細菌、真菌和病毒）的新方法。在特定波長的光源照射激發(fā)下，無毒的光敏劑吸收光子的能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周圍的氧，產(chǎn)生單態(tài)氧和一些活性氧物質(zhì)。這些活性氧具有強氧化作用，能夠破壞細胞大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細胞受損乃至死亡，從而達到滅活惡性腫瘤細胞和致病微生物的目的[11-13]。目前，光動力療法已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤[14-15]、抗細菌[16]、抗病毒[17]等效果，被應(yīng)用于癌癥[18]及血液制品[19]的消毒中，但是尚未見該技術(shù)在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域應(yīng)用的報道。

姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，屬于天然植物提取物，原料來源廣，成本低，安全無毒、無污染。研究表明，姜黃素具有光敏活性，對紅色毛癬菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有強烈的抑制作用，可以治療皮膚病[20-23]。江園等[12,22]報道以姜黃素為光敏劑的光動力方法可以有效誘導(dǎo)癌細胞凋亡，并且具有較好的殺菌效果，其中激發(fā)光為普通藍光光源（波長范圍420～480 nm）。本實驗采用姜黃素為光敏劑的光動力方法處理牡蠣，探討該方法對牡蠣中細菌的滅活效果，為光動力殺菌法應(yīng)用于水產(chǎn)品加工領(lǐng)域提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

牡蠣購買于青島市團島農(nóng)貿(mào)市場，鮮活低溫條件運回實驗室，無菌水沖洗干凈備用。

姜黃素（curcumin，食品級，純度＞95%） 陜西慈緣生物科技有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JYL-C012九陽料理機 九陽股份有限公司；LED藍光光源（波長范圍420～480 nm）由香港中文大學(xué)許川山課題組提供。

1.2方法

1.2.1光動力對牡蠣腸道細菌的滅活

將新鮮的牡蠣洗干凈后在無菌條件下開殼，切取牡蠣消化道部分，用無菌水稀釋100 倍后勻漿。在無菌的6孔板各孔中加入2 mL勻漿液，按照處理條件不同將勻漿液分成4 組，分別為：對照組（無光照、無姜黃素）、單純光照組（有光照、無姜黃素，使用自制光源照射60 s，根據(jù)光源功率推算得到光能量密度為3.6 J/cm2，后文中均使用光能量密度來描述光照強度）、單純光敏劑組（添加10 μmol/L的姜黃素，避光）、光動力實驗組（添加10 μmol/L姜黃素，光能量密度為3.6 J/cm2）。每組設(shè)置2 個平行。無菌條件下，參照GB 4789.3—2010《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》要求，分別取勻漿液1 mL接種到LB固體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計數(shù)細菌總數(shù)。其中，殺菌率按下式計算。

1.2.2光動力冷殺菌技術(shù)條件的選取

本課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)影響光動力方法對牡蠣肉殺菌效果的主要因素是光能量密度和光敏劑濃度。在此基礎(chǔ)上，按照1.2.1節(jié)所述步驟處理牡蠣，獲得其消化道部分的勻漿稀釋液，以此來探究不同姜黃素濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）和光能量密度（1.8、3.6、5.4 J/cm2）對殺菌效果的影響。

1.2.3光動力對新鮮半殼牡蠣中細菌的滅活

將新鮮、洗凈的活牡蠣分成4 組，對照組置于人工海水中，其余3 組置于含有姜黃素10 μmol/L的人工海水中，分別暫養(yǎng)3、6、12 h，其中m（貝類）∶m（海水）= 1∶4。將富集了姜黃素的牡蠣在無菌條件下開殼，給予5.4 J/cm2的光能量密度。各組取適量實驗前后的姜黃素人工海水，用720型分光光度計測定446 nm波長處的光密度（OD）值，計算姜黃素的富集量，暫養(yǎng)3、6、12 h后姜黃素富集量按下式計算。

在無菌條件下，將4 組牡蠣肉進行勻漿并分別以體積比1∶100添加無菌水，將稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，設(shè)置陰性對照為無菌水，涂布后培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落總數(shù)。每組進行3 個平行實驗。

1.2.4牡蠣中細菌的純化培養(yǎng)和16S rRNA基因測序

為了驗證光動力殺菌方法是否在牡蠣殺菌中也具有非特異性殺菌特性，挑取對照組培養(yǎng)基中生長但光動力實驗組培養(yǎng)基中已被殺滅或數(shù)量大量減少的細菌菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基后，置于25 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取菌液在LB固體培養(yǎng)基表面進行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落后在LB肉湯液體培養(yǎng)基中擴大化培養(yǎng)，取5 mL菌液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液得菌體，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行細菌16S rRNA測序。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；顯著性檢驗采用t檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1光動力對牡蠣腸道細菌的滅活效果

由圖1可知，單純光照組與對照組菌落數(shù)沒有顯著變化；由于姜黃素本身就具有一定的殺菌活性，所以只添加光敏劑具有一定的殺菌效果，殺菌率為44.27%，與對照組相比差異極顯著；光動力實驗組中殺菌率達到98.85%，與對照組相比差異極顯著。由此，本實驗證實，光動力方法對牡蠣腸道細菌具有較好的殺菌效果。

圖1　光動力對牡蠣腸道細菌滅活效果Fig.1 Inactivation of PDT on intestinal bacteria in oysters

2.2光動力冷殺菌條件選取

圖2　不同姜黃素濃度和光能量密度對殺菌效果的影響Fig.2 Effect of different concentrations of curcumin and different light energy densities on sterilization efficiency

由圖2可知，在光能量密度為1.8 J/cm2時，低光敏劑濃度的實驗組殺菌效果不佳，2 個高光敏劑濃度的實驗組殺菌效果較好且無明顯差異（P＞0.05）；在光能量密度為3.6 J/cm2和5.4 J/cm2時，光敏劑濃度為10 μmol/L實驗組殺菌效果極好，且相比于其他2 個光敏劑組均具有明顯差異（P＜0.01），而光敏劑濃度為1.0、0.1 μmol/L時殺菌效果不佳。所以，當光敏劑濃度為10 μmol/L、光能量密度為3.6～5.4 J/cm2時，光動力方法可以有效殺滅牡蠣勻漿中細菌。為了節(jié)約能源，本課題組后續(xù)實驗中均設(shè)置光能量密度為3.6 J/cm2。

2.3光動力對新鮮半殼牡蠣中細菌的滅活效果

表1　姜黃素富集時間對新鮮半殼牡蠣中細菌的殺菌效果Table 1 Sterilization of different bioaccumulation time of curcumin on bacteria in half-shell oysters

將光敏劑按照不同富集時間進行分組，分為0、3、6、12 h共4 組。由表1可知，在3、6 h后光敏劑基本被完全富集，12 h長時間富集后光敏劑富集水平基本無變化，無顯著性差異（P＞0.05）；相比于0 h光敏劑富集組，3、6 h光敏劑富集組對牡蠣殺菌率均為90%以上，差異極顯著（P＜0.01）；然而，12 h富集組的殺菌率僅為56.31%，相比于0 h光敏劑富集組，仍具有極顯著差異（P＜0.01），推測12 h組殺菌率低的原因可能是長時間的富集過程中光敏劑降解，并伴有細菌增殖過程，確切原因有待進一步探究。

2.4光動力冷殺菌技術(shù)對牡蠣中特定細菌的抑制效果

在探究光動力方法對牡蠣中細菌滅活效果實驗中，通過觀察各組培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)各個實驗組培養(yǎng)基中圓形菌落相比對照組數(shù)量減少，而一些黃色菌落、橙色菌落均完全消失。因此挑取這些具有明顯形態(tài)差異的菌落進行純化培養(yǎng)，擴增細菌16S rRNA基因后進行測序，以鑒別這些菌落種屬，驗證光動力殺菌在牡蠣殺菌中是否具有非特異性。將測序結(jié)果與GenBank中序列進行比對，得到菌落在國家國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的基因序號，其結(jié)果見表2。經(jīng)過多次實驗觀察發(fā)現(xiàn)，嗜冷桿菌滅活效果較好但是仍有菌落檢出；迪茨氏菌、枯草芽孢桿菌未檢出。這3 類菌落既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽性菌，其中嗜冷桿菌并不屬于致病菌，并且本課題組也已驗證光動力方法對牡蠣中的大腸桿菌和副溶血性弧菌也具有較好的殺滅效果，這都說明光動力方法可以廣泛地殺滅牡蠣體內(nèi)細菌，具有很好的應(yīng)用價值。

表2　光動力冷殺菌技術(shù)對牡蠣中特定細菌抑制效果Table 2 Photodynamic sterilization of particular bacteria in oysters

3　討 論

目前，常用于牡蠣保藏的熱力學(xué)殺菌方法、凍藏方法，對牡蠣風(fēng)味及解凍后品質(zhì)影響較大，市場亟需尋找能最大限度地保留牡蠣色、香、味及營養(yǎng)成分的新型保鮮冷殺菌方法?，F(xiàn)已應(yīng)用于牡蠣保鮮殺菌的冷殺菌技術(shù)存在諸多問題：涂膜保鮮技術(shù)殺菌效果不佳；保鮮劑結(jié)合微凍保鮮等方法易引起牡蠣汁液流失；凍藏保鮮可延長保質(zhì)期，但是容易造成牡蠣組織結(jié)構(gòu)的破壞、脂肪氧化、色澤變化，解凍后營養(yǎng)流失嚴重；氣調(diào)保鮮效果不佳，基本無殺菌效果；臭氧保鮮殺菌技術(shù)中臭氧的制備和存儲復(fù)雜，生產(chǎn)成本高；超高壓處理保鮮對牡蠣的品質(zhì)影響很小，能保持牡蠣原有的味道，但是設(shè)備昂貴、生產(chǎn)成本高[24]。

光動力療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于皮膚病等疾病的治療，也已被證明可以抑制癌細胞生長，對細胞、細菌等都有較好的滅活或抑制效果，但暫無應(yīng)用于水產(chǎn)品加工的報道[25-28]。本研究成功地將光動力方法用于牡蠣中細菌的滅活，取得了較好的效果，證實了以姜黃素為光敏劑介導(dǎo)的光動力冷殺菌方法可以有效滅活牡蠣腸道及牡蠣體內(nèi)的細菌，其殺菌率達到90%以上，其中嗜冷桿菌、速生嗜冷桿菌被部分滅活，迪茨氏菌、枯草芽孢桿菌被完全滅活。光動力殺菌方法屬于冷殺菌，整個過程操作簡單，極好地保持了牡蠣的感官品質(zhì)，可以滿足消費者生食牡蠣的需求，具有很高的推廣應(yīng)用價值。

光動力冷殺菌方法相比于目前已有的各類牡蠣殺菌方法，具有低成本、安全、簡便、無毒無害、非特異性殺菌等一系列優(yōu)點，并且經(jīng)過7 名專業(yè)感官評定小組成員評定后（實驗結(jié)果略），處理后牡蠣的感官品質(zhì)得到了很好的保持。光動力殺菌處理有效地殺滅了牡蠣中細菌，且經(jīng)處理的牡蠣能在外觀和口感上保持原有品質(zhì)，十分契合消費者對牡蠣生食的飲食需求，是一種很好的牡蠣冷殺菌方法。

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Inactivation Effect of Curcumin-Mediated Photodynamic Non-Thermal Sterilization on Bacteria in Oysters

CAO Binbin1,WU Juan1,XU Chuanshan2,LEUNG Albert Wing nang2,LI Zhaojie1,WANG Yuming1,XUE Yong1,XUE Changhu1,TANG Qingjuan1,*
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.School of Chinese Medicine,The Chinese University of Hong Kong,Hong Kong 999077,China)

Abstract:This study aims to explore whether photodynamic therapy(PDT)can inactivate bacteria in oysters.The results showed that photodynamic inactivation technology using curcumin as the photosensitizer had very good inactivation effect on bacteria in oysters.This technology has the characteristics of high sterilization efficiency(exceeding 90%),broad antibacterial spectrum,and easy operation.This study suggests that photodynamic non-thermal sterilization technology has the potential to be applied in the oyster processing industry in the future.

Key words:photodynamic method; non-thermal sterilization; oyster; curcumin; total plate count

中圖分類號：TS254.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0046-04

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009 10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：唐慶娟（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn

作者簡介：曹斌斌（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：cbbhaida@163.com

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF115030）；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項

收稿日期：2015-04-08