青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

郭 錳， 魏艷霞， 任佳偉， 萬里新*

（1.南陽市中心醫(yī)院河南473009；2.華北電力大學(xué)醫(yī)院北京102206）

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青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

郭 錳1， 魏艷霞1， 任佳偉2， 萬里新1*

（1.南陽市中心醫(yī)院河南473009；2.華北電力大學(xué)醫(yī)院北京102206）

摘要:目的 探討青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法 采用青蒿素（50 μmo1/L）、順鉑（10 mg/L）單藥或聯(lián)合處理SGC-7901細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將SGC-7901細(xì)胞分為4組:對照組、青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組，對照組僅加入培養(yǎng)基；采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測各組SGC-7901細(xì)胞經(jīng)處理24、48、72、96 h的增殖情況并計(jì)算增殖抑制率，采用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組處理24、48 h的凋亡率，免疫印跡法檢測各組處理48 h后的EMT相關(guān)標(biāo)記分子（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin），采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測各組處理24、48、72及96 h的細(xì)胞上清液中纖連蛋白（FN）水平。結(jié)果 與對照組相比，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組均可呈時(shí)間依賴方式提高增殖抑制率，青蒿素+順鉑組在24、48、72和96 h后的增殖抑制率均高于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）；3組處理后的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平均高于對照組，而N-cadherin、Vimentin水平及上清液FN水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與青蒿素組和順鉑組相比，青蒿素+順鉑組的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平較高，N-cadherin和Vimentin水平及上清液FN水平較低，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 青蒿素和順鉑對胃癌SGC-7901細(xì)胞均有細(xì)胞毒性，如抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制EMT；同時(shí)，青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞具有協(xié)同增效的作用。

關(guān)鍵詞:青蒿素；順鉑；胃癌；增殖；凋亡；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.044

胃癌是目前困擾全球的惡性腫瘤，作為最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率位居惡性腫瘤第2位；而我國作為胃癌高發(fā)國家之一，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，防治形勢嚴(yán)峻［1］。順鉑是治療惡性腫瘤的常用化療藥物，其可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，但化療耐藥在臨床上較為常見［2］。青蒿素是一種從中藥青蒿中分離出來的活性成分，臨床上用于瘧疾的治療，近年來研究發(fā)現(xiàn)該藥還具有較強(qiáng)的抗癌活性［3-5］。故推測青蒿素對胃癌也有較好的作用，因此，本研究探討青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證其對胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ePithe1ia1mesenchyma1 transition，EMT）的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 藥物和試劑 青蒿素、MTT及十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國Sigma-A1drich公司；順鉑購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；PMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及雙抗（青霉素、鏈霉素）均購自美國Hyc1one公司；Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；胎牛血清來自杭州四季青生物工程公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN及GAPDH抗體購自美國Ce11Siga1ing Techno1ogy公司。

1.3 儀器 BX51型倒置顯微鏡（日本O1ymPus公司）；ZS-2型全自動酶標(biāo)儀（中國科學(xué)院生物物理研究所）；FACSCa1ibur型式細(xì)胞儀（美國BD公司）；BG-sub MIDI型多用途水平電泳儀，（美國Baygene公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)條件培養(yǎng)，具體為10％胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素，37℃、5％ CO2飽和濕度，每隔2～3 d換液，待其達(dá)80％～85％融合時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后制備單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/孔接種96孔培養(yǎng)板，待其穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行50 μmo1/L青蒿素、10 mg/L順鉑單用或聯(lián)合處理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將SGC-7901細(xì)胞分為4組:對照組、青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組，對照組僅加入培養(yǎng)基，不給予任何藥物處理；在常規(guī)條件下依次培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mLMTT溶液，孵育4 h后在全自動酶標(biāo)儀上以492 nm波長讀取吸光值A(chǔ)，根據(jù)公式計(jì)算增殖抑制率（％）=1-A給藥組/A對照組×100％。各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 流式細(xì)胞術(shù) 將SGC-7901細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種培養(yǎng)板中，根據(jù)以上分組實(shí)施相應(yīng)處理，于處理24、48 h后收集各組細(xì)胞，依次經(jīng)PBS沖洗、冷乙醇固定及核糖核酸酶（RNase）處理后，根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，加入Annexin V/FITC和PI進(jìn)行染色，避光染色15 min后上機(jī)，采用流式細(xì)胞儀測定凋亡率。

2.4 免疫印跡 收集處理48 h后的各組細(xì)胞，冰上加入細(xì)胞裂解液，裂解后高速離心（10 000 r/min，30 min），收集上清液后采用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度，取等量蛋白行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜處理后，根據(jù)膜面積依次加入適量E-cadherin、N-cadherin、Vimentin（除E-cadherin為1∶200外，其余均為1∶100），4℃孵育過夜，加入二抗（1∶3 000）室溫下?lián)u蕩孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影后，IPP 6.0軟件分析條帶光密度，最終結(jié)果表示為各條帶光密度與內(nèi)參GADPH的比值。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法 收集各組處理24、48、72和96 h后的細(xì)胞上清液，采用針對FN的檢測試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組不同處理時(shí)間的上清液FN水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組均可呈時(shí)間依賴方式提高增殖抑制率（P＜0.05）；其中青蒿素+順鉑組在24、48、72和96 h后的增殖抑制率均高于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）。見表1。

表1　青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7 9 0 1細(xì)胞增殖抑制率的影響

3.2 青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余三組處理24 h、48 h后的早晚期凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理24 h、48 h后的早晚期凋亡率均高于青蒿素組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組處理2 4、4 8 h后細(xì)胞凋亡情況分析（％）

3.3 青蒿素聯(lián)合順鉑對EMT相關(guān)標(biāo)記分子的影響 采用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余三組處理48 h后的E-cadherin水平升高，N-cadherin和Vimentin水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理后的E-cadherin水平高于青蒿素組和順鉑組，而N-cadherin和 Vimentin水平均低于青蒿素組和順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；順鉑組的Vimentin水平低于青蒿素組（P＜0.05），E-cadherin和N-cadherin水平與青蒿素組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組處理4 8 h后EMT相關(guān)標(biāo)記分子的表達(dá)情況

3.4 青蒿素聯(lián)合順鉑對細(xì)胞上清液FN水平的影響 采用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在24～96 h的時(shí)間范圍內(nèi)，其余三組的FN水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理后的FN水平均低于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）；除48 h外，順鉑組處理后的FN水平均低于青蒿素組（P＜0.05）；隨著處理作用時(shí)間的增加，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組的FN水平均降低（P＜0.05），呈時(shí)間依賴方式。見表4。

表4　各組處理不同時(shí)間后細(xì)胞上清液FN水平變化（n g/m L）

4 討論

胃癌是一種惡性消化道腫瘤，由于其發(fā)病隱匿且缺乏有效篩查手段，目前大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，無法進(jìn)行手術(shù)，故化療成為主要的治療手段。但較強(qiáng)毒副作用及耐藥是影響化療效果的主要因素，而開發(fā)抗癌效果強(qiáng)且毒副反應(yīng)較輕的藥物是腫瘤臨床工作者的當(dāng)務(wù)之急［6］。青蒿素是世界范圍內(nèi)用于治療惡性瘧疾的臨床用藥，由于其具有副作用少，在臨床上使用較為廣泛。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物具有較強(qiáng)的抗癌效果，如抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管和淋巴結(jié)生成［7-8］。王燕等［3］發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物對結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS174T有細(xì)胞毒作用，可呈濃度和時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖。Tan等［4］發(fā)現(xiàn)青蒿素可通過激活蛋白激酶信號來抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖。故綜合以上證據(jù)，本研究推測青蒿素對胃癌有細(xì)胞毒性，同時(shí)可增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。

本研究采用常用胃癌細(xì)胞株SGC-7901來探討青蒿素聯(lián)合順鉑的抗癌效果，發(fā)現(xiàn)青蒿素可增強(qiáng)順鉑對胃癌SGC-7901的細(xì)胞毒性，如呈時(shí)間依賴方式抑制細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為細(xì)胞的增值抑制率升高，這與其他癌腫的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果一致，如結(jié)腸腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及宮頸癌［3-5］。以上提示青蒿素具有較廣泛的抗癌效果，但也有研究表明青蒿素對不同種類癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性存在差異，如小鼠肥大細(xì)胞瘤（P815）對該藥的敏感性強(qiáng)于地鼠腎細(xì)胞腺癌（BSR）［9］，表明青蒿素的細(xì)胞毒作用與癌細(xì)胞有關(guān)。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其類似物二氫青蒿素同樣具有較強(qiáng)的抗癌效果，如王愛軍等［10］發(fā)現(xiàn)該藥物可抑制胃癌細(xì)胞增殖、粘附及侵襲等過程，而王紅鈺等［11］發(fā)現(xiàn)該藥物同樣可抑制胃癌的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可增強(qiáng)順鉑對胃癌的細(xì)胞毒性，提示兩者在抗腫瘤上具有協(xié)同作用，而Suberu等［12］在乳腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了相同結(jié)論，如其發(fā)現(xiàn)青蒿素聯(lián)合順鉑處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞的效果強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用。以上表明青蒿素類藥物對胃癌細(xì)胞有確切的細(xì)胞毒作用，由于該藥物本身已用于臨床，故在抗癌藥物的開發(fā)及應(yīng)用上有較為廣闊的前景。

除抑制增殖外，本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素還可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，如其處理后的早、晚期凋亡率均升高，其中在處理48 h后的早、晚期凋亡率均高于順鉑組，表明青蒿素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的能力要強(qiáng)于順鉑，此結(jié)果與陳衛(wèi)強(qiáng)［13］等人的研究結(jié)果相符；同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可增強(qiáng)順鉑對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。順鉑為細(xì)胞周期非特異性藥物，可通過抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程來誘導(dǎo)其凋亡，而對于青蒿素的作用機(jī)制目前尚無定論，有研究發(fā)現(xiàn)其可通過活性氧依賴途徑來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［14］。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類似物可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或線粒體依賴性途徑來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［15-16］。筆者將在下一步研究中探討青蒿素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)胃癌凋亡的機(jī)制。

EMT是癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，作為生理病理現(xiàn)象，以上皮細(xì)胞特性喪失及間質(zhì)細(xì)胞特性獲得為重要特征。EMT過程中介導(dǎo)上皮細(xì)胞間緊密連接的胞膜蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞間的連接蛋白如N-cadherin表達(dá)上調(diào)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素、順鉑單用或聯(lián)合使用均可升高上皮標(biāo)記分子E-cadherin水平，同時(shí)降低間質(zhì)標(biāo)記分子N-cadherin和Vimentin水平，以上結(jié)果表明青蒿素和順鉑均可抑制胃癌細(xì)胞的EMT過程。本研究采用ELISA法觀察另一間質(zhì)標(biāo)記分子FN的水平動態(tài)變化，同樣發(fā)現(xiàn)青蒿素、順鉑單用或聯(lián)用均可降低其水平，進(jìn)一步表明兩藥物均可抑制EMT過程?？傮w上兩者聯(lián)用效果強(qiáng)于單獨(dú)使用，表明青蒿素可增強(qiáng)順鉑對EMT過程的抑制作用。

綜上所述，青蒿素和順鉑對胃癌SGC-7901細(xì)胞均有細(xì)胞毒性，如抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制EMT，同時(shí)，青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞具有協(xié)同增效的作用。

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*通信作者:萬里新（1967—），女，碩士，主任醫(yī)師，從事腫瘤生物治療方面的研究。Te1:（0377）63200007，E-mai1: nanyang1967 @163.com

作者簡介:郭 錳（1981—），男，碩士，副主任醫(yī)師，從事腫瘤臨床與用藥方面的研究。Te1: 13838708698，E-mai1: 2558692910@ qq.com

收稿日期:2015-03-28

中圖分類號:R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0431-04