小鼠原發(fā)性膽汁性肝硬化與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的相關(guān)性

潘　盈，劉　斌，張奉春

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100730)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種慢性進(jìn)展性疾病，主要表現(xiàn)為以肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性、非化膿性炎癥為特征的慢性膽汁淤積，肝內(nèi)膽管受損，膽汁分泌減少，肝內(nèi)毒物蓄積，肝細(xì)胞受損害，進(jìn)一步可發(fā)展至肝纖維化與肝硬化甚至肝功能衰竭。目前病因不明，90%～95%的患者血清中出現(xiàn)抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)，同時(shí)受損膽管T淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，提示自身免疫在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用。近年來研究表明，調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)及其重要的調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)與自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。本研究通過建立聚肌胞苷酸誘導(dǎo)產(chǎn)生PBC小鼠模型，通過酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫組化及免疫印跡法測(cè)定PBC小鼠模型中Treg細(xì)胞及其相關(guān)蛋白表達(dá)、TGF-β1含量，探索Treg細(xì)胞及TGF-β1與PBC發(fā)病的關(guān)系。

對(duì)象與方法

對(duì)象

6～8周雌性C57BL/6J小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究所，室溫22 ℃，55%濕度，12 h晝/夜交替條件下，給以充足的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)飼料和水飼養(yǎng)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室操作指南，所有動(dòng)物均受到良好待遇，本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)通過。聚肌胞苷酸(poly I∶C)購(gòu)自Invivogen公司(San Diego，USA)。溶于無菌生理鹽水中，濃度為1 mg/ml，-20 ℃冰箱保存。雌性C57BL/6J小鼠poly I∶C 5 mg/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)24周。對(duì)照組雌性C57BL/6小鼠依據(jù)poly I∶C注射實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予生理鹽水腹腔注射。Poly I∶C或生理鹽水給藥后，不同時(shí)間(第8、16、24周)頸脫位法處死C57BL/6J小鼠(處理前禁食1 d)。采集小鼠血清、肝臟和脾臟，肝臟10%甲醛固定或快速冷凍進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，脾臟用于淋巴細(xì)胞提取分離。小鼠血清及肝臟組織標(biāo)本儲(chǔ)存-80 ℃冰箱備用。

測(cè)定TGF-β1：對(duì)存放于-80 ℃冰箱的第8、16、24周正常小鼠及PBC小鼠的冰凍血清(每組各有6個(gè)樣本)分別采用ELISA法測(cè)定TGF-β1含量(OD值)，比較各組小鼠OD值。

檢測(cè)指標(biāo)

PBC小鼠模型需通過生化方法檢測(cè)肝臟生化指標(biāo)，包括天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽紅素(total bilirubin，TB)，并通過間接免疫熒光及ELISA法檢測(cè)抗線粒體抗體/抗線粒體M2亞型抗體(antimitochondrial antibodies/antimitochondrial M2 antibodies，AMA/M2)，并對(duì)肝臟組織行常規(guī)病理染色。

PBC小鼠模型血清、肝臟組織進(jìn)行常規(guī)病理檢測(cè)，并分別對(duì)CD4、CD8、CK7進(jìn)行免疫組化染色。對(duì)第8、16、24周正常小鼠及PBC小鼠血清采用ELISA法測(cè)定TGF-β1含量，制備肝臟組織勻漿免疫組化法及免疫印跡法測(cè)定FOXP3表達(dá)。

FOXP3表達(dá)測(cè)定：(1)免疫組化法：選取常溫放置的第8、16、24周正常小鼠和第8、16、24周PBC小鼠的石蠟包埋的肝臟標(biāo)本，每組選取2～3只小鼠，將石蠟包埋的組織標(biāo)本切片，主要觀察匯管區(qū)、淋巴細(xì)胞和著色的FOXP3+細(xì)胞。第8、16、24周正常小鼠肝臟石蠟切片未見陽性細(xì)胞，第8、16、24周PBC小鼠肝臟石蠟切片可見少量陽性細(xì)胞。選取10個(gè)匯管區(qū)，在400倍鏡下對(duì)淋巴細(xì)胞及陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖1)。(2)免疫印跡法：選取存放于-80 ℃冰箱的8、16、24周正常小鼠和8、16、24周PBC小鼠的凍存肝臟標(biāo)本，每組選取1只小鼠，采用免疫印跡法檢測(cè)FOXP3表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

PBC小鼠模型鑒定

肝臟生化指標(biāo)：第8、16、24周PBC小鼠AST均高于正常對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第16周PBC小鼠ALT高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第16、24周PBC小鼠ALP及TB均高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)PBC小鼠與同期正常對(duì)照組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

AMA/M2：間接免疫熒光及ELISA法檢測(cè)對(duì)照組小鼠均為陰性，間接免疫熒光檢測(cè)PBC小鼠，第8周時(shí)50%小鼠AMA/M2陽性，第16周時(shí)66.7%小鼠AMA/M2陽性，第24周時(shí)100%小鼠AMA/M2陽性。ELISA檢測(cè)PBC小鼠血清，第8周時(shí)50%小鼠AMA/M2陽性，第16周時(shí)83.3%小鼠AMA/M2陽性，第24周時(shí)100%小鼠AMA/M2陽性。

肝臟病理：對(duì)照組小鼠肝臟組織無明顯異常(圖1A～C)。PBC模型小鼠第8周可見小膽管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分切片可見單核細(xì)胞，膽管上皮細(xì)胞變性壞死，基底膜不完整(圖1D)，第16周可見匯管區(qū)擴(kuò)大，肝細(xì)胞腫脹明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)切片可見小葉間膽管增生(圖1E)，第24周可見肝臟細(xì)胞壞死增多，周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管增生明顯，沒有觀察到明顯的纖維間隔形成(圖1F)。根據(jù)PBC患者的分期，PBC小鼠模型主要分期在1期和2期。

分組時(shí)間AST(IU∕L)ALT(IU∕L)ALP(IU∕L)TB(mg∕dl)正常組8周198.0±27.327.3±5.995.7±6.51.2±0.316周115.3±19.821.8±5.983.7±10.80.7±0.224周147.5±25.930.3±11.574.8±8.51.0±0.2PBC組8周307.8±37.9*30.3±11.583.3±9.41.0±0.116周246.0±35.2*105.5±23.0*118.2±15.2*2.3±0.3*24周223.8±11.5*25.8±2.4138.2±15.3*2.8±0.4*

與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05

TGF-β1含量

第16周PBC小鼠與24周PBC小鼠之間TGF-β1含量存在顯著差異(P=0.041)，其余各組小鼠之間均無顯著差異(表2、3)。

表2　各組小鼠TGF-β1含量(OD值)Table 2　Content of TGF-β1 in each group of mice (OD value)

表3　各組小鼠TGF-β1含量統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table 3　Statistical results of content of TGF-β1 between each group of mice

FOXP3表達(dá)

免疫組化法：各組正常小鼠匯管區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)目均很少，在0～5個(gè)之間，陽性細(xì)胞數(shù)均為0。各組PBC小鼠陽性細(xì)胞數(shù)在0～4個(gè)之間(表4)。第8、16、24周PBC小鼠及其對(duì)照小鼠的匯管區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)存在顯著差異(P=0.004，0.000，0.000);另外，第16、24周PBC小鼠之間的匯管區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)存在顯著差異(P=0.006)。第16、24周PBC小鼠與同時(shí)期對(duì)照小鼠匯管區(qū)染色成陽性的細(xì)胞數(shù)存在顯著差異(P=0.032，0.032)。余各組匯管區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著差異。

表4　兩組小鼠匯管區(qū)淋巴細(xì)胞及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 4　The number of lymphocytes and FOXP3+ Treg ceclsin portal areas of each group of mice　(個(gè))

免疫印跡法：選取存放于-80 ℃冰箱的8、16、24周正常小鼠和8、16、24周PBC小鼠的凍存肝臟標(biāo)本，每組選取1只小鼠，采用免疫印跡法檢測(cè)FOXP3表達(dá)(圖2)。

每塊膠上6個(gè)條帶，從左往右依次為8、16、24周正常小鼠(圖中表示為N8、N16、N24)和8、16、24周PBC小鼠(圖中表示為P8、P16、P24)。使用的內(nèi)參鼠源β-actin相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，待測(cè)FOXP3相對(duì)分子質(zhì)量為47 000，理論上應(yīng)該在50～53 000的位置觀察到。內(nèi)參β-actin可以在圖中清晰地看到，各條帶沒有明顯差異，表明各條帶加樣量接近，但此時(shí)FOXP3并沒有在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶。

討　　論

PBC是一種特異性自身免疫慢性肝病，主要特點(diǎn)表現(xiàn)為慢性肝內(nèi)小膽管缺失，伴膽汁淤積和進(jìn)行性肝纖維化[1]。本文采用6～8周雌性C57BL/6J小鼠腹腔注射poly I∶C的方法，建立PBC小鼠模型。本動(dòng)物模型在肝臟生化、自身抗體AMA、肝臟病理改變和免疫組化等方面與人類PBC早期變化極為相似。

Papiernik等[2]證實(shí)，天然CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，然后遷移到外周發(fā)揮作用，CD4+CD25+胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg細(xì)胞一樣，表現(xiàn)出對(duì)經(jīng)由T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的抗原刺激呈低反應(yīng)性，并且顯示抑制其他細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+Treg細(xì)胞除了在胸腺產(chǎn)生以外，還可以在未成熟的樹突狀細(xì)胞中經(jīng)IL-10、IFN-α、TGF-β或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，該類細(xì)胞被稱為誘導(dǎo)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞[3]。誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞的抑制功能主要通過產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β得以實(shí)現(xiàn)。FOXP3為Treg細(xì)胞內(nèi)特異標(biāo)記物。FOXP3也是CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育及獲得功能的重要轉(zhuǎn)錄因子。近年來研究表明，Treg及其重要的調(diào)節(jié)因子TGF-β1與自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。FOXP3轉(zhuǎn)錄因子突變的Scury小鼠模型出現(xiàn)了AMA抗體、肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管損傷等類似PBC的改變，小鼠模型血清中TNF-α、INF-γ、IL- 6、IL-12、IL-23及肝臟組織中編碼上述細(xì)胞因子的mRNA均增高[4]。說明CD4+CD25+Treg細(xì)胞在PBC發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。

天然Treg發(fā)揮功能需要TGF-β信號(hào)。TGF-β是一類分泌型同源二聚體蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、移行、調(diào)亡等過程。在適當(dāng)刺激下，天然Treg細(xì)胞可分泌TGF-β，而且在細(xì)胞膜表面高表達(dá)TGF-β1[5]。Treg活化后其高表達(dá)的膜型TGF-β才是介導(dǎo)抑制功能的主要分子，可能與效應(yīng)細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合發(fā)揮功能[6]。分泌型TGF-β可能主要促進(jìn)Treg的擴(kuò)增[7]，對(duì)Treg的功能影響不大。另外，CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過自分泌和(或)旁分泌受體-配體作用機(jī)制，分泌的TGF-β與其自身細(xì)胞表面的TβRⅡ結(jié)合，從而在正常情況下處于失能狀態(tài)，T細(xì)胞受體刺激也不能誘導(dǎo)其IL-2表達(dá)，但可引起效應(yīng)T細(xì)胞表面TβRⅡ上調(diào)。因此CD4+CD25+Treg細(xì)胞分泌的TGF-β可與活化的效應(yīng)T細(xì)胞結(jié)合，從而傳遞細(xì)胞接觸-依賴性抑制信號(hào)[8]。

根據(jù)肝臟病理觀察，PBC小鼠模型主要分期在1期和2期。第8、16、24周PBC小鼠膽管周圍均有明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。而24周PBC小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)比16周明顯減少，同時(shí)ELISA測(cè)得24周PBC小鼠TGF-β1含量顯著高于16周PBC小鼠，結(jié)果相吻合。在肝臟纖維化中，TGF-β起重要作用，目前認(rèn)為導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增加的最主要細(xì)胞族是肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)，HSC通過旁分泌、自分泌途徑增加TGF-β生成，TGF-β又參與HSC活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生成增多，降解減少，發(fā)生肝纖維化[9]。提示從這一時(shí)段開始，PBC小鼠模型從以炎癥為主向以纖維化為主轉(zhuǎn)變。

本實(shí)驗(yàn)采用FOXP3作為Treg的標(biāo)記物，陽性細(xì)胞的數(shù)目反映了Treg細(xì)胞的數(shù)目。PBC小鼠肝臟中出現(xiàn)Treg細(xì)胞，且16周和24周PBC小鼠與正常對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后期肝臟Treg細(xì)胞數(shù)目多于正常，推測(cè)與炎性部位Treg細(xì)胞的免疫抑制功能有關(guān)。同時(shí)期外周TGF-β1增多，TGF-β1可能對(duì)Treg細(xì)胞的增生起促進(jìn)作用。

同組實(shí)驗(yàn)人員曾使用流式細(xì)胞儀對(duì)各組小鼠新鮮肝臟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，PBC小鼠模型肝臟中CD4+CD25+FOXP3+T淋巴細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯升高，顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)目低于正常人[10]。在自身免疫性疾病中，顯示自身免疫性疾病受累器官或靶器官中FOXP3+Treg細(xì)胞比例增加[11]。推測(cè)PBC患者Treg細(xì)胞分布可能因Treg細(xì)胞從外周血聚集或遷移至炎性部位所致。

同組實(shí)驗(yàn)人員在小鼠模型肝臟檢測(cè)TGF-β1含量，發(fā)現(xiàn)8、16、24周PBC小鼠模型組均高于同時(shí)期正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。TGF-β對(duì)Treg細(xì)胞功能的發(fā)揮有重要作用，并且Treg本身可以分泌TGF-β，二者存在復(fù)雜的相互作用。

目前，對(duì)于血清TGF-β來源的研究不是很清楚。有報(bào)道顯示，用ELISA方法檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)高于正常人。但在某些自身免疫性疾病中，TGF-β1水平并不增高[12]。本實(shí)驗(yàn)ELISA法測(cè)得各組PBC小鼠模型血清TGF-β1與正常組差異無顯著意義。

免疫印跡法在各組中均沒有測(cè)出FOXP3，因流式細(xì)胞儀可測(cè)得肝臟中存在Treg細(xì)胞，分析主要原因可能為肝臟組織中含有Treg細(xì)胞數(shù)目太少。如果使用RT-PCR法，有可能測(cè)出其含量。

(本文圖1、2見插頁Ⅱ)

[1]Hirschfield GM，Gershwin ME.The immunobiology and pathophysiology of primary biliary cirrhosis[J].Annu Rev Pathol，2013，8：303-330.

[2]Papiernik M，de Moraes ML，Pontoux C，et al.Regulatory CD4 T cells：expression of IL-2R alpha chain，resistance to clonal deletion and IL-2 dependency[J].Int Immunol，1998，10：371-378.

[3]Sakaguchi S.The origin of FOXP3-expressing CD4+regulatory T cells：thymus or periphery[J].J Clin Invest，2003，112：1310-1312.

[4]Zhang W，Sharma R，Ju S，et al.Deficiency in regulatory T cells results in development of antimitochondrial antibodies and autoimmune cholangitis[J].Hepatology，2009，49：545-552.

[5]Nakamura K，Kitani A，Strober W.Cell contact-dependent immunosuppression by CD4+CD25+regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor-β1[J].J Exp Med，2001，194：629- 644.

[6]Annunziato F，Cosmi L，Liotta F，et al.Phenotype，localization，and mechanism of suppression of CD4+CD25+human thymocytes[J].J Exp Med，2002，196：379-387.

[7]Ghiringhelli F，Punig PE，Roux S，et al.Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-β-secreting cells inducing CD4+CD25+regulatory T cell proliferation[J].J Exp Med，2005，202：919-929.

[8]Viglietta V，Baecher-Allan C，Weiner HL，et al.Loss of functional suppression by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with multiple sclerosis[J].J Exp Med，2004，199：971-979.

[9]Ramadori G，Armbrust T.Cytokines in the liver[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2001，13：777-784.

[10] Liu B，Shi XH，Zhang FC，et al.Antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis：a subset of primary biliary cirrhosis[J].Liver Int，2008，28：233-239.

[11] Sasaki M，Ikeda H，Sawada S，et al.Naturally-occurring regulatory T cells are increased in inflamed portal tracts with cholangiopathy in primary biliary cirrhosis[J].J Clin Pathol，2007，60：1102-1107.

[12] Eksioglu-Demiralp E，Direskeneli H，Akoglu T.Levels of serum Transforming growth factor beta1 do not increase in Behcet’ disease，in contrast to Rheumatoid arthritis[J].J Rheum，1999，26：1010-1011.