PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)快速鑒定BALF中分枝桿菌菌種的應(yīng)用研究

辛茶香，熊國亮，袁小蘭，張周云，彭亦平

（江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌330006）

PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)快速鑒定BALF中分枝桿菌菌種的應(yīng)用研究

辛茶香，熊國亮，袁小蘭，張周云，彭亦平

（江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌330006）

目的 探討PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù) （PCR-RDBHA）快速鑒定支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid BALF）標(biāo)本中分枝桿菌菌種的臨床應(yīng)用價值。方法對臨床306例活動性肺結(jié)核患者、疑似非結(jié)核分枝桿菌感染肺病患者BALF標(biāo)本采用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)和傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。結(jié)果306例BALF標(biāo)本PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測出分枝桿菌127例，陽性率為41.5%（127/306），其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）108例，占分枝桿菌的85. 0%（108/127），非結(jié)核分枝桿菌（NTM）19例，占分枝桿菌的15.0%（19/127）。NTM中，6例膿腫分枝桿菌，10例胞內(nèi)分枝桿菌，2例戈登分枝桿菌，1例瘰疬分枝桿菌；傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法檢測出分枝桿菌101例，陽性率33.0%（101/306），經(jīng)菌種的初步鑒定，其中MTC89例，占分枝桿菌的88.1%（89/101），NTM12例，占分枝桿的11.9%（12/101）。結(jié)論P(yáng)CR反向點(diǎn)雜交技術(shù)能夠快速鑒定BALF中分枝桿菌菌種，該方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

分枝桿菌；菌種鑒定；聚合酶鏈反應(yīng)；反向點(diǎn)雜交

分枝桿菌屬包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tubetculosis comples，MTC）和非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）。近年來，由于HIV傳播的日益猖獗，作為機(jī)會性感染之一，非結(jié)核分枝桿菌感染率不斷在上升［1］。由于其對不同抗菌藥物敏感性不同，這兩類分枝桿菌感染后的治療方案存在很大差別，因此二者的鑒別具有重要的臨床意義［2］。目前，常規(guī)的分枝桿菌菌種鑒定需采用分枝桿菌培養(yǎng)分離株在進(jìn)行抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)時，將菌種接種于含對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸酰肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基上，并輔以硝酸還原試驗(yàn)、煙酸試驗(yàn)和耐68℃熱觸酶試驗(yàn)，初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或NTM。該方法耗時較長，操作繁瑣，污染大，缺乏可重復(fù)性，難以滿足臨床診斷和治療的需要［3，4］。本研究以分枝桿菌rpoB基因?yàn)榘谢蛐蛄?，?yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)反向點(diǎn)雜交技術(shù)快速鑒定患者BALF中分枝桿菌菌種，結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源 306例肺結(jié)核或疑似肺部NTM感染者均是2014年8月至2015年12月在江西省胸科醫(yī)院住院的患者，其中男205例、女101例；年齡22～80歲，平均年齡47.3歲。所有患者均符合結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，或非結(jié)核分枝桿菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。支氣管肺泡灌洗液（BALF）的留?。河膳R床醫(yī)師通過3300型電子纖維支氣管鏡，向肺內(nèi)灌入無菌生理鹽水，反復(fù)多次回收灌洗液約20～30ml，分兩管送檢。

1.2儀器和試劑DA7600 DNA擴(kuò)增儀由中山達(dá)安公司提供；YN-H16恒溫雜交儀和PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；改良羅氏培養(yǎng)基和PNB、TCH鑒別培養(yǎng)基由江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科自配。

1.3方法

1.3.1PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)⑴支氣管肺泡灌洗液的處理，若灌洗液中含有痰或血（不含痰或血的肺泡灌洗液直接離心），則需加入一定量的4%氫氧化鈉進(jìn)行液化20min，經(jīng)4000r/min離心20min，棄上清液，取離心后的灌洗液1.2ml到1.5ml的離心管中，12000r/min，離心5min，棄上清液，向沉淀液中加入1ml洗液，充分混勻，12000r/min，離心5min，棄上清液（含血標(biāo)本應(yīng)增加一次洗滌）。向沉淀中加入50μl裂解液，充分混勻，沸水浴10min，12000r/min，離心2min，留上清液備PCR擴(kuò)增用。⑵PCR擴(kuò)增引物：以分枝桿菌rpoB基因?yàn)榘谢蛐蛄性O(shè)計擴(kuò)增引物，上游引物5'-GAAGGTGGGAT CGGCGA-3'，下游引物5'-CCATGCGCCCTTAAA CACT-3'；擴(kuò)增382bpDNA片段。⑶PCR擴(kuò)增條件：①50℃，2min→95℃，10min；②95℃，45s→←64℃，60s，20cycles；③95℃，30s→←56℃，30s→←68℃，45s，30cycles；④68℃，5min。⑷PCR模板加樣、擴(kuò)增、雜交、洗膜和顯色嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行操作。⑸結(jié)果觀察：陽性質(zhì)控品正常顯色，膜條上每個位點(diǎn)對應(yīng)一種分枝桿菌，當(dāng)該點(diǎn)有信號說明為相應(yīng)的分枝桿菌。

1.3.2傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法菌種初步鑒定⑴取另外一管液化和離心好的肺泡灌洗液400μl接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基的斜面上，注意覆蓋整個斜面，每份標(biāo)本接種二管培養(yǎng)基。于37℃培養(yǎng)，每周觀察一次生長情況，若長出可見的典型菌落者為分枝桿菌生長陽性，可疑菌落用抗酸染色進(jìn)行鑒定是否為分枝桿菌菌落，接種8周未見菌落判為陰性結(jié)果。⑵取酸性羅氏培養(yǎng)基上的生長菌落，于吐溫生理鹽水中磨成菌液，分別接種到含對硝基苯甲酸（PNB）和含噻吩-2-羧酸肼（TCH）的中性羅氏培養(yǎng)基上，同時接種一管沒有加藥的中性羅氏培養(yǎng)基作對照管，于37℃培養(yǎng)4周觀察生長情況。⑶結(jié)果判斷：在對照管中有分枝桿菌生長情況下，若PNB和TCH培養(yǎng)基上都不生長則為牛分枝桿菌；若PNB管不生長、TCH管生長則為結(jié)核分枝桿菌；若PNB和TCH管都生長則為非結(jié)核分枝桿菌。經(jīng)上述試驗(yàn)可以將分枝桿菌初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌群和非結(jié)核分枝桿菌（NTM）［7］。

1.3.3PCR-DNA測序 ⑴對部分PCR反向點(diǎn)雜交鑒定為NTM的BALFDNA裂解產(chǎn)物再次進(jìn)行PCR-DNA測序擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。⑵測序引物及擴(kuò)增片段：根據(jù)分枝桿菌16S-23SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計引物。上游引物5'-GAAGTCGTAACAAGG TAGCCG-3'；下游引物5'-GATGCTCGCAACCAC TATCTA-3'，分別位于上游16SrDNA的末端和16S-23SrDNAITS序列保守區(qū)。擴(kuò)增出目的片段，結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增產(chǎn)生265bp片段，NTM產(chǎn)生約260～350bp不等的片段。⑶序列分析，測序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件拼接后，分別在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比較分析，以鑒定菌種。

2　結(jié)果

2.1306例肺泡灌洗液標(biāo)本PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)結(jié)果檢測出分枝桿菌127例，陽性率為41.5% （127/306），其中結(jié)核分枝桿菌群108例，占85.0% （108/127）；非結(jié)核分枝桿菌19例，占15.0%（19/ 127）。NTM中，6例膿腫分枝桿菌，10例胞內(nèi)分枝桿菌，2例戈登分枝桿菌，1例瘰疬分枝桿菌。

2.2傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法菌種初步鑒定結(jié)果檢測出分枝桿菌101例，陽性率33.0%（101/306），其中結(jié)核分枝桿菌群89例，占88.1%（89/101），非結(jié)核分枝桿菌12例，占11.9%（12/101）。但沒能將12例NTM鑒定到種。

2.3306例肺泡灌洗液標(biāo)本在傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法結(jié)果 菌種初步鑒定出的89例結(jié)核分枝桿菌和12例非結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)平行檢測全部檢測為陽性，且全部相符。

2.4PCR-DNA測序結(jié)果取4份經(jīng)PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)鑒定為膿腫分枝桿菌（2例），胞內(nèi)分枝桿菌 （2例）的BALFDNA裂解產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測序，PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)和PCR-DNA測序兩者鑒定結(jié)果一致。

3　討論

近年來，以PCR為基礎(chǔ)的各種分子檢測技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌菌種鑒定提供了新的技術(shù)手段［8，9］。PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)是近幾年來建立的一種快速鑒定分枝桿菌菌種的新方法，該技術(shù)的原理是以分枝桿菌rpoB基因編碼序列為靶基因，設(shè)計特異的PCR引物且其5'端用生物素進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增獲得一定長度的分枝桿菌基因片段，該片段包含了所要檢測的所有分枝桿菌菌種類型。根據(jù)不同分枝桿菌之間的差異，按照堿基互補(bǔ)配對原則，設(shè)計特異性識別某種分枝桿菌序列的寡核酸探針。探針5'端用氨基標(biāo)記，通過化學(xué)鍵作用固定在硝酸纖維膜上，制成包含探針陳列的膜條。將帶有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與膜條上的探針進(jìn)行分子雜交，再通過顯色，觀察膜條特定位置顯色，從而鑒定該分枝桿菌的種類［10］。該技術(shù)可以鑒定出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、恥垢分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、海分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、土分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、戈登分枝桿菌等23種分枝桿菌。

對痰少或無痰的患者留取BALF較為合適，但是臨床醫(yī)師在留取BALF時要注意患者的耐受能力。本研究應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)直接對306例患者BALF中的分枝桿菌進(jìn)行了菌種鑒定，其中鑒定出19例NTM，占所有檢出分枝桿菌的15.0% （19/127），高于傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法鑒定的11.9%（12/101），但低于2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查的22.9%［11］。PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)比傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法檢測出的分枝桿菌例數(shù)和NTM例數(shù)要高，其原因可能是：⑴PCR擴(kuò)增的靈敏度比傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法高，PCR擴(kuò)增對死和活的分枝桿菌都可以擴(kuò)增出陽性結(jié)果，但培養(yǎng)只能培養(yǎng)活的分枝桿菌；⑵檢測技術(shù)的差別，在改良羅氏培養(yǎng)法中采用的是傳統(tǒng)PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基，某些NTM菌株在PNB培養(yǎng)基的生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為陰性［12］。

隨著艾滋病的流行NTM的發(fā)病率呈上升趨勢［13，14］，在306例患者中有部分是艾滋病并發(fā)肺部感染者，這是導(dǎo)致本研究NTM高于張曉娟報道的8.7%的原因［15］。

本研究以PCR-DNA測序?yàn)閷φ眨?例膿腫分枝桿菌、2例胞內(nèi)分枝桿菌的BALFDNA裂解產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測序與PCR-反向點(diǎn)雜交鑒定結(jié)果一致，但與標(biāo)本量相比DNA測序的例數(shù)還應(yīng)增加，來進(jìn)一步驗(yàn)證PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)的準(zhǔn)確性。

傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法鑒定菌種只能初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和NTM，且時間需要2～3個月左右，在操作研磨菌種時對工作人員具有很大的危害性。而PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)可以鑒定出23種分枝桿菌，整個檢測時間只需要6h，操作過程不存在研磨菌種，生物安全性好；但分枝桿菌屬共有250多種菌種［10］，若樣本中存在本檢測范圍23種外的NTM就不能檢出，同時該技術(shù)最小檢出菌量為105cfu/ml，這是該技術(shù)檢測的局限性。

綜上所述，PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)能夠快速鑒定BALF中分枝桿菌菌種，該方法簡便、且結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

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The application research of PCR-reverse dot blot hybridization assay for rapid identification of Mycobacterium species in BALF

XIN Chaxiang，XIONG Guoliang，YUAN Xiaolan，ZHANG Zhouyun，PENG Yiping.Jiangxi Provincial Chest Hospital，Nanchang 330006，China.

Objective To identify Mycobacterium species in BALF rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay（PCR-RDBHA）.Methods 306 cases of BALF from pulmonary tuberculosis patients and nontuberculous Mycobacteria（NTM）lung diseases patients were collected，Mycobacterium species of 360 cases of BALF were simultaneously detected by PCR-RDBHA and Roche medium culture.Results The positive rates of detecting Mycobacterium by PCR-RDBHA were 41. 5%（127/306），108 cases（85.0%）were determind to be M.tuberculosis comples（MTC），19 cases were determind（15.0%）to be NTM which contained 6 cases of M.abscessus，10 cases.of M.intracellulare，2 cases of M.gordonae and 1case of M.scrofulaceum.The positive rates of detecting mycobacterium by culture were 33.0%（101/306），89 cases（88.1%）were determined to be M.tuberculosis comples（MTC），12 cases were determined（11.9%）to be NTM.Conclusion PCR reverse dot blot hybridization technique can quickly identify mycobacterium species in BALF.The method is simple and accurate，and has good clinical application value.

Mycobacterium；Species identification；Polymerase chain reaction；Reverse dot blot hybridization assay

R378.91，R446.62

A

1674-1129（2016）04-0439-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.009

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目（編號：20165519）

辛茶香，女，1969年8月生，本科，副主任技師，主要從事結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)和研究工作。

（2016-04-29；

2016-07-07）