斑馬魚模型在心血管疾病中藥篩選和機制研究中的應(yīng)用

趙慧 樊華 周端

摘要：斑馬魚是目前生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動物之一，既有與哺乳動物類似的生理生化特征，又有高效、快速、大規(guī)模的優(yōu)勢。中藥活性成分復(fù)雜且作用靶點多樣，斑馬魚模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用日益廣泛。本文從血管新生、心肌損傷、高脂血癥及心血管毒性等方面，綜述斑馬魚模型在心血管疾病中藥篩選及作用機制研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；心血管；中藥；篩選；機制；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.033

中圖分類號：R259.4；R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0133-05

Abstract： Zebrafish is one of the important model vertebrates in the study of life science at present. It has similar physiological and biochemical characteristics to mammals， and has the advantages of high efficiency， rapidness and largescale. TCM has complex active ingredients and various targets， so the application of zebrafish model in TCM research is increasingly wide. This article reviewed the application status of zebrafish model in TCM screening cardiovascular diseases and mechanism research from the aspects of angiogenesis， myocardial injury， hyperlipidemia， and cardiovascular toxicity.

Keywords： zebrafish； cardiovascular； TCM； screening； mechanism； review

斑馬魚為輻鰭亞綱Actinopterygii鯉科Cyprinidae短擔(dān)尼魚屬Danio斑馬魚Danio rerio，又名藍條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚。由于斑馬魚較其他動物模型有許多優(yōu)勢，如對小分子的良好滲透性，越來越多的實驗將其作為活體高通量篩選模型，并逐漸拓展至新藥開發(fā)、病理生理學(xué)及藥理學(xué)領(lǐng)域。本文總結(jié)國內(nèi)外斑馬魚模型在中醫(yī)藥心血管相關(guān)研究中的作用機制及應(yīng)用，為該模型的研究與應(yīng)用提供參考。

1 斑馬魚特性

斑馬魚心血管系統(tǒng)由靜脈竇、心房、心室和動脈球等結(jié)構(gòu)組成，發(fā)育很快，受精后22 h心臟即開始收縮，受精后2 d生長完全[1]。受精后120 h，腦、肝、胰腺、腎等其他器官也完全形成[2]。斑馬魚的心血管系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上與哺乳動物相似，包括心房和心室，血液通過動、靜脈循環(huán)，有單獨的淋巴循環(huán)。不同的是解剖上雖有左右之分，但左右循環(huán)是分開的，淋巴結(jié)情況尚未闡明[3]。斑馬魚因其心血管系統(tǒng)具有不同于傳統(tǒng)動物模型的特點，其應(yīng)用日益廣泛。如傳統(tǒng)哺乳動物模型難以研究單純?nèi)毖獱顟B(tài)，而斑馬魚胚胎和日齡較小幼魚可通過皮膚供氧來抵抗缺血帶來的缺氧，即使循環(huán)完全停止，仍能存活一段時間[4]。因此，斑馬魚可作為心臟停搏的活體動物模型和缺血條件下非缺氧的動物模型。

成年斑馬魚體長3～4 cm，可高密度飼養(yǎng)，繁殖周期短，胚胎3～4個月即發(fā)育成熟。成年雌性具有很強的繁殖能力，每隔一周可產(chǎn)卵幾百顆。斑馬魚胚胎透明且具有脊椎動物大部分的組織器官，可直接用顯微鏡觀察變化，因此其胚胎和幼魚應(yīng)用最為廣泛。

2 斑馬魚模型在中藥篩選方面的應(yīng)用

中藥種類繁多、成分復(fù)雜，水煎劑由于批次及配伍比例和煎煮方法的不同而含有不同成分，故需要可行性高且可重復(fù)的短期高通量篩選模型。部分中藥提取物價格昂貴，適合給藥劑量小的動物模型。而斑馬魚體積較小且可通過吞咽和皮膚擴散吸收藥物，具有樣品用量少且用藥簡單等優(yōu)勢。此外，目前建立斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型的方法已經(jīng)成熟，可直接大量傳代轉(zhuǎn)基因品系，尤其是特定組織和器官表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因品系得到廣泛應(yīng)用[5]。

中藥具有多效應(yīng)、多成分、多靶點的作用特性，且部分中藥成分需在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化才能發(fā)揮藥理活性，細胞模型無法篩選，須在動物模型中完成。斑馬魚既可作為一個整體，分析中藥活性成分/組分的生物活性和毒性，并與體外分析進行比較，亦可進行器官、細胞和分子水平的研究。近年來，斑馬魚模型在中醫(yī)藥治療心血管相關(guān)疾病相關(guān)研究，尤其是中藥篩選方面的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛[6-10]。

2.1 促血管新生

血管新生指從已經(jīng)存在的血管網(wǎng)絡(luò)開始生長和發(fā)育，涉及血管出芽、內(nèi)皮細胞遷移、增生和管腔形成等過程[11]，是多種心血管疾病的治療靶點。許多血管新生體外實驗用于藥物篩選和研究血管生成的級聯(lián)反應(yīng)。目前已有轉(zhuǎn)基因斑馬魚在內(nèi)皮細胞特定表達綠色熒光蛋白，非常便于觀察。斑馬魚的心血管疾病模型在血管新生方面應(yīng)用較廣。

Tsea H等[12]發(fā)現(xiàn)，地黃和黃芪可促進血管綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1：EGFP）胚胎模型額外的節(jié)間血管形成，顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A、VEGF受體（VEGFR）Flk-1、成纖維細胞生長因子（FGF）1和肉瘤濾過性毒菌致癌同源體（bRaf）的表達。Hu G等[7]在酪氨酸酶抑制劑（VRI）誘導(dǎo)損傷后用黃芪多糖干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有明顯的血管損傷修復(fù)作用，呈劑量依賴性，且可下調(diào)VEGFR Flk-1和Flt-1 mRNA的表達。Zhang Y等[13]用黃芪甲苷Ⅳ干預(yù)由VRI誘導(dǎo)的斑馬魚節(jié)間血管、背部縱向吻合血管、腸下靜脈損傷，發(fā)現(xiàn)斑馬魚節(jié)間血管、背部縱向吻合血管損傷的區(qū)域明顯緩解，損傷的腸下靜脈血管也部分恢復(fù)。Tang J Y等[14]研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮的促血管新生作用是通過上調(diào)VEGFR、VEGFR1和VEGFR2的mRNA表達實現(xiàn)的。顯示對雌激素受體（ER）a和ERb的選擇性效力和親和力，且毛蕊異黃酮可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（erk1/2）和ER促進血管生成。Li S等[15]使用斑馬魚模型研究毛蕊異黃酮對斑馬魚的腸下靜脈的促血管新生作用，轉(zhuǎn)錄譜的深度測序和qPCR提示毛蕊異黃酮通過調(diào)節(jié)VEGF、FGF和表皮生長因子受體ErbB信號通路發(fā)揮促血管新生作用。Liu C L等[16]認為，地黃水粗提物具有明顯促血管新生作用，可促進腸下靜脈的毛細血管出芽，二氯甲烷提取部分的促進出芽作用最明顯，且地黃的提取物中含有咖啡酸，也具有促血管新生作用。

Lam H W等[17]觀察到當(dāng)歸提取物能促進斑馬魚腸下靜脈的生成，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)提示當(dāng)歸提取物可提高VEGF mRNA的表達。降香提取物具有促進斑馬魚腸下靜脈的血管新生作用，并可修復(fù)節(jié)間靜脈的損傷，上調(diào)由VRI誘導(dǎo)的VEGFRs（包括kdr、kdr1、flt-1）mRNA的表達減少，提示降香發(fā)揮血管新生的作用機制可能是調(diào)節(jié)VEGFRs的mRNA的表達和活化P13K/MAPK信號通路[8]。Hong S J等[18]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可促進斑馬魚腸下靜脈的血管新生，可提高VEGF和KDR/FLK-1的mRNA的表達，其促血管新生作用機制涉及VEGF-KDR/FLK-1和PI3K-Akt-eNOS信號通路。落新婦苷為土茯苓主要活性成分，可恢復(fù)VRI誘導(dǎo)的血管損傷模型的血管生長，在節(jié)間血管（ISV）損傷區(qū)域恢復(fù)了70%以上的完整血管[19]。

中藥復(fù)方研究方面，當(dāng)歸補血湯具有補氣生血作用，研究表明其可促進血管新生，且作用最明顯的比例為黃芪∶當(dāng)歸=5∶1。同時，黃芪和黃芪甲苷Ⅳ對正常斑馬魚的促血管新生效果優(yōu)于當(dāng)歸和阿魏酸[20]。李惠玲[21]通過長度和血管面積計數(shù)，發(fā)現(xiàn)麝香保心丸組整體血管長度和血管面積有明顯改善，且呈劑量依賴性，提示麝香保心丸可促進斑馬魚血管新生。李艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液對斑馬魚節(jié)間血管具有明顯再生效果，提示對血管損傷有保護和修復(fù)作用。

2.2 抗心肌損傷

斑馬魚心肌損傷模型報道較少。斑馬魚心功能無法直接測量，主要有3種間接的估算方法：二維算法、三維算法及超聲心動圖法。雖然第3種更為精確，但儀器要求較高，較常用的為前2種[23]。

目前斑馬魚心肌損傷模型主要為藥物誘導(dǎo)損傷研究，如異丙腎上腺素[24]、阿奇霉素[25]和馬兜鈴酸[26]等。其中異丙腎上腺素誘導(dǎo)后斑馬魚心率下降、心包水腫率增加、射血分?jǐn)?shù)降低、心室變大，可初步建立慢性心衰模型[24]。崔國禎等[25]用0.3、1 mmol/L濃度的阿奇霉素作用3 d后，斑馬魚胚胎腫大、心率減慢、心搏量變小。

不同的濃度和藥物對其心臟影響是不同的，也有研究表明中藥對于藥物誘導(dǎo)心臟毒性具有保護作用，如在斑馬魚模型中，舒尼替尼會導(dǎo)致心率降低，形成心包水腫，SV-BA/體長的比值增加，應(yīng)用100 μmol/L丹參酮ⅡA和磺酸鈉共同給藥后增加心率，抑制心包水腫，增加SV-BA/體長的比值，具有心臟保護的作用[27]。據(jù)報道特非那定可導(dǎo)致斑馬魚的心率明顯下降。而瓜蔞提取物能改善心率下降，其中瓜蔞的總樣、石油醚萃取物具有顯著的保護作用，乙酸乙酯萃取物和水層樣品表現(xiàn)出一定的改善心臟毒性作用[28]?？拱┧幬锇⒚顾貢?dǎo)致胚胎心臟區(qū)域出現(xiàn)心膜出血癥狀，心跳微弱，血液循環(huán)受阻，血細胞在心區(qū)堆積，隨著時間的延長，48 h后心臟形態(tài)線性化、心囊水腫、血液循環(huán)停止、心跳微弱以至停止，而益母草堿干預(yù)后，胚胎心臟區(qū)域出血癥狀以及心率有明顯改善，且與鹽酸益母草堿濃度成正相關(guān)[29]。此外，神香蘇合丸對心衰斑馬魚有抑制心臟擴大、改善靜脈瘀血、增加心輸出量、加快血流速度的作用[30]。

斑馬魚與人和其他的哺乳動物存在一定的差異，且中藥為復(fù)雜的、多靶點的體系，與化學(xué)藥物明確的單一成分的研究有很大不同，故運用斑馬魚模型在心臟和其他方面毒性的中藥篩選還需更深入的研究。目前，心肌損傷模型實驗方法和試劑等有待逐步完善，相關(guān)指標(biāo)檢測如血液檢測、心臟超聲尚無法進行，分離幼魚的心臟較困難，需進一步研究。

2.3 調(diào)節(jié)脂代謝

斑馬魚血脂組成、代謝、吸收與哺乳動物類似，其膽汁由肝產(chǎn)生，儲于膽囊，通過膽道運輸至腸或幽門盲囊。斑馬魚作為脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的研究模型，可用于研究冠狀動脈粥樣硬化、糖尿病、脂肪肝等[31]。高膽固醇飲食誘導(dǎo)的成年斑馬魚可觀察到血膽脂醇過多、脂蛋白氧化、脂肪條紋的形成。觀察透明的斑馬魚幼魚，可發(fā)現(xiàn)血管脂質(zhì)沉積、骨髓細胞積累、內(nèi)皮細胞層混亂、通透性增加、磷脂酶A2活性增加、巨噬細胞遷移導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積。提示可用于研究早期動脈粥樣硬化進程[32]。高膽固醇血癥斑馬魚模型在心血管疾病評價研究中應(yīng)用較多。

Littleton R等[33]采用斑馬魚幼魚模型，發(fā)現(xiàn)山楂葉和山楂花能通過抑制腸道膽固醇的吸收，提高心輸出量、降低血管內(nèi)膽固醇水平。Dalli E等[34]研究表明，山楂可減少糖尿病伴有冠心病患者中性粒細胞彈性蛋白酶，并顯示出降低低密度脂蛋白膽固醇趨勢。Kim J等[35]發(fā)現(xiàn)，枇杷葉可降低高膽固醇飲食喂養(yǎng)的斑馬魚血漿總膽固醇和三酰甘油水平，具有抗動脈粥樣硬化的作用。Jin S等[36]認為，肉桂和丁香的親水成分對減少動脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生率具有潛在作用，通過其抗氧化潛力、抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白和低密度脂蛋白的吞噬發(fā)揮作用。姜黃和月桂水提物可能通過強抗氧化作用，低密度脂蛋白的吞噬、預(yù)防載脂蛋白糖基化、抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白。從而降低總膽固醇、三酰甘油、減輕體質(zhì)量，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[37]。同時，姜黃和月桂水提物的主要成分1，8-桉葉素在脂質(zhì)代謝過程中具有抗氧化作用，可減少斑馬魚肝中的脂質(zhì)沉積[38]。

陳侃等[39]篩選中藥單體，發(fā)現(xiàn)大黃酚組血清總膽固醇、三酰甘油均下降，大黃酚可增加斑馬魚腸蠕動的頻率，加速腸道排空。其機制可能是大黃酚加快了高脂食物從腸道排出，減少了腸道對脂質(zhì)的吸收。冉蓋等[40]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)在斑馬魚形態(tài)學(xué)上未見明顯改善，對血脂亦未見明顯影響，但肝臟組織學(xué)檢查表明其能顯著改善過度喂飼誘導(dǎo)的脂肪浸潤和肝臟脂滴形成。即未影響體長、體質(zhì)量和血脂的情況下，可調(diào)節(jié)飲食誘導(dǎo)肥胖斑馬魚的脂代謝，這可能與pAMPKa/Sirt1/自噬通路有關(guān)。

3 斑馬魚模型在中藥心血管毒性研究中的應(yīng)用

斑馬魚由于其獨特的生理特性，現(xiàn)已被廣泛用于環(huán)境、毒理學(xué)、病理學(xué)領(lǐng)域的研究中。目前其藥物的毒性篩選研究應(yīng)用主要集中在神經(jīng)毒性、心臟毒性、胚胎發(fā)育毒性等方面。許多中藥及有效組分的心臟毒性作用尚未明確，使新藥研究與開發(fā)受到限制。斑馬魚作為重復(fù)性好的體內(nèi)篩選藥物毒性的模型，在新藥研發(fā)方面具有重要價值。

雷公藤紅素隨濃度升高、作用時間延長，胚胎心臟形態(tài)線性化、心膜出血、循環(huán)血流變慢或停止、血細胞在心區(qū)堆積等中毒癥狀越明顯，心率明顯降低。表明雷公藤紅素對斑馬魚胚胎心臟具有毒性作用，臨床應(yīng)用前心臟毒性評價應(yīng)引起足夠重視[41]。黃惠琳等[42]用發(fā)育正常的受精后48 h的斑馬魚胚胎作為實驗?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿組在受精后60、72 h時均出現(xiàn)胚胎心臟中毒現(xiàn)象。低濃度劑量組的胚胎主要表現(xiàn)為心臟發(fā)育畸形，更高濃度作用下，胚胎主要表現(xiàn)為心臟跳動停止、心臟區(qū)域出血，心率隨著濃度的升高而明顯下降，隨著暴露時間延長，心率下降不明顯，認為氯化兩面針堿對斑馬魚胚胎有心臟毒性。方芳等[43]用烏頭堿處理斑馬魚胚胎后，10、30、60 mg/L濃度組可觀察到胚胎心臟區(qū)域心包囊水腫、心膜出血、血細胞在心區(qū)堆積，隨著時間的延長，24 h胚胎心臟中毒癥狀更加明顯，心跳微弱甚至停止，血液循環(huán)受阻甚至停止。

馬兜鈴屬類植物如關(guān)木通、漢防己主要用于關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等疾病的治療，但所含馬兜鈴酸對多器官都具毒性。研究表明，馬兜鈴酸可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟功能受損，肌節(jié)聚集、內(nèi)皮細胞減少、心肌纖維破壞[26]。Ding Y J等[44]認為，馬兜鈴酸雖會造成斑馬魚胚胎心臟嚴(yán)重變形，引起循環(huán)功能障礙，但心臟損傷是由炎癥導(dǎo)致腎衰竭引起的，腎對于馬兜鈴酸的敏感性更強，心臟并非主要損傷器官。陳云祥等[45]認為馬兜鈴酸會使血流變慢/缺失、靜脈竇處瘀血、靜脈竇處水腫和心率變慢，未見心律不齊。

4 展望

中藥單體是中藥成分中具有單一化學(xué)結(jié)構(gòu)的活性化合物，其分子式和空間結(jié)構(gòu)明確，有利于研究其藥效、作用機制以及毒副反應(yīng)。目前，中藥單體由于其明確的成分被國際逐漸認可，但大部分中藥單體價格昂貴，傳統(tǒng)動物實驗花費高、耗時久。而斑馬魚由于來源相對便宜，易于短時間大規(guī)模繁殖，用藥較少，非常適合用于中藥單體的篩選。目前斑馬魚在心血管中的應(yīng)用主要集中在促血管新生作用、心肌損傷、高脂血癥和評價心臟毒性及其保護方面。斑馬魚心力衰竭、心律失常、心肌病模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用目前較為少見。

斑馬魚作為一種新的模式生物，有著與哺乳動物類似的生理生化特征，可用來研究人類疾病和高通量藥物篩選。但斑馬魚模型也存在一定局限性。目前主要應(yīng)用透明的斑馬魚胚胎，而胚胎生長迅速，不利于研究心血管慢性疾病，如慢性心力衰竭、冠狀動脈粥樣硬化、高血壓。斑馬魚雖然與人類的基因同源性較高，但結(jié)構(gòu)和體型差異較大，且心血管系統(tǒng)只有1個心房、1個心室，與人類四腔心結(jié)構(gòu)不同。在給藥時，由于是將藥物溶解在胚胎水中，無法保證斑馬魚對藥物吸入量的恒定性，檢測血漿中的藥物濃度也比較困難。同時，與其他傳統(tǒng)動物模型相比，斑馬魚的研究方法、試劑（抗體）和檢測指標(biāo)較少，還需進一步深入的探索。

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（收稿日期：2017-09-11）

（修回日期：2017-10-10；編輯：向宇雁）