番茄APX蛋白的表達(dá)分析

段明, 王興春,元旭朝

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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番茄APX蛋白的表達(dá)分析

段明1, 王興春2,元旭朝3

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)是植物體內(nèi)重要的的抗氧化酶之一，在植物抵御外界的氧化脅迫中發(fā)揮著重要的作用。為了研究其功能特性，本研究以番茄為試材，將前期分離得到的APX基因編碼區(qū)克隆至原核表達(dá)載體pET-30a中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化后，用該重組蛋白免疫小鼠制備抗體，用于Western蛋白表達(dá)分析。雜交結(jié)果表明，APX蛋白受低溫、干旱的誘導(dǎo)，與基因在RNA水平上的表達(dá)模式一致，但APX蛋白對(duì)鹽處理反應(yīng)不敏感；H2O2處理后蛋白水平呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，與基因表達(dá)變化趨勢(shì)不一致，這或許是APX存在一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

關(guān)鍵詞：番茄； 表達(dá)分析；APX基因

低溫、干旱、鹽漬等逆境是限制作物產(chǎn)量的主要因素，輕微時(shí)影響植株的生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其死亡[1]。葉綠體是植物光合作用的重要場(chǎng)所，也是活性氧產(chǎn)生的主要部位。在葉綠體中，水首先發(fā)生光解生成氧氣，電子通過(guò)光系統(tǒng)Ⅱ、中間傳遞體以及光系統(tǒng)Ⅰ傳給氧分子，將其還原，產(chǎn)生超氧陰離子自由基。超氧陰離子在超氧化物歧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶的催化下生成水，整個(gè)過(guò)程就是著名的水-水循環(huán)-Mehler反應(yīng)[2]。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控以及逆境中信號(hào)的傳遞和防御等方面都發(fā)揮了重要作用。濃度較低時(shí)對(duì)植物本身沒(méi)有傷害，相反能夠誘導(dǎo)體內(nèi)某些抗氧化酶基因的表達(dá)[3,4]，但是，濃度較高時(shí)則會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)活性大分子降解，引起植物凋亡[5,6]。

ROS的清除和降解主要通過(guò)植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)協(xié)同完成。主要包括抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidose, APX)在內(nèi)的抗氧化酶等, 以及小分子的抗氧化劑如谷胱甘肽和抗壞血酸等。

APX是植物體內(nèi)參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，特別是葉綠體中清除H2O2的重要酶。它的催化屬于過(guò)氧化物酶的乒乓機(jī)制[7]。它以抗壞血酸(AsA)為電子供體，催化AsA與H2O2生成單脫氫抗壞血酸和H2O。

正因?yàn)锳PX在抗氧化方面的重要性，近年來(lái)人們對(duì)APX的生理生化功能做了大量研究。Yoshimura等人發(fā)現(xiàn)，菠菜在受到強(qiáng)光或甲基紫精(methylviologen, MV)處理后，體內(nèi)胞質(zhì)cAPX的表達(dá)水平發(fā)生明顯上調(diào)[8]。Murgia等人研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)擬南芥類囊體膜tAPX基因能夠提高植物抵御MV引起的氧化傷害[9]。Sun等將番茄中的tAPX基因轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草顯示出對(duì)鹽、甘露醇等滲透脅迫的抗性[10]。綜上所述，我們可以看出，APX基因可使植物更好地保護(hù)自身免受外界環(huán)境造成的氧化傷害。

甜椒、番茄和黃瓜是我國(guó)北方地區(qū)設(shè)施栽培的主要蔬菜，春秋兩季易遭受低溫引發(fā)的傷害，因此深入探索和研究冷敏感作物的脅迫抗性機(jī)制，有助于培育優(yōu)質(zhì)的蔬菜品種。

本研究以前期已分離到的LeAPX基因?yàn)槟０? 將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上, 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得LeAPX融合蛋白抗體, 并對(duì)其在脅迫處理下的表達(dá)水平做了相關(guān)研究，為將來(lái)APX在番茄中的抗氧化研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

植物材料：番茄品種‘中蔬六號(hào)’。

載體和菌株：克隆載體購(gòu)于大連寶生物公司；原核表達(dá)載體pET-30a、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

PCR引物：由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

主要試劑：高保真PCR酶-KOD-Plus購(gòu)于東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅠ，T4DNA連接酶購(gòu)于大連寶生物公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于博奧(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

原核表達(dá)特異引物序列為：

LeAPX-Y-F；5′- AACTGAGCAACCTTGGT -3′；

LeAPX-Y-R；5′- ATAGTTCGTCGGGAGAG-3′。

引物擴(kuò)增得到APX編碼區(qū)序列，將其亞克隆到pMD18-T上，酶切目的片段后與原核表達(dá)載體pET-30a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落測(cè)序。

1.2.2E.coliBL21原核表達(dá)的誘導(dǎo)

原核表達(dá)載體pET-APX轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用IPTG誘導(dǎo)，每隔1 h收集菌液備用。

1.2.3APX抗體的制備

在最優(yōu)條件下大量表達(dá)重組蛋白，超聲波破碎后，離心收集菌體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后，切下誘導(dǎo)條帶，放入到離心管中，液氮研碎，溶于緩沖液中，免疫小鼠；總共分4次免疫小鼠，采用皮下注射，免疫結(jié)束后，對(duì)小鼠采取眼球取血的方式收集血清。

1.2.4APX抗體的Western雜交

提取番茄葉片總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。膜在甲醇溶液中浸泡后，用封閉液(PBS)封閉1 h后，將印跡膜放入APX多克隆抗體作為一抗的溶液中孵育1 h，將印跡膜在PBS中漂洗3次，每次10 min。 將印跡膜放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中孵育1 h后，將印跡膜在PBS中漂洗3次，每次10 min。最后將印跡膜放入潔凈容器中，放入預(yù)先配制的底物顯色液，室溫避光顯色。

2結(jié)果與分析

2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

為研究APX在蛋白水平上的表達(dá)，將之前分離到的LeAPX基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：AK319984)的編碼區(qū)正向插入到pET-30a(+)中，構(gòu)建了pET-LeAPX表達(dá)載體。啟動(dòng)子是T7，酶切位點(diǎn)分別是EcoRI和SalI(圖1)。

2.2原核表達(dá)載體的酶切鑒定和聚丙烯酰胺凝膠電泳

將構(gòu)建好的pET-LeAPX轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，菌液PCR和酶切鑒定一樣，有1 200 bp左右的條帶(圖2)，與LeAPX基因編碼區(qū)長(zhǎng)度符合。菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1條約為55 kD左右的條帶(圖3)。

2.3APX蛋白的表達(dá)分析

Western雜交分析表明，APX蛋白在50 mmol·L-1H2O2處理時(shí)，表達(dá)量發(fā)生下調(diào)；NaCl處理下，蛋白水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化；20% PEG處理后，APX蛋白表達(dá)明顯發(fā)生上調(diào)，12 h后達(dá)最高值；4 ℃處理下，APX蛋白也發(fā)生顯著變化，6 h后達(dá)到一個(gè)高峰，隨后有所下降(圖4)。

3討論與結(jié)論

植物生存在一個(gè)多變環(huán)境中，時(shí)常會(huì)受到低溫、高溫、干旱和鹽漬等非生物脅迫的影響。這些都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積累，進(jìn)而會(huì)破壞與光合電子傳遞有關(guān)的色素蛋白復(fù)合體、類囊體膜上的脂類以及卡爾文循環(huán)中的某些酶等，使葉綠素發(fā)生降解，導(dǎo)致光合作用下降。大量研究表明，APX的過(guò)量表達(dá)可以提高植物對(duì)氧化脅迫的耐性，有效地清除體內(nèi)的H2O2，維持植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此通過(guò)基因工程手段進(jìn)行APX基因的遺傳操作可改良農(nóng)作物的品質(zhì)和抗性。近年來(lái)，有關(guān)APX研究已不斷擴(kuò)展和深入，研究人員陸續(xù)在植物體內(nèi)鑒定出一系列APX基因。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上構(gòu)建了APX基因的原核表達(dá)載體，重組蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化后，制備了APX的多克隆抗體。為了探索APX在蛋白水平上的表達(dá)模式，番茄植株分別進(jìn)行了干旱、低溫、氧化和高鹽脅迫處理。Western雜交表明，低溫、干旱條件下，APX蛋白水平顯著上調(diào)，高鹽處理下，APX蛋白水平基本保持不變，出乎意料的是，H2O2下調(diào)其蛋白的表達(dá)，與Sun等[11]轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果截然相反，造成這樣的結(jié)果可能有兩個(gè)原因：一是氧化脅迫的時(shí)間點(diǎn)是否合適，是否隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白水平的表達(dá)會(huì)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；二是或許植物體內(nèi)APX存在著其它調(diào)控機(jī)制，影響APX蛋白的同步表達(dá)，Mittler等[12]曾證明胞質(zhì)型APX屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。轉(zhuǎn)錄和翻譯的不一致有待后期工作的進(jìn)一步研究，可通過(guò)人為加入抑制劑來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)而檢測(cè)其表達(dá)水平的變化。

參考文獻(xiàn)

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(編輯：武英耀)

Expression analysis of LeAPX

Duan Ming1, Wang Xingchun2,Yuan Xuzhao3

(1.Experimentalandteachingcenter,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；2.CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Key words:Tomato; Expression analysis;APXgene

Abstract:APX is one of the important antioxidative enzymes in plant. It plays a key role in the resistance of plants to oxidative stress in the external environments. In order to study its function, we used tomato as material,APXgene which cloned before was constructed in the prokaryotic expression vector pET-30. After being induced and expressed, the fusion protein were used to prepare for antibody and Western-blot analysis. The results showed APX were induced by low temperature and PEG, in line with the patterns of gene expression, but was not induced by NaCl; After H2O2spraying treatment, the level of APX appeared to decline, which display different pattern from that of the gene expression. There could be a mechanism of post-transcriptional regulation, which could be explored in future.

收稿日期：2016-03-04 修回日期：2016-03-29

作者簡(jiǎn)介：段明(1984-),男(漢)，山東威海人，博士，講師，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)

基金項(xiàng)目：山西省青年科技研究基金(2015021142)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(20142-12)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2013YJ44)

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)06-0387-04