與胡桃楸莖枝同煮雞蛋中吸收成分的提取工藝研究

付瑩　王添敏　邸學(xué)　張慧　初正云　翟延君

【摘 要】 目的：研究胡桃楸莖枝含藥雞蛋中吸收成分的提取工藝，為胡桃楸的抗腫瘤有效成分研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用不同溶劑提取胡桃楸莖枝的含藥雞蛋提取液作為供試品溶液，以供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)及峰面積總和為評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)提取溶劑中加酸量、提取方法和提取溶劑種類進(jìn)行選擇，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)提取溶劑的濃度、提取溶劑的用量和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：通過(guò)單因素試驗(yàn)確定提取溶劑中不加酸，采用回流提取，提取溶劑為含水丙酮；正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝為：50倍量50%丙酮回流提取2h。結(jié)論：優(yōu)選后的提取工藝穩(wěn)定可靠、合理可行，為研究胡桃楸含藥雞蛋中吸收的成分奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 胡桃楸；莖枝；含藥雞蛋；提取工藝；正交設(shè)計(jì)

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）04-0024-05

Abstract：Objective Eggs cooked with the branches of Juglans mandshurica which was called drug-contained eggs. For the research of constituents absorbed by the drug-contained eggs， this study was conducted to optimize the extraction technology of the drug-contained eggs.Methods For the optimization of acid content added into the extracting solvent， extracting method， and extracting solvent， single factor experiment was designed. Orthogonal experiment was conducted to choose the time of extraction， concentration and volume of the extracting solvent. The total number and the sum of area of chromatographic peak were taken as investigation index.Results The result of single factor experiment demonstrated that acetone and reflux was suitable for the extraction and no acid should be added into the extracting solvent. Orthogonal experiment suggested that the drug-contained eggs should be extracted with 50 times of 50% acetone by reflux for 2 hours. Conclusions The optimum extracting technology is reasonable and stable. This work was useful for the research of the constituents absorbed by the drug-contained eggs.

Keywords：Juglans mandshurica；Branches；Drug-contained eggs；Extraction Technology；Orthogonal Design

胡桃楸始載于《開(kāi)寶本草》，具有補(bǔ)肺益腎、滋陰助陽(yáng)、抗癌的功效[1]。民間將胡桃楸與雞蛋同煮用于治療腫瘤[2]，輕者吃雞蛋，重者蛋湯同吃。本課題組前期對(duì)與胡桃楸不同部位同煮的雞蛋（含藥雞蛋）進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)與胡桃楸不同部位同煮的含藥雞蛋均有不同程度的抗腫瘤作用，其中，莖枝的含藥雞蛋抗腫瘤作用最明顯。但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)提取含藥雞蛋吸收成分的研究報(bào)道。另外，含藥雞蛋中吸收的成分較多，不能以單一成分或某類成分的含量為考察指標(biāo)，為了全面準(zhǔn)確的分析含藥雞蛋中吸收的成分，研究以HPLC圖譜中峰個(gè)數(shù)及峰面積總和為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋中吸收成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為深入研究胡桃楸含藥雞蛋的抗腫瘤作用及胡桃楸的合理開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（G1242B型DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ALC-110.4萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯）；JA21002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x（天津市旗美科技有限公司）。

1.2 材料 胡桃楸莖枝樣品于2012年10月采自遼寧省普蘭店市蓮山鎮(zhèn)老白山，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為胡桃楸科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.；市售新鮮雞蛋；乙腈（美國(guó)霍尼韋爾公司）、三氟乙酸（TFA，百靈威科技有限公司）、甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）均為色譜純；娃哈哈純凈水（杭州哇哈哈純凈水有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫為30℃；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；進(jìn)樣體積20μl或50μl（根據(jù)樣品濃度改變）；流動(dòng)相為0.1%TFA-乙腈和0.1%TFA-水溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

查算供試品溶液的HPLC圖譜中色譜峰個(gè)數(shù)和峰面積總和采用的積分事件參數(shù)：斜靈敏度為0.5，峰寬為0.02，最小峰面積為0.5，最小峰高為0.1。峰個(gè)數(shù)和峰面積總和均除去溶劑峰后進(jìn)行查算。

2.2 含藥雞蛋的制備 取雞蛋數(shù)枚，稱重，加入與雞蛋等重的胡桃楸莖枝粉末（過(guò)40目篩），10倍量水煎煮。雞蛋蛋白稍凝固后，將蛋殼敲碎繼續(xù)煮4h。取出雞蛋，去殼，置攪拌器中加入適量水?dāng)噭?，混懸液?jīng)冷凍干燥得與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋（含藥雞蛋）粉末。

2.3 供試品溶液的制備 取胡桃楸莖枝含藥雞蛋粉末0.5g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，按照單因素和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，加入不同體積、不同濃度的丙酮或乙醇溶液，回流提取2～4h或超聲提取1h，提取結(jié)束后，濾過(guò)，取續(xù)濾液5ml，吹干，精密加入10%甲醇1ml溶解殘?jiān)?，混勻?.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 提取溶劑中加酸量考察 以25ml體積分?jǐn)?shù)為70%的丙酮作為提取溶劑，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%的甲酸，按“2.3”項(xiàng)下回流提取2h方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，考察提取溶劑中加入一定量的酸對(duì)供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果（表2）表明，提取溶劑中不加酸時(shí)，供試品溶液中HPLC峰的個(gè)數(shù)為108個(gè)，明顯高于其它各加酸組；峰面積總和為3675，也高于其它各加酸組。因此選擇提取溶劑中不加酸進(jìn)行下面提取方法的考察。

2.4.2 提取方法的考察 以25ml濃度為70%的丙酮作為提取溶劑，分別采用回流提取2h、30℃超聲提取1h、40℃超聲提取1h和50℃超聲提取1h，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，考察不同提取方法對(duì)供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果（表3）表明，采用回流提取時(shí)，供試品溶液中HPLC色譜峰面積總和為4217.63，明顯高于其它超聲提取組；峰個(gè)數(shù)為97個(gè)，也高于其它各超聲提取組。因此選擇回流提取方法進(jìn)行下面提取溶劑的考察。

2.4.3 提取溶劑種類的考察 分別以25ml濃度為50%、70%、90%的丙酮溶液和25ml濃度為50%、70%、90%的乙醇溶液作為提取溶劑，按“2.3”項(xiàng)下回流提取2h方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，考察不同提取溶劑對(duì)供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1，隨著丙酮和乙醇濃度的升高，供試品溶液中HPLC峰的個(gè)數(shù)及峰面積總和均減小，50%丙酮提取效率優(yōu)于70%丙酮和90%丙酮的提取效率，50%乙醇提取效率優(yōu)于70%乙醇和90%乙醇的提取效率。比較乙醇和丙酮2種提取溶劑，50%乙醇提取的供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)（127個(gè)）略高于50%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)（125個(gè)），但兩者間無(wú)明顯差異；而50%、70%、90%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰面積總和均高于相應(yīng)50%、70%、90%乙醇提取的峰面積總和，其中50%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰面積總和最高，為6364.26。因此選擇丙酮作為提取溶劑進(jìn)行下面提取溶劑濃度的考察。

2.4.4 提取溶劑濃度的考察 在提取溶劑種類考察的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制備供試品溶液時(shí)，隨著丙酮和乙醇濃度的降低，濾過(guò)的速度明顯減慢，此過(guò)程增加了提取溶劑的揮發(fā)，在一定程度上使續(xù)濾液濃度增大，導(dǎo)致低濃度溶劑提取時(shí)供試品溶液中HPLC峰面積增大。同時(shí)，從圖1可知，在選取的丙酮3個(gè)濃度中，沒(méi)有找到提取效率最高的濃度點(diǎn)，仍需向低濃度方向擴(kuò)大提取溶劑濃度考察的范圍。因此在以丙酮為提取溶劑進(jìn)行溶劑濃度考察時(shí)，為了避免續(xù)濾液在濾過(guò)時(shí)濃度變大的影響，供試品溶液制備采用微孔濾膜濾過(guò)后直接進(jìn)行HPLC分析，未進(jìn)行濃縮，此次實(shí)驗(yàn)的HPLC進(jìn)樣濃度為其它實(shí)驗(yàn)的1/2，所以峰面積總和也相應(yīng)減少；為了能夠包含提取效率最高的溶劑濃度點(diǎn)，選擇30%、50%、70%、90%的丙酮作為提取溶劑濃度考察的范圍。

分別以25ml的30%、50%、70%、90%的丙酮溶液作為提取溶劑，按“2.3”項(xiàng)下回流提取2h，提取結(jié)束后，上清液經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果（圖2）表明不同濃度丙酮提取效率差異明顯，30%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個(gè)數(shù)（118個(gè)）略高于50%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個(gè)數(shù)（116個(gè)），但兩者間無(wú)明顯差異；50%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰面積總和為3193.51，明顯高于其它各濃度丙酮組。90%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個(gè)數(shù)及峰面積總和均為最低，提取效率最差，故選擇30%、50%、70%的丙酮溶液作為正交試驗(yàn)考察的范圍。

2.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取丙酮濃度（A）、溶劑用量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，D列為空白列即誤差列，用來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)的誤差。每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表[3-4]，分析因素及水平見(jiàn)表4。正交設(shè)計(jì)方案及其結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)的試驗(yàn)條件，按“2.3”項(xiàng)下回流提取2h方法制備供試品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以供試品溶液中HPLC色譜峰的個(gè)數(shù)和峰面積總和為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

在對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析時(shí)，極差反映了A、B、C三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的程度。極差越大，說(shuō)明該因素水平變動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化越大。從供試品溶液HPLC峰個(gè)數(shù)的極差值（表5）來(lái)看，實(shí)驗(yàn)中各因素的影響順序依次為A（丙酮濃度）>C（提取時(shí)間）>B（溶劑用量），但是差別較??；從HPLC峰面積總和的極差分析，各因素影響順序?yàn)锳（丙酮濃度）>B（溶劑用量）>C（提取時(shí)間），其中丙酮的濃度及用量對(duì)峰面積總和的影響相對(duì)較大，提取時(shí)間對(duì)峰面積的影響較小。從供試品溶液HPLC色譜峰個(gè)數(shù)的方差分析來(lái)看（表6），丙酮的濃度、用量及提取時(shí)間的P值均大于0.3，說(shuō)明各因素對(duì)色譜峰的個(gè)數(shù)均無(wú)顯著性影響。從供試品溶液HPLC色譜峰面積總和來(lái)看（表7），丙酮濃度的P<0.05，說(shuō)明丙酮濃度對(duì)峰面積總和有顯著性影響；提取溶劑用量的P值為0.061，說(shuō)明溶劑用量對(duì)峰面積總和有一定的影響，但影響不顯著；而提取時(shí)間的P值為0.132，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)峰面積總和無(wú)顯著性影響。

通過(guò)直觀分析和方差分析結(jié)果可知，提取溶劑濃度、用量和提取時(shí)間對(duì)供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)無(wú)顯著性影響。而提取溶劑的濃度和用量對(duì)供試品溶液的HPLC峰面積總和均有影響，且提取溶劑濃度的影響顯著。因此忽略峰個(gè)數(shù)指標(biāo)，選擇色譜峰面積總和為指標(biāo)，得到最佳提取工藝組合為A2B2C1，即采用50%丙酮為提取溶劑，溶劑用量為含藥雞蛋的50倍，回流提取2h。此提取工藝也符合實(shí)際生產(chǎn)中周期短、成本低等特點(diǎn)。

2.6 提取工藝驗(yàn)證 為了確定提取工藝的穩(wěn)定性及可靠性，對(duì)以上所選的工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8，HPLC圖譜見(jiàn)圖3、4。結(jié)果表明，供試品溶液中HPLC色譜峰的個(gè)數(shù)及峰面積總和的RSD分別為1.79%、3.91%，說(shuō)明該提取工藝結(jié)果穩(wěn)定。最佳提取工藝組合A2B2C1沒(méi)有出現(xiàn)在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該提取條件下供試品溶液中HPLC色譜峰面積總和高于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中所選的提取條件，而峰個(gè)數(shù)與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中所選的提取條件無(wú)明顯差異，因此最終確定該工藝為最佳提取工藝。

3 討論

民間將胡桃楸與雞蛋同煮用于治療腫瘤，課題組前期研究表明與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋對(duì)植于小鼠腋下的H22腫瘤生長(zhǎng)具有較明顯的抑制作用參考文獻(xiàn)。為了明確胡桃楸含藥雞蛋中吸收的成分，本文從胡桃楸與雞蛋同煮的用法出發(fā)，對(duì)胡桃楸含藥雞蛋中吸收成分的提取工藝進(jìn)行了研究。胡桃楸中含有鞣質(zhì)、萘醌、酚酸和二芳基庚烷等成分[5]，這些成分的結(jié)構(gòu)中都含酚羥基，尤其鞣質(zhì)類成分易與蛋白質(zhì)結(jié)合。部分成分與蛋白質(zhì)的結(jié)合在一定條件下是可逆的[6]，選擇合適的提取條件能夠?qū)⑦@些成分提取出來(lái)。提取溶劑的種類、pH值、用量以及提取方法、提取時(shí)間等均能影響雞蛋中吸收成分的提取率。因此本文考察了提取溶劑的種類、提取溶劑中加酸量、提取溶劑的濃度、提取溶劑的用量、提取方法和提取時(shí)間等6個(gè)因素對(duì)含藥雞蛋中吸收成分提取率的影響。由于考察因素較多，本文根據(jù)具體情況對(duì)因素進(jìn)行了劃分，分為單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。

提取溶劑pH值主要通過(guò)影響成分的解離狀態(tài)以及破壞成分與蛋白質(zhì)間的結(jié)合力[7]來(lái)影響含藥雞蛋中吸收成分的提取率，該因素的影響結(jié)果在很大程度上不會(huì)受提取方法、提取溶劑和提取時(shí)間的影響。提取方法選擇回流提取和超聲提取，兩者對(duì)含藥雞蛋吸收成分提取率的影響取決于提取機(jī)制的不同[8]，受提取溶劑和提取時(shí)間的影響也較小。研究采用單因素試驗(yàn)依次考察提取溶劑加酸量和提取方法對(duì)含藥雞蛋中吸收成分提取率的影響。由于胡桃楸中大部分成分的極性較大，提取溶劑比較了極性較大的含水丙酮和含水乙醇，結(jié)果各濃度丙酮對(duì)含藥雞蛋中吸收成分的提取率均高于相應(yīng)濃度乙醇組。因此選擇丙酮為提取溶劑，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)丙酮濃度、提取溶劑用量和提取時(shí)間進(jìn)行了考察。

以供試品溶液中HPLC峰個(gè)數(shù)和峰面積和為指標(biāo)，兩者之間有一定關(guān)聯(lián)又不完全相同。正交試驗(yàn)的直觀分析和方差分析均表明各考察因素對(duì)供試品溶液中HPLC色譜峰個(gè)數(shù)的影響不顯著，對(duì)峰面積的影響顯著。因此以峰面積為指標(biāo)確定了最佳提取工藝為：提取溶劑為50%丙酮溶液，溶劑用量為胡桃楸枝含藥雞蛋粉末的50倍，回流提取2 h。最后對(duì)優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，表明該工藝方法簡(jiǎn)單、提取率高、穩(wěn)定性好，為胡桃楸含藥雞蛋中吸收成分的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015.12.20）