人參細(xì)胞TTC-脫氫酶活力測(cè)定條件的優(yōu)化

王晗，雷秀娟，宋娟，尹紅新，姚麗娜，梁韶，侯志芳，王英平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春?130112)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)為多年生草本植物，是我國名貴中藥材，具有抗腫瘤、抗衰老等功效。由于人參生長周期長且不能連作，嚴(yán)重阻礙了我國人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為此，將組織培養(yǎng)應(yīng)用于人參育種，為縮短育種年限及實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新提供了技術(shù)手段。從此，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

由于植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)受生長周期、pH、初始接種細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)基成分等因素的影響，懸浮培養(yǎng)過程中其細(xì)胞活力、細(xì)胞狀態(tài)對(duì)細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成有重要的作用。從20世紀(jì)70年代開始，研究者采用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)-脫氫酶還原法測(cè)定植物細(xì)胞活力[1，2]。TTC-脫氫酶還原法最早應(yīng)用于植物種子活力的測(cè)定[3]，后來逐步用于植物根系、莖葉、花粉等部位細(xì)胞的活力檢測(cè)[4，5]和超低溫保存后細(xì)胞相對(duì)存活率的測(cè)定[6～8]，國內(nèi)不少學(xué)者用于植物懸浮細(xì)胞活力的測(cè)定[9]。

目前，國內(nèi)報(bào)道TTC-脫氫酶還原法以氧化還原性染料TTC作為指示劑，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有生物氧化(脫氫反應(yīng))時(shí)，TTC接受H被還原成紅色的三苯基甲月贊(TF)，使用有機(jī)溶劑萃取出TF，在485nm波長下測(cè)其吸光光度值，以吸光光度值來反映脫氫酶活性，進(jìn)而反映細(xì)胞活力[10，11]。此方法雖然操作簡單，但在實(shí)際應(yīng)用中常受多種因素的影響，如溶液pH、萃取劑、反應(yīng)溫度等[12，13]。因此，本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)人參細(xì)胞活力的測(cè)定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定人參細(xì)胞TTC-脫氫酶活力測(cè)定所需條件，為人參優(yōu)良細(xì)胞篩選提供理論依據(jù)，加快人參育種的工作進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)供試材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所資源圃種植的3年生人參葉片為外植體，建立人參愈傷組織無性系。

1.2 試劑

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上?；菔郎噭┯邢薰?；0.9%生理鹽水(四平巨能藥業(yè)有限公司)；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、無水乙醇、甲醛(分析純，北京化工廠)；硫酸鈉(Na2SO3)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1材料的制備將人參葉片誘導(dǎo)而成的愈傷組織繼代培養(yǎng)15d左右，接種于MS液體培養(yǎng)基中，置于搖床上25℃培養(yǎng)10d。樣品于800r/min離心10min，去液體培養(yǎng)基，然后用0.9%生理鹽水沖洗，于800r/min離心10min，去上清，重復(fù)3次，稱取0.1g人參細(xì)胞，待用。

1.3.2不同濃度TTC溶液的配制稱取TTC粉末0.05g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g溶于100mL蒸餾水中，濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，避光保存。

1.3.3不同pH緩沖液的配制分別稱取35.82g Na2HPO4·12H2O和15.6g NaH2PO4·2H2O溶于500mL蒸餾水中，配制濃度為0.2mol/L的NaH2PO4和Na2HPO4溶液；將2溶液按一定比例混合，得到不同pH的磷酸緩沖液。

1.3.4TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參考趙連梅方法[14]，稱取0.05g TTC，溶于50mL蒸餾水中，配制1mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，存于棕色容量瓶中。分別吸取1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL置于50mL棕色容量瓶中，蒸餾水定容，則TTC質(zhì)量濃度分別為0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L，即為工作液。將此工作液分別吸取1.0mL置于15mL離心管中，再依次加入磷酸緩沖液(pH 7)2mL、0.36% Na2SO3溶液1mL、蒸餾水1mL，混勻后分別加入連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)5mg，充分混勻置于暗處，致使TTC全部還原為TF。加入0.4mL甲醛終止反應(yīng)。再加5mL無水乙醇為萃取劑，60℃水浴20min～30min，離心取上清，于485nm波長處測(cè)吸光光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5TTC法測(cè)定細(xì)胞活力參照Towill和Mazur方法[15]，取待用0.1g人參細(xì)胞置于試管中，加入TTC溶液和磷酸緩沖液5mL(按1∶1比例混合)，靜置于暗處，TTC接受細(xì)胞呼吸過程中產(chǎn)生的H被還原為紅色物質(zhì)TF。一段時(shí)間后去上清，加入5mL蒸餾水洗滌，重復(fù)2次～3次。加入5mL無水乙醇，置于60℃水浴20min～30min，室溫下靜置至細(xì)胞無色。取上清，采用分光光度計(jì)在485nm波長處測(cè)吸光光度值。根據(jù)測(cè)定的吸光光度值計(jì)算出TF的質(zhì)量濃度，定義每分鐘每克細(xì)胞反應(yīng)1μg TF作為1個(gè)酶活力單位。

1.3.6單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)在優(yōu)化TTC-脫氫酶還原法測(cè)定人參細(xì)胞活力參數(shù)過程中，分別對(duì)TTC濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因子試驗(yàn)。

1.3.7正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)TTC濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行初步篩選大致范圍，每個(gè)因子設(shè)4個(gè)水平，用L16(45)正交表作16個(gè)試驗(yàn)(表1)。

表1正交試驗(yàn)因素與水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.3.8數(shù)據(jù)分析以吸光光度值(OD)、酶活力(U)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差和方差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 TTC法檢測(cè)脫氫酶活力的標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度的TTC溶液與過量的還原劑Na2S2O4反應(yīng)生成TF，以TF為生成量作為橫坐標(biāo)、485nm處的吸光光度值為縱坐標(biāo)作圖，見圖1。

圖1 TF標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可得：m(TF)=(OD485+0.0444)/0.0033μg，測(cè)定細(xì)胞呼吸鏈脫氫酶活力=m(TF)/(t×m)。式中，t：反應(yīng)時(shí)間(min)；m：細(xì)胞重量(g)。

2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1TTC濃度對(duì)脫氫酶活力的影響TTC作為細(xì)胞呼吸過程中產(chǎn)生的H接受體，在樣品反應(yīng)體系中，為了測(cè)定不同TTC濃度對(duì)TF的生成量的影響。首先將反應(yīng)體系pH設(shè)為7、反應(yīng)溫度為25℃、反應(yīng)時(shí)間為24h。試驗(yàn)中研究了0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% TTC對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響。TTC濃度對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)TTC濃度為0.05%時(shí)，吸光光度值僅為0.1～0.2之間；隨著TTC濃度的增加，吸光光度值、酶活力值呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)TTC濃度為0.6%時(shí)，吸光光度值、酶活力值均達(dá)到最大；此后脫氫酶活性開始有微小的下降。由此可以得出，試驗(yàn)中反應(yīng)體系中的TTC濃度控制在0.4%～1.0%之間對(duì)獲得穩(wěn)定的TF生成量較有利。

圖2 TTC濃度對(duì)TF吸光值和脫氫酶活性測(cè)定的影響

2.2.2pH對(duì)脫氫酶活力的影響磷酸緩沖液是TTC脫氫酶活性測(cè)定常用的緩沖液。首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、反應(yīng)溫度設(shè)為25℃、反應(yīng)時(shí)間為24h。試驗(yàn)中研究了不同pH對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響(圖3)。由圖3可知，隨著pH的增大，其吸光光度值、活力值呈先上升后稍微下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH為7.5時(shí)，吸光光度值、酶活力值均達(dá)到最大。因此，反應(yīng)體系中適宜pH控制在7～8中性偏堿范圍內(nèi)。

圖3 pH值對(duì)TF吸光值和脫氫酶活性測(cè)定的影響

2.2.3反應(yīng)溫度對(duì)脫氫酶活力的影響在樣品反應(yīng)體系中，為了測(cè)定反應(yīng)溫度對(duì)脫氫酶活力的影響，首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、pH設(shè)為7、反應(yīng)時(shí)間為24h。本試驗(yàn)研究了4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響。反應(yīng)溫度對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)TF吸光值和脫氫酶活性測(cè)定的影響

由圖4可知，在其它條件一致的情況下，反應(yīng)溫度對(duì)脫氫酶活力影響明顯，隨著反應(yīng)溫度的升高，脫氫酶活力先增加后降低，當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時(shí)，吸光光度值最大；當(dāng)溫度大于30℃時(shí)，吸光光度值急劇下降。因此，對(duì)于人參細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶，適宜的酶促反應(yīng)溫度為25℃～30℃。

2.2.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫氫酶活力的影響在樣品反應(yīng)體系中，為了測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫氫酶活力的影響，首先將反應(yīng)體系中TTC濃度設(shè)為0.6%、pH設(shè)為7、反應(yīng)溫度為25℃。本試驗(yàn)研究了3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響。反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫氫酶活力測(cè)定的影響結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)TF吸光值和脫氫酶活性測(cè)定的影響

結(jié)果表明，在一定時(shí)間內(nèi)，TF的生成量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為21h，TF生成量最多，吸光光度值最大；隨著反應(yīng)時(shí)間延長，吸光光度值反而降低，這與黃春花以蛹蟲草為材料研究TTC-脫氫酶活性[16]時(shí)得到的變化規(guī)律一致；反應(yīng)時(shí)間為18h時(shí)，脫氫酶活性達(dá)到最大，這是由于酶活力的大小不僅與TF生成量有關(guān)，也與細(xì)胞重量、反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1極差分析本試驗(yàn)采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶活力值(U)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析(表2)。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

Table 2Results and range analysis of orthogonal test

通過極差分析得出，影響TTC-脫氫酶還原法的主次順序?yàn)榉磻?yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、TTC溶液濃度、pH。

2.3.2方差分析對(duì)酶活力值進(jìn)行進(jìn)一步方差分析，結(jié)果如表3所示。

結(jié)果表明，在本試驗(yàn)設(shè)定的4個(gè)因素中，反應(yīng)溫度對(duì)人參細(xì)胞活力影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)人參細(xì)胞活力影響達(dá)到顯著水平(P<0.1)，TTC溶液濃度、pH對(duì)人參細(xì)胞活力影響不顯著。綜上，通過方差分析得出最佳水平組合是ABC3D3，因子A、B可選任意水平，結(jié)合正交試驗(yàn)，可以選定最佳水平組合為A1B3C3D3。

表3方差分析

Table 3Analysis of variance

注：F0.90(3，3)=5.39；F0.99(3，3)=29.46。

3 結(jié)論與討論

TTC-脫氫酶還原法測(cè)定的細(xì)胞活力大小反映脫氫酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力[17]。影響酶活力的因素有很多，包括溫度、時(shí)間、pH、酶濃度等。本試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH、TTC濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)人參細(xì)胞活力測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行了極差和方差分析。

TTC溶液存在適宜的質(zhì)量濃度范圍，過高或過低均會(huì)影響體系TF的生成[18]。Mersi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過脫氫酶作用產(chǎn)生的H不一定全部傳遞給TTC受體，而且TTC本身的毒性也會(huì)抑制酶的活力，進(jìn)而影響H的傳遞過程，其還原產(chǎn)物TF也可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，這可能是高質(zhì)量濃度TTC溶液導(dǎo)致TF值下降的原因。

酶促反應(yīng)體系的酸度、緩沖容量對(duì)酶活力測(cè)定影響很大。本研究結(jié)果表示，當(dāng)pH為7～8時(shí)，TF生成量維持在較高水平。由于磷酸鹽緩沖液緩沖范圍相對(duì)較窄，但是在一定范圍內(nèi)，人參細(xì)胞活力隨著pH的增加而增加，當(dāng)pH為7.5時(shí)，人參細(xì)胞脫氫酶活力達(dá)到最高，隨后有輕微的下降。因此磷酸緩沖液緩沖范圍適合人參細(xì)胞脫氫酶活力的測(cè)定。

TTC法測(cè)定人參細(xì)胞脫氫酶活力檢測(cè)的反應(yīng)溫度維持在25℃～30℃。在其他條件一致的情況下，反應(yīng)溫度對(duì)脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果影響明顯，當(dāng)溫度低于4℃，有少量的TF生成，隨后隨著溫度的升高，TF生成量明顯增加，當(dāng)溫度為25℃時(shí)，吸光光度值和酶活力值均達(dá)到最大；當(dāng)溫度再上升時(shí)，脫氫酶反應(yīng)受到影響，吸光光度值急劇下降。其原因可能在于隨著溫度的升高，一方面，酶促反應(yīng)速度加快；另一方面，脫氫酶逐漸變性，導(dǎo)致酶活力降低，當(dāng)達(dá)到酶的極限溫度時(shí)，酶促反應(yīng)將不能繼續(xù)進(jìn)行。

TTC-脫氫酶還原法測(cè)定活力時(shí)，樣品反應(yīng)體系內(nèi)TF生成量隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加[20]。在一定時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，吸光光度值和脫氫酶活力升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為18h時(shí)，吸光光度值不是最高值，但酶活力值卻達(dá)到最高，接著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為21h，吸光光度值達(dá)到最大值，但酶活力值處于下降的趨勢(shì)。這是由于酶活力的大小不僅與TF生成量有關(guān)，也與細(xì)胞重量、反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。反應(yīng)時(shí)間的再延長并沒有使吸光光度值增加反而使其降低，這可能是由于在氧化還原作用下，破壞了TF的共軛體系[16]。

通過極差和方差分析得出，影響TTC-脫氫酶還原法的主次順序?yàn)榉磻?yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、TTC溶液濃度、pH，反應(yīng)溫度對(duì)人參細(xì)胞活力影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)人參細(xì)胞活力影響達(dá)到顯著水平(P<0.1)。這說明，這兩個(gè)試驗(yàn)因素均是影響TTC-脫氫酶還原法測(cè)細(xì)胞活力的關(guān)鍵因素。

綜上所述，TTC-脫氫酶還原法測(cè)定人參細(xì)胞活力的最佳組合為：ABC3D3，由于因子A、B可選任意水平，結(jié)合正交試驗(yàn)，可以選定最佳水平組合為A1B3C3D3(TTC溶液濃度0.4%、pH 7.5、反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間18h)。本試驗(yàn)優(yōu)化的人參細(xì)胞活力檢測(cè)方法具有重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，為人參優(yōu)良細(xì)胞篩選、超低溫保存試驗(yàn)提供可靠的依據(jù)。

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