重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細(xì)胞變化及意義

夏良萍，蔡琴，張曉鳳(江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

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重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細(xì)胞變化及意義

夏良萍，蔡琴，張曉鳳
(江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

摘要：目的探討重度子癇前期（sPE）患者外周血Th17及CD4+CD25+Treg細(xì)胞變化及意義。方法選取2011-2013年鎮(zhèn)江婦幼保健院40例sPE患者及40名健康對(duì)照者。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17及CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平；采用ELISA檢測血漿IL-17、IL-22、TGF-β和IL-10水平，并分析其與sPE的相關(guān)性。結(jié)果sPE患者組外周血Th17細(xì)胞水平為(1.21±0.82)%，顯著高于健康對(duì)照組的(0.74±0.63)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.45，P=0.002)。sPE患者組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平為(1.65±0.49)%，顯著低于健康對(duì)照組的(2.42±0.91)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.25，P=0.001）。sPE患者組IL-17、IL-22水平分別為80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，高于健康對(duì)照組的32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為10.74、5.89，P均＜0.01），IL-10、TGF-β水平為26.29±10.31、25.65±11.81ng/L，低于健康對(duì)照組的33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.35、6.78，P均＜0.01)。sPE患者血漿IL-17、IL-22水平與Th17細(xì)胞水平呈顯著正相關(guān)(r=0.69、0.58，P＜0.01)。結(jié)論sPE患者Th17細(xì)胞數(shù)量增高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量減少，以及相關(guān)細(xì)胞因子的紊亂在sPE的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。

關(guān)鍵詞：重度子癇前期；T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子類

重度子癇前期（server pre-eclampsia，sPE）是危害嚴(yán)重的妊娠期特有疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒患病和死亡的重要原因。Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)不同于Th1和Th2的Th細(xì)胞亞群。Th17主要分泌IL17、IL22等促炎癥因子，在自身免疫中起重要的作用。Th17細(xì)胞在胚胎免疫排斥的發(fā)生中起一定作用[1]；而Treg細(xì)胞是一個(gè)可誘導(dǎo)免疫耐受并且有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，有助于母體對(duì)胎兒耐受[2]。本研究通過測定sPE患者外周血中Th17、CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，探討其在sPE發(fā)病機(jī)制中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2011年6月至2013年12月在鎮(zhèn)江市婦幼保健院婦產(chǎn)科剖宮產(chǎn)分娩的sPE患者40例為研究對(duì)象，40例正常妊娠產(chǎn)婦為對(duì)照組。所有入組孕婦孕前均無高血壓、腫瘤、內(nèi)分泌等疾病，肝腎功能無異常。兩組孕婦年齡、體重指數(shù)等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。sPE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂杰主編的全國統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版。

1.2標(biāo)本采集采集sPE患者及正常產(chǎn)婦外周全血4ml，肝素抗凝。及時(shí)分離血清-70℃保存。

1.3試劑和儀器⑴Thl7流式檢測試劑盒和CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測試劑盒購自Biolegend公司；佛波酯、離子霉素均購自Sigma公司；莫能霉素購自Biolegend公司；流式細(xì)胞儀型號(hào)為FACSCalibur（美國BD公司)。⑵細(xì)胞因子檢測：ELISA試劑盒購自美國R&D公司；Bio-Rad imark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)。

1.4 Th17細(xì)胞的檢測用Ficoll法分離出PBMC，用RPMll640重懸提取的PBMC；取20μl細(xì)胞懸液加20μl錐蟲藍(lán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106/ml；加入PMA和離子霉素后充分混勻，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后加入莫能霉素，混勻后培養(yǎng)5h。取培養(yǎng)后細(xì)胞懸液100μl于流式管中，每管加0.5ml固定液，搖勻室溫孵育20min；加入2m l破膜洗液，混勻室溫孵育20min后離心棄上清；用破膜洗液洗滌和重懸，加入10μl抗人IL-17Alexa Fluor647/ CD3 FITC/CD4 PE抗體混勻，室溫孵育30min，30min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的檢測取20μl細(xì)胞懸液加20μl錐蟲藍(lán)；加入1mlFOXP3透膜液，混勻后室溫孵育20min；洗滌重懸細(xì)胞，室溫孵育15min；加入10μl抗人FOXP3 Alexa Fluor488/CD25PE/ CD4 PerCP抗體后暗處孵育30min；30min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6外周血血漿IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），操作步驟按照ELISA試劑盒說明。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，定量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 sPE患者外周血Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平sPE患者外周血Th17細(xì)胞水平為（1.21±0.82）%，高于健康對(duì)照組的（0.74±0.63）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.45，P=0.002）；sPE患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平為（1.65±0.49）%，低于健康對(duì)照組的（2.42±0.91）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.25，P=0.001）。

2.2細(xì)胞因子檢測結(jié)果sPE患者外周血IL-17、IL-22表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sPE患者IL-10、TGF-β表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　重度子癇前期患者血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)水平（n g/L，±s）

表1　重度子癇前期患者血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)水平（n g/L，±s）

組別IL-17 （ng/L) IL-22 （ng/L) IL-10 （ng/L) TGF-β （ng/L)重度子癇前期組健康對(duì)照組t值P值例數(shù)4 0 40 80.03±31.25 32.84±17.23 10.74 <0.01 60.22±18.32 35.24±14.33 5.89 <0.01 26.29±10.31 33.24±11.93 3.35 <0.01 25.65±11.81 48.261±13.85 6.78 <0.01

2.3相關(guān)性分析sPE患者血漿IL-17、IL-22水平與Th17細(xì)胞水平呈顯著正相關(guān)（r=0.69、0.58，P< 0.01）；IL-10、TGF-β與CD4+CD25+Treg細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.58、0.60，P<0.01）。

3　討論

Th17細(xì)胞分泌高水平的IL-17、IL-22、IL-23，并高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt，Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病中的研究證實(shí)其參與人體免疫及炎癥反應(yīng)的生物學(xué)過程[3，4]。Brewster等[5]研究表明，sPE患者血漿中IL-17水平顯著高于正常妊娠組。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-17等Th17細(xì)胞系列細(xì)胞因子與胎膜早破、宮內(nèi)感染等臨床表現(xiàn)有密切關(guān)系[6]。本研究發(fā)現(xiàn)sPE患者外周血Th17細(xì)胞高于正常妊娠組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)sPE患者外周血Th17細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子IL-17、IL-22高于對(duì)照組。進(jìn)一步證明Th17細(xì)胞在sPE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。Th17細(xì)胞分泌高水平的IL-17介導(dǎo)sPE的可能機(jī)制是：高水平IL-17與多種細(xì)胞因子協(xié)同作用，可促進(jìn)胎盤小血管炎癥反應(yīng)。同時(shí)IL-17有募集中性粒細(xì)胞的能力，粒細(xì)胞釋放的活性物質(zhì)可造成內(nèi)皮細(xì)胞損害，這可能是構(gòu)成了患者血管痙攣、血壓升高、蛋白尿、水腫等臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)。

Treg細(xì)胞是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，以表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制基因Foxp3為特征并分泌IL-10、TGF-β，可誘導(dǎo)免疫耐受并具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群[7，8]。近年來有研究證實(shí)sPE患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量與正常妊娠組相比明顯減少[9]。本研究發(fā)現(xiàn)sPE患者外周血Treg細(xì)胞低于正常妊娠組，與先前的報(bào)道相符。Treg細(xì)胞是維持人體自身免疫耐受的一組細(xì)胞群，Treg細(xì)胞活化后能抑制自身免疫反應(yīng)性，能維持正常妊娠的免疫平衡，Treg細(xì)胞在胚胎著床及妊娠過程中起著至關(guān)重要的作用[10]。轉(zhuǎn)錄抑制基因Foxp3表達(dá)下降可能是影響Treg細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞減少的因素之一，導(dǎo)致Treg細(xì)胞和效應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞之間的失衡，最終引發(fā)病理妊娠。細(xì)胞因子TGF-β具有雙向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞作用，低濃度的TGF-β可誘導(dǎo)RORγt表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化；而高濃度TGF-β能抑制IL-17的表達(dá)而增強(qiáng)Foxp3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖分化[11~13]。本研究發(fā)現(xiàn)sPE患者TGF-β水平明顯降低，可能是TGF-β的降低導(dǎo)致Treg細(xì)胞減少，Th17細(xì)胞增加，使sPE患者免疫失衡，導(dǎo)致患者疾病的發(fā)生。

妊娠是全身各系統(tǒng)參與的過程，胎兒與母體間的免疫平衡決定了妊娠的成敗，當(dāng)免疫平衡失調(diào)，可導(dǎo)致病理性妊娠或妊娠失敗[14]。隨著新的CD4+T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)將傳統(tǒng)的妊娠免疫理論模式發(fā)展為Th1/Th2/Treg/Th17模式[15]。研究Th17、Treg細(xì)胞在sPE發(fā)病機(jī)制中的作用為臨床預(yù)測和治療該疾病，尋找到治療sPE等妊娠合并癥的新靶點(diǎn)提供了一個(gè)新的思路。

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·讀者·作者·編者·

The imbalance of Th17 and Treg cells in patientsw ith severe pre-eclampsia

XIA Liangping，CAIQin，ZHANG Xiaofeng.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China.

Abstract：Objective To analyze the levels of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood of patientswith sPE.M ethods The percentage of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were examined by flow cytometry.Plasma cytokines levelsweremeasured by ELISA.Results The percentage of Th17 cells in patientswith sPE was higher than that of healthy controls[(1.21±0.82)%vs(0.74±0.63)%，t=3.447，P=0.002].The percentage of CD4+CD25+Treg cells in patientswith sPE was lower than that of healthy controls[(1.65±0.49)%vs(2.42±0.91)%，t=-4.25，P=0.001].Plasma levels of IL-17，IL-22 in sPE patients were 80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，and in the control group were 32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，respectively，they were significantly differentbetween the two groups(t=10.74、5.89，all P<0.01).However，IL-10 and TGF-βlevelsweremarkedly decreased in sPE patients compared with controls(26.29±10.31、25.65±11.81ng/L vs 33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，t=-3.35、6.78，all P<0. 01).IL-17、IL-21 had positive correlation with Th17 cells(r=0.69、0.58，respectively，all P<0.01)in sPE patients.Conclusion This study suggests that the imbalance of Th17 cells and CD4+CD25+Treg cells，the disorder of related cytokines are important in the pathogenesis of sPE.

Key words：Severe pre-eclampsia；T-Lymphocytes；Cytokines

(收稿日期2015-11-03；修回日期2015-12-16)

作者簡介：夏良萍，女，1977年3月出生，學(xué)士學(xué)位，檢驗(yàn)主管技師，檢驗(yàn)專業(yè)，主要研究方向：流式細(xì)胞術(shù)。

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（H201249）

中圖分類號(hào)：R446.62，R714.24+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)01-0018-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.006