自噬在癲癇發(fā)生中的作用及microRNA調(diào)控機制初探*

甘　靖，魯瑞豐，屈　藝 綜述，母得志 審校

(四川大學華西第二醫(yī)院兒科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，成都 610041)

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自噬在癲癇發(fā)生中的作用及microRNA調(diào)控機制初探*

甘靖，魯瑞豐，屈藝 綜述，母得志 審校

(四川大學華西第二醫(yī)院兒科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，成都 610041)

[關鍵詞]自噬；癲癇；微小核糖核酸；發(fā)病機制

細胞自噬，又稱“自我消化”，是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)之外，胞質(zhì)內(nèi)清除長壽蛋白和衰老或受損細胞器的主要代謝通路[1]。正常生理情況下，自噬介導清除異常折疊的泛素化的蛋白或細胞器,對于維持細胞維態(tài)、健康起著重要作用；但在病理情況下，異常的自噬則會導致細胞或組織的異常，甚至導致疾病的發(fā)生，如癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癲癇等[2]。癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。但其發(fā)病機制尚未完全闡明，對癲癇發(fā)病過程、發(fā)病機制的研究及探討能更好地為臨床治療癲癇提供實驗基礎。近年國內(nèi)外的癲癇研究比較集中于新的生物標志物的尋獲，如微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)、蛋白芯片等，這對于癲癇的發(fā)病機制、治療及預后有較好的提示作用。自噬作為一種新的細胞程序式死亡方式，在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用也逐漸地被認識到。

1自噬與癲癇的定義

1.1自噬根據(jù)包裹物和運輸方式不同，細胞自噬被分為3種類型，即微自噬、分子伴侶介導的自噬和巨自噬。其中以巨自噬最為多見，后面統(tǒng)稱細胞自噬。細胞自噬對饑餓、炎癥、氧化等應激信號敏感，對于維持內(nèi)環(huán)境平衡是不可或缺的。自噬分為啟動、成熟(與溶酶體融合)及自噬體降解等階段。(1)啟動階段：在應激狀態(tài)下，有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成，該階段依賴Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶和空泡蛋白的活性，其產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3磷酸鹽在自噬的啟動階段起著重要作用；(2)延伸階段：分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞質(zhì)成分完全包繞隔離形成自噬體，該階段依賴2個泛素樣反應，二者分別形成Atg12-Atg5-Atg16L1復合物及微管相關蛋白1輕鏈3相關產(chǎn)物；(3)成熟階段：自噬體沿微管逐漸向富含溶酶體的核周區(qū)移動，在多種蛋白作用下通過細胞骨架微管網(wǎng)絡系統(tǒng)將其包裹的胞質(zhì)成分運輸?shù)饺苊阁w與溶酶體融合形成自噬溶酶體；(4)降解階段：自噬體被溶酶體中的水解酶溶解，降解產(chǎn)物在細胞內(nèi)再循環(huán)利用。自噬相關基因(ATGs)及其編碼的自噬相關蛋白(Atg1～Atg35)在自噬過程中發(fā)揮重要作用。

1.2癲癇全球約有5 000萬癲癇患者，我國約占1/5，且每年以40萬例的速度增長。癲癇是小兒神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一種疾病，其中約3/4的癲癇患者起病于兒童時期。長期反復的癲癇發(fā)作可導致患者認知功能損害、神經(jīng)精神異常、社會適應能力降低等，嚴重影響患者的生活、工作和學習。若在兒童或青少年時期就開始出現(xiàn)癲癇發(fā)作，患者的智力及身體發(fā)育更容易受到影響，給患者造成巨大的社會經(jīng)濟學負擔。抗癲癇藥物仍是目前的一線治療，但并未針對潛在的病理生理學問題進行診治，絕大多數(shù)的癲癇發(fā)生機制并不清楚，目前的認識程度還僅停留在行為學、細胞或分子水平。雖然癲癇的具體發(fā)生機制不甚明確，但涉及的分子機制包括基因轉錄、翻譯、翻譯后修飾等遺傳信息鏈中的多個環(huán)節(jié)，且與神經(jīng)元死亡、凋亡，海馬區(qū)神經(jīng)再生，海馬區(qū)新生顆粒細胞異位遷徙，新生顆粒細胞樹突形態(tài)發(fā)育異常，軸突損傷，突觸重塑，苔蘚纖維出芽，神經(jīng)遞質(zhì)及其受體功能障礙，離子通道基因改變，膠質(zhì)細胞增生，炎癥等有關[3]。目前國內(nèi)外關于自噬在癲癇發(fā)生中的作用相關研究逐漸增多，但國內(nèi)還尚未見有相關綜述報道；同時，微小核糖核酸對自噬的調(diào)控及癲癇的發(fā)生也起到十分重要的作用。本文將重點介紹自噬在癲癇發(fā)生中的作用及探索microRNA對自噬的調(diào)控機制。

2自噬在癲癇發(fā)生中的作用

近年來，越來越多的文獻研究發(fā)現(xiàn)自噬與癲癇的發(fā)生密不可分，即自噬可以導致癲癇的發(fā)生，如結節(jié)性硬化和拉福拉病(LD)，其具體的致病機制研究也逐漸被揭示，包括哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)通路、糖元異常聚積。最新的研究還發(fā)現(xiàn)Atg7的失活而使自噬缺陷足以造成癲癇的發(fā)生[4]，盡管Atg7對于軸突退行性變的作用存在爭議[5]，但至少表明自噬能夠調(diào)控軸突穩(wěn)態(tài)；自噬還與突觸的生長及塑形有關，且自噬還可調(diào)控突觸前結構與神經(jīng)傳導[6]。因此，失控的自噬能促進異常軸突塑型、突觸重塑及癲癇網(wǎng)絡形成。

2.1mTOR通路mTOR是機體的一個關鍵蛋白激酶，它參與調(diào)節(jié)多種重要的細胞和生理功能，如細胞生長、代謝、增殖及蛋白質(zhì)翻譯等。mTOR是由谷氨酸能神經(jīng)元傳遞的，并受細胞的活化狀態(tài)控制。mTOR又可以調(diào)節(jié)多種離子通道、神經(jīng)突觸塑型、神經(jīng)元的結構和神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達。病理情況下，mTOR通路的異常已被證實可以導致多種癲癇的發(fā)生，包括結節(jié)性硬化、癲癇持續(xù)狀態(tài)和癥狀性癲癇。在遺傳性癲癇和獲得性癲癇中，mTOR與自噬的關系得到了進一步證實。mTOR可以負向調(diào)控自噬，并且通過mTOR抑制劑，即雷帕霉素可誘導自噬的發(fā)生，mTOR的下游調(diào)控機制已經(jīng)逐漸被揭示清楚。Mcmahon等[4]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中通過抑制上游的負向調(diào)控蛋白[磷酸酶張力蛋白和結節(jié)性硬化癥(TSC)蛋白]去除對mTOR通路的抑制可以導致癲癇的發(fā)生。雖然其具體導致癲癇發(fā)生的機制仍不甚明了，但考慮可能與神經(jīng)元興奮性毒性及軸突穩(wěn)態(tài)改變有關。另有研究發(fā)現(xiàn)敲除神經(jīng)膠質(zhì)細胞中TSC1基因后，星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象和海馬中錐體細胞出現(xiàn)了散在分布現(xiàn)象；磷酸酶張力蛋白基因敲除小鼠的神經(jīng)脊密度出現(xiàn)了增加和顆粒細胞肥大，可能通過影響細胞的生長來誘發(fā)癲癇。雷帕霉素可以通過誘導自噬發(fā)生來延遲或抑制癲癇的發(fā)展并降低自發(fā)性癲癇的發(fā)作頻率，具體機制可能與抑制苔蘚纖維的出芽和增強神經(jīng)保護作用、維持血腦屏障的完整性有關。除此之外，自噬同樣在調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)及線粒體自噬方面也起著重要作用[7]，這同樣也是癲癇發(fā)生的重要機制之一。Goto等[8]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制mTOR可以促進線粒體自噬，進而誘發(fā)癲癇的發(fā)生。這些文獻提示通過mTOR通路的調(diào)控可以引起自噬的異常進而導致癲癇的發(fā)生。

2.2糖元異常聚積癲癇通常不會被定義為神經(jīng)變性疾病，但有一個例外：LD。這是一種較為罕見的、致死性的常染色體隱性遺傳的進行性肌陣攣性癲癇。LD的病因是由于癇蛋白(laforin)或malin的基因突變造成大腦皮質(zhì)丘腦、黑質(zhì)、蒼白球及齒狀核等部位的神經(jīng)細胞胞質(zhì)內(nèi)嗜堿性包涵體(Lafora小體)異常聚積而導致[9]。Laforin小體實際上是一種不可溶解的萄聚糖小體異常聚積所形成，受磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶通路調(diào)控，并且其廣泛地沉積于大腦組織中造成神經(jīng)元細胞凋亡及頻繁癲癇發(fā)生，在LD發(fā)病機制中起著重要作用。Laforin蛋白是一種雙重特異性蛋白激酶，它通過TSC2抑制mTOR的表達從而促進自噬的發(fā)生。Laforin蛋白的缺失會引起mTOR被異常激活、自噬被抑制，最終會導致細胞質(zhì)內(nèi)糖元異常聚積以致癲癇發(fā)生。Singh等[10]還發(fā)現(xiàn)可以通過抑制血清/糖皮質(zhì)激素誘導激酶1來抑制mTOR活性，減少糖元異常聚積從而可能達到治療LD的目的。Malin蛋白是一種E3泛素連接酶，與Laforin蛋白一樣，對于自噬的調(diào)控起著重要作用。Malin蛋白缺陷小鼠不能合成自噬小體，故存在自噬缺陷，而且與LD患者有相同的臨床表型。Laforin與Malin基因突變均會引起細胞內(nèi)糖元清除障礙，二者之間存在著微妙的關系。但與Laforin蛋白不同的是，Malin蛋白缺陷的致病機理不依賴于mTOR通路[11]。Lafora小體具體的致病機制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)與樹突異常及Lafora小體周圍的膠質(zhì)細胞增生有關[12]。

2.3癲癇發(fā)生后對自噬的影響由上述的介紹不難看出自噬的缺陷足以引起癲癇的發(fā)生；另一方面，癲癇的發(fā)生也會引起自噬的異常表達。癲癇的發(fā)生隨之會引起氧化應激、三磷腺苷耗竭、腫瘤壞死因子α(TNF-α)升高、離子通道異常，這些都會導致神經(jīng)元自噬的發(fā)生。鑒于自噬與突觸傳導調(diào)控、突觸塑型、興奮性毒性、神經(jīng)元死亡、神經(jīng)退行性變、星形膠質(zhì)細胞凋亡和軸突、突觸、線粒體功能有關，異常的自噬可促進癲癇的發(fā)生，從而可能形成一種惡性循環(huán)，促進癲癇網(wǎng)絡的形成；相反，適度的自噬則可以預防癲癇的發(fā)生。Benz等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中，自噬微管相關蛋白輕鏈3(LC3),磷酸化雷帕霉素靶蛋白/雷帕霉素靶蛋白比值,重組人B淋巴細胞瘤-2相關永生基因3和熱休克蛋白70表達明顯升高。Ni等[14]發(fā)現(xiàn)新生鼠癲癇模型中自噬指標LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1及cathepsin-B表達升高，其中cathepsin-B與神經(jīng)興奮性毒性有關，利用cathepsin-B抑制劑可以通過抑制自噬通路起到減輕癲癇所致神經(jīng)行為缺陷的作用。另外，抗氧化劑如維生素E和維生素C能抑制氧自由基與自噬，起到神經(jīng)保護作用，為癲癇的治療提供了一種全新的方法[15]。TNF-α作為一種致癇因子可以激活星形細胞，但同時TNF-α在癲癇中可以通過介導p65/RelA-Ser529引起自噬性星形膠質(zhì)細胞凋亡[16]。簡言之，某種程度上，自噬就像是一把雙刃劍，可以促進或抑制癲癇的發(fā)生。但自噬與癲癇的關系尚不十分清楚，自噬缺陷引起癲癇發(fā)生的機制也仍需進一步的探討，這可為將來癲癇發(fā)生機制的研究指明新的方向。

3miRNA對自噬的調(diào)控機制

自噬的調(diào)控機制非常復雜，參與的信號通路眾多。miRNA是一種僅有約20～25個核苷酸的序列的內(nèi)源性非編碼蛋白RNA片段，通常在轉錄后水平調(diào)控基因表達。已有大量研究顯示miRNA在癲癇的發(fā)生中起著重要的作用[3]，而且近年來miRNA調(diào)控自噬表達的機制研究也逐漸豐富起來，并且出現(xiàn)一個新的名詞“autophagamiRNAs”。

研究發(fā)現(xiàn)，在自噬的各個階段均有相關的miRNA對其進行調(diào)。例如，在啟動階段，miRNA-885-3p、 miRNA-106a、miRNA-290-295、miRNA-20a、miRNA-106b、miRNA-30a、miRNA-519a、miRNA-376a、miRNA-376、bmiRNA-216b、miRNA-130a、miRNA-17-5p、miRNA-30b、miRNA-30d、miRNA-30d、miRNA-101、miRNA-155、miRNA-99a、miRNA-519、miRNA-18a、miRNA-630、miRNA-374a、miRNA-195、miRNA-34a等可以分別通過調(diào)控非等位51-like激酶2、非等位51-like激酶1、Beclin1基因、Rab5A基因、BCL2/腺病毒E1B蛋白相互作用蛋白3、雷帕霉素靶蛋白的復合體1、hVPS34、紫外輻射抗性相關基因、自噬相關基因(Atg)4、高遷移率族蛋白1來影響自噬的表達[17-19]。同樣的，在延長和成熟階段miRNA-376a、miRNA-376b、miRNA-101[20-21]、miRNA-101、miRNA-199a-5p、miRNA-375、miRNA-155、miRNA-290-295、miRNA-17、miRNA-204、miRNA-183、miRNA-30a、miRNA-30d、miRNA-30b、miRNA-181a、miRNA-374a、miRNA-519a、miRNA-142-3p、miRNA-106b、miRNA-23b、miRNA-30c、miRNA-130a、miRNA-93、miRNA-224、miRNA-885-3p、miRNA-630、miRNA-130a、miRNA-34a、miRNA-130a、miRNA-502、miRNA-502等分別通過影響LC3、Atg4、Rab5A、Atg7、Atg12-Atg5-Atg16L1復合物、Atg2B、DICER1、Atg9A、Atg9-Atg2-Atg18復合物、Rab1B、p53來調(diào)控自噬表達。在降解階段的miRNA調(diào)控機制研究相對較少，miRNA-30d[22]和miR-17/20/93/106家族可以通過Atg2和SQSTM1來影響自噬溶酶體的降解與回收利用。另有文獻報道通過在線軟件預測發(fā)現(xiàn)miRNA-130、miRNA-98、miRNA-124、miRNA-204、miRNA-142可能參與自噬體降解階段的調(diào)控[23]。除此之外，還有很多miRNA通過影響免疫相關鳥苷三磷酸酶基因[24]、人微管去穩(wěn)蛋白,表皮生長因子受體、p21、p53、RabB1、缺氧誘導因子-1α、p27kip1、Rheb、植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體、FoxO3轉錄因子、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、溶酶體相關膜蛋白3、Rab27A、HATs和組蛋白去乙?；竵碚{(diào)控自噬。另一方面，自噬可以選擇性地降解DICER1-EIF2C復合物來保持miRNA的穩(wěn)態(tài)[25]。

自噬性miRNA的研究多數(shù)集中于腫瘤學，但對于癲癇發(fā)生過程中調(diào)控自噬的miRNA研究尚屬空白。自噬與miRNA均與突觸重塑、神經(jīng)元塑形、增殖、凋亡、炎癥等有關[3]，且這些病理生理因素均可導致癲癇的發(fā)生，因此猜測在癲癇的發(fā)生中可能存在某種miRNA-自噬通路發(fā)揮著作用。如miRNA-155可以通過mTOR誘導自噬發(fā)生[26]，并且在幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中這種作用更為明顯，強烈提示在癲癇發(fā)生中的存在著這種假說通路。然而，也有部分文獻研究的結果與這種假說相悖，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34a負性地調(diào)控自噬表達，但miRNA-34a與自噬均為促進癲癇的發(fā)生，在癲癇持續(xù)狀態(tài)模型或患者中的表達卻與自噬一樣是升高的[27]。但不論怎樣，這些結果至少證明在癲癇的發(fā)生中，miRNA與自噬之間存在著十分復雜的聯(lián)系。

4總結與展望

作為當今科學界十大科技突破前兩名，自噬與miRNA在生命科學領域已得到了廣泛而深入的研究，特別是在腫瘤學領域，但在癲癇方面的研究才剛剛起步。通過本文可以了解到自噬、miRNA與癲癇的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，但具體的機制并不明確。雖然miRNA-自噬通路在其他領域的研究也逐漸成熟，但在癲癇領域尚無相關研究報道。因此，探索miRNA調(diào)控癲癇發(fā)生過程中自噬的作用及機制，是目前亟待解決的問題，miRNA-自噬通路很有可能為癲癇的預防和治療打開一扇全新的大門。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.035

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81330016,81172174,81270724)；教育部科研基金資助項目(IRT0935)；國家臨床重點?？?兒科新生兒專業(yè))建議項目(1311200003303)。

作者簡介：甘靖(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

[中圖分類號]R725

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2134-03

(收稿日期：2015-11-19修回日期：2016-01-13)