Clathrin在急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展*

劉俊彥 綜述，李玉英審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所，重慶 400037)

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Clathrin在急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展*

劉俊彥 綜述，李玉英△審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所，重慶 400037)

呼吸窘迫綜合征，成人；危重病；Clathrin；中性粒細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；肺水腫；急性呼吸窘迫綜合征；綜述

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭。其致病因素眾多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。除致病因素對(duì)肺泡的直接損傷外，更重要的是多種炎癥細(xì)胞及其釋放的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子對(duì)肺泡上皮和微血管的損傷。ARDS的主要病理生理特征為肺微血管通透性增加，肺泡內(nèi)富含蛋白質(zhì)的液體積聚，進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫和透明膜的形成，造成嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)。近年來(lái)ARDS的分子發(fā)病機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)，研究表明網(wǎng)格蛋白(Clathrin)在ARDS的發(fā)病及進(jìn)展中扮演重要角色，現(xiàn)就其具體機(jī)制做一簡(jiǎn)要綜述。

1　Clathrin的基本結(jié)構(gòu)、功能

Clathrin是1976年在動(dòng)物細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞極性相關(guān)的蛋白質(zhì)，被稱為網(wǎng)格蛋白。它是由3條重鏈和3條輕鏈構(gòu)成的三腳架復(fù)合體，組成六邊形或五邊形的籠型結(jié)構(gòu)，重鏈?zhǔn)侨_架結(jié)構(gòu)的主要骨架，輕鏈用于調(diào)節(jié)Clathrin籠型結(jié)構(gòu)的組裝和拆卸。Clathrin是所有真核細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂類從質(zhì)膜運(yùn)載到胞內(nèi)的主要工具,也是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)從反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(trans Golgi network,TGN)到核內(nèi)體的載體。植物細(xì)胞中的Clathrin至今未被正式鑒定，但在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了類似動(dòng)物Clathrin的編碼基因[1]。Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞(Clathrin-mediated endocytosis,CME)廣泛參與組織器官生長(zhǎng)發(fā)育等生理、病理過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。植物Clathrin在生長(zhǎng)素輸出載體活性亞基(PIN)蛋白介導(dǎo)的生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[1]。

2　Clathrin介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用

CME參與多種物質(zhì)的入胞及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。Clathrin包被囊泡(Clathrin-coat vesicle，CCV)的形成主要經(jīng)過(guò)以下步驟：(1)Clathrin包被小窩的成核化(nucleation of Clathrin-coatde pits)；(2)貨物的捕獲；(3)細(xì)胞膜內(nèi)陷、凹窩縮溢；(4)囊泡剪切和去包被[2]。這一過(guò)程需要多種輔助蛋白的參與，如AP2、AP180、eps、endophilin、BAR、EFc/F-BAR蛋白家族成員、HSC70等。其中AP2(adapter protein)是一種重要的銜接蛋白，它能識(shí)別結(jié)合貨物并將其募集到Clathrin、介導(dǎo)膜結(jié)合與定位和其他輔助蛋白(dynamin、auxilin、Eps15)相互作用、維持包被小窩的發(fā)育。Clathrin在ARDS的多種致病因素和多個(gè)病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Clathrin不僅多方面參與介導(dǎo)白細(xì)胞和肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能，還在各種炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號(hào)通路中起重要調(diào)控作用。此外，Clathrin內(nèi)吞調(diào)控Na,K-ATP酶、水通道蛋白，以及上皮細(xì)胞的黏附連接和緊密連接，在肺水腫液和蛋白的清除、肺水腫的恢復(fù)中也具有重要意義。闡明Clathrin在ARDS中的作用機(jī)制，將有助于進(jìn)一步深化對(duì)ARDS的發(fā)病機(jī)制的理解，并對(duì)ARDS的臨床治療提供新的思路。

3　Clathrin與中性粒細(xì)胞激活

肺內(nèi)多形核細(xì)胞(PMN)的產(chǎn)生是ARDS過(guò)度炎性反應(yīng)的元兇。中性粒細(xì)胞觸發(fā)呼吸爆發(fā)釋放活性氧、大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷，引發(fā)肺水腫和氣體交換障礙。(1)Clathrin參與E-選擇素(E-selection)介導(dǎo)的白細(xì)胞的黏附。E-選擇素是表達(dá)于活化血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞一種介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要分子，與其配體結(jié)合后介導(dǎo)白細(xì)胞在活化血管內(nèi)皮上的滾動(dòng)。白細(xì)胞結(jié)合E-選擇素后，經(jīng)Clathrin包被小窩迅速內(nèi)吞。高滲環(huán)境孵育中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞能夠可逆的損傷Clathrin介導(dǎo)的E-選擇素的內(nèi)吞和支持白細(xì)胞滾動(dòng)的能力。證明E-選擇素與Clathrin包被小窩相互作用加強(qiáng)了白細(xì)胞的黏附[3]。(2)Clathrin介導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化受體的內(nèi)吞。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)是一種具有多功能生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)，包括血小板的激活、白細(xì)胞活化、氣道收縮和血管通透性增高。PAF受體需要Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞，募集β-arrestin-1和p38MAPK 信號(hào)小體實(shí)現(xiàn)其生物信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。其他可以作為配體經(jīng)Clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞相應(yīng)的中性粒細(xì)胞趨化受體，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)的方式的還有甲酰肽和白三烯B4。使用大量的CME藥理抑制劑抑制Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑可能減弱或抑制PMN介導(dǎo)的急性肺損傷[5]。(3)Clathrin調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生。已知Clathrin能夠介導(dǎo)G蛋白耦聯(lián)受體的內(nèi)吞[6]?；ㄉ南┧?leukotrienes B4，LTB4)是休克后腸系膜淋巴液中的一種炎性介質(zhì)，作為G蛋白耦聯(lián)受體的激動(dòng)劑，促進(jìn)中性粒細(xì)胞過(guò)氧化物的產(chǎn)生，與急性肺損傷的發(fā)展密切相關(guān)。高滲鹽水通過(guò)抑制Clathrin介導(dǎo)的活化的G蛋白耦聯(lián)受體內(nèi)吞，弱化中性粒細(xì)胞的激活效應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生，可能有助于減輕ARDS[7]。

4　Clathrin與肺內(nèi)巨噬細(xì)胞

肺內(nèi)巨噬細(xì)胞是ARDS的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一。(1)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用需要Clathrin包被小窩相關(guān)蛋白。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Clathrin抗體和AP2進(jìn)入鼠肺泡巨噬細(xì)胞抑制了酵母聚糖外殼和致敏紅細(xì)胞的內(nèi)吞作用；金剛烷胺(Clathrin抑制劑)能夠抑制Clathrin包被囊泡的出芽，抑制上述物質(zhì)的內(nèi)吞，證明肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用需要Clathrin介導(dǎo)的受體/膜成分的循環(huán)。在J774A.1巨噬細(xì)胞，可以通過(guò)松弛素D和MDC(Clathrin抑制劑)阻斷Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而抑制吞噬作用和大胞飲[8]。(2)Clathrin介導(dǎo)CD163-L1的內(nèi)化。CD163-L1屬于富含半胱氨酸蛋白家族的B組清道夫受體，當(dāng)單核細(xì)胞被巨噬細(xì)胞集落刺激因子激活變成巨噬細(xì)胞時(shí)，CD163-L1的表達(dá)增加。CD163-L1的功能是作為一種或多種配體的清道夫受體，可能在促炎癥消退中發(fā)揮一定作用。促炎介質(zhì)IL-4、IL-13、TNF-α和脂多糖(LPS)/干擾素γ(IFN-γ)能抑制CD163-L1的表達(dá)，CD163-L1是一種內(nèi)吞受體，其表達(dá)的下降可能是由于Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞[9]。(3)Clathrin/dynamin協(xié)助LPS介導(dǎo)的TRAM-TRIF信號(hào)通路。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)是廣泛分布在免疫細(xì)胞尤其是非特異免疫細(xì)胞及某些體細(xì)胞表面的一類模式識(shí)別受體。其中TLR4信號(hào)系統(tǒng)是清除細(xì)菌、預(yù)防致死性肺損傷和菌血癥的關(guān)鍵。TRL4識(shí)別LPS,激活TRAM-TRIF依賴的局部信號(hào)通路并啟動(dòng)LPS的內(nèi)化。使用MDC、dynamin抑制劑(DS)、核內(nèi)體酸化成熟抑制劑(CQ)使巨噬細(xì)胞內(nèi)吞功能紊亂。結(jié)果顯示，MDC和DS不但影響LPS的內(nèi)化，還減少了細(xì)胞因子和趨化因子的釋放和TRAM-TRIF介導(dǎo)的信號(hào)分子的激活[10]。

5　Clathrin與肺水腫

5.1肺泡內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運(yùn)ARDS的特征是肺泡內(nèi)富含蛋白水腫液的積聚，因此肺泡內(nèi)液體和蛋白的清除成為肺水腫恢復(fù)的關(guān)鍵。(1)Clathrin介導(dǎo)Na,K-ATP酶的內(nèi)吞。肺泡上皮細(xì)胞頂端膜的Na+通道和基底膜外側(cè)膜的Na,K-ATP酶的活動(dòng)在肺泡液體的清除中發(fā)揮重要作用。在肺損傷中所見(jiàn)的Na,K-ATP酶功能的降低是由于其從細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)池被降解造成的。低氧和活性氧刺激，導(dǎo)致Na,K-ATP酶 α亞基磷酸化觸發(fā)內(nèi)吞是一種Clathrin-AP2依賴的過(guò)程[11]。(2)Clathrin是水通道蛋白的載體。水通道蛋白(AQPs)是位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前人體的發(fā)現(xiàn)的AQPs有13種，其中AQP1、3、4、5表達(dá)于肺組織中。目前還未有關(guān)于Clathrin與AQP1、3、5關(guān)系的報(bào)道，但有研究發(fā)現(xiàn)在犬腎上皮細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)內(nèi)以酪氨酸為基礎(chǔ)的基底外側(cè)膜的分選信號(hào)通過(guò)與AP2復(fù)合體的μ亞基直接作用，決定AQP4 Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞[12]；Clathrin介導(dǎo)AQP2在主細(xì)胞基底膜的運(yùn)輸[13]；腎集合管中的AQP2定位于Clathrin包被小窩，通過(guò)降低Clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞的輔助蛋白(dynamin)的活性可以抑制AQP的內(nèi)吞[14-15]。根據(jù)以上報(bào)道推測(cè)肺內(nèi)AQPs的表達(dá)也與Clathrin有關(guān)，但仍欠缺有力的證據(jù)支持。(3)Clathrin調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的緊密連接和黏附連接。ARDS中上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能破壞，水、離子及各種分子的轉(zhuǎn)運(yùn)失衡。黏附連接(AJs)和緊密連接(TJs)是調(diào)節(jié)上皮極性和屏障功能的關(guān)鍵。閉合蛋白(claudins)被認(rèn)為是TJ結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵蛋白，其中claudin-1、claudin-5肽的衍生物，分別位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。claudin-1、claudin-5肽的攝取絕大多數(shù)是經(jīng)由Clathrin介導(dǎo)的[16]。Clathrin介導(dǎo)E-鈣黏蛋白的動(dòng)態(tài)循環(huán)。E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞黏附功能的中心組成成分，也在上皮的生長(zhǎng)和極性的建立中發(fā)揮重要作用，當(dāng)細(xì)胞外信號(hào)活動(dòng)破壞黏附連接時(shí)，E-鈣黏蛋白通過(guò)Clathrin進(jìn)入細(xì)胞。敲除Clathrin重鏈造成E-鈣黏蛋白極性的部分缺失。錨定蛋白(Ankyrin-G)和Clathrin協(xié)同控制E-鈣黏蛋白的內(nèi)化[17]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)T84細(xì)胞的其他AJs和 TJs蛋白(p120、β-catenins、occludin、JAM-1、claudins-1、claudins-4及ZO-1)的內(nèi)吞也經(jīng)Clathrin介導(dǎo)。

5.2肺泡水腫液蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)ARDS肺泡水腫液中的蛋白大部分是來(lái)源于毛細(xì)血管滲漏的清蛋白。培養(yǎng)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞對(duì)清蛋白的攝取是通過(guò)Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)的[18]。在A549細(xì)胞中，肺部給藥多聚-L-鳥(niǎo)氨酸(Poly-L-ornithine,PLO)后，PLO可以與FITC-清蛋白共同孵化，使清蛋白在細(xì)胞表面的結(jié)合和攝取明顯增強(qiáng)，促進(jìn)肺水腫的恢復(fù)。該效應(yīng)在存在Clathrin抑制劑時(shí)被明顯減弱[19]。已知Clathrin介導(dǎo)清蛋白的內(nèi)吞，PLO促進(jìn)清蛋白的吸收機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，其是否與Clathrin內(nèi)吞的增強(qiáng)有關(guān)還有待進(jìn)一步探索。

6　Clathrin與各細(xì)胞因子

ARDS的發(fā)生機(jī)制涉及各種炎癥細(xì)胞的激活、炎癥介質(zhì)的釋放、信號(hào)通路的啟動(dòng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如活化的中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、TNF、IL等，肺內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌TNF、IL、PAF等形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)多種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的發(fā)生[20]，已證實(shí)其中某些物質(zhì)和信號(hào)通路與Clathrin密切相關(guān)。(1)TNF-α誘發(fā)的炎癥信號(hào)需要Clathrin重鏈。TNF-α是介導(dǎo)ARDS的主要細(xì)胞因子，它不僅能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的活化、白細(xì)胞遷移，還能與其他細(xì)胞因子如IL-1協(xié)同激活肺部炎性細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，誘導(dǎo)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)增加。TNF受體1(TNFR1)募集多種激酶，最終使IκBα磷酸化，磷酸化的IκBα降解釋放活性NF-κB,其中多種受體需要Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞。敲除人類肺泡上皮細(xì)胞Clathrin重鏈，導(dǎo)致Iκα和P65磷酸化作用均顯著減弱，同時(shí)單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的產(chǎn)生也降低。關(guān)于TNF受體2(TNFR2)的內(nèi)吞途徑尚未完全知曉，但在TNFR2的細(xì)胞膜內(nèi)結(jié)構(gòu)中鑒定出的二亮氨酸基團(tuán)證明Clathrin介導(dǎo)TNFR2的內(nèi)吞[21]，表明Clathrin參與TNF-α誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路。(2)IL-1β的內(nèi)化涉及Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞。IL-1β為一種致炎細(xì)胞因子，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理?yè)p傷過(guò)程。IL-1與受體綁定結(jié)合組成IL-1RⅠ和配體蛋白IL-1RAc實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞效應(yīng)。此外IL-1與 IL-1RⅡ綁定結(jié)合使信號(hào)缺失的功能稱為誘餌效應(yīng)。IL-1的內(nèi)化是由誘餌受體(IL-1RⅡ)特異介導(dǎo)的，內(nèi)化需要消耗ATP且涉及Clathrin的內(nèi)吞作用[22]。(3)Clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路，參與維持生長(zhǎng)、發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)[23]。ARDS的終末階段是肺纖維化的發(fā)生。TGF-β1 是一個(gè)涉及多種器官的纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過(guò)與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復(fù)合物結(jié)合誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，Clathrin與TGF-β受體的內(nèi)吞和降解都密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)Clathrin的功能，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)Smad信號(hào)通路及TGF-β生物學(xué)作用的調(diào)控。使用Clathrin依賴的內(nèi)吞受體(dynamin)抑制劑，可以抑制TGF-β受體內(nèi)化和Smad2/3的磷酸化[24]。抑制Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞， TGF-βSmad信號(hào)通路被明顯抑制[25-26]。此外，Clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞參與調(diào)控溶酶體途徑的TGF-β受體的降解[27]。Clathrin內(nèi)化TGF-β受體是否參與了ARDS終末期肺纖維化的發(fā)生還需要更多的依據(jù)。(4)除了上述介紹的LTB4外，PAF、內(nèi)毒素、IL-18也都是通過(guò)G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)[5]，在炎癥過(guò)程中起著重要作用。

7　Clathrin參與肺泡膜磷脂代謝和自噬

肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白(surfactant-associated protein A,SP-A)是反映Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞功能的早期指標(biāo)和預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)，SP-A含量下降可作為ARDS高?；颊哳A(yù)警[28]。SP-A具有多種生物學(xué)功能，如參與肺泡表面活性物質(zhì)(PS)的形成及代謝；作為自身調(diào)節(jié)因子穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外PS的水平；限制血漿蛋白滲漏入肺泡腔，參與局部防御；調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)其趨化活性和氧自由基的產(chǎn)生等。相對(duì)于補(bǔ)體和免疫球蛋白，SP-A在肺泡內(nèi)含量較多，對(duì)肺部炎癥的調(diào)節(jié)具有重要意義。肺泡腔內(nèi)SP-A清除的主要途徑是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞重?cái)z取，攝取的SP-A部分進(jìn)入板層小體，再與新合成的SP-A共同分泌進(jìn)入肺泡腔[29]；還有部分與受體結(jié)合，經(jīng)Clathrin介導(dǎo)被巨噬細(xì)胞攝取降解[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，Clathrin與細(xì)胞自噬有關(guān)。禽流感病毒H5N1感染的患者通?；加袊?yán)重的肺炎，病情迅速進(jìn)展，最終發(fā)展成ARDS、呼吸衰竭。實(shí)驗(yàn)證明，H5N1假性病毒顆粒的血凝素(HA)不僅誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，也引發(fā)了A549細(xì)胞和小鼠肺組織細(xì)胞自噬。自噬介導(dǎo)的炎性反應(yīng)涉及NF-κB和p38MAPK信號(hào)通路的激活，需要Clathrin的參與[31]。

8　總　　結(jié)

Clathrin不僅涉及ARDS病理過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)，更廣泛參與人體多種生理過(guò)程，尚未發(fā)現(xiàn)參與全身和(或)肺部炎性反應(yīng)的Clathrin存在，因此靶向治療的可行性還有待鑒定。目前已發(fā)現(xiàn)多種Clathrin介導(dǎo)內(nèi)吞抑制劑，雖然部分體外細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Clathrin的功能對(duì)于ARDS或炎性反應(yīng)過(guò)程有一定的影響，但缺乏相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)依據(jù)，故Clathrin抑制劑在ARDS的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.038

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070052)。作者簡(jiǎn)介：劉俊彥(1990-)，在讀碩士，主要從事急性呼吸窘迫綜合征研究?！?/p>

，E-mail:lzhlyyhy@163.com。

R563.8

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1671-8348(2016)14-1981-04

2015-11-15

2016-02-29)