楊蕊旭,胡春秀,陳國鳳,孫長(zhǎng)貴,孫婉璐,陳光榆,潘勤,沈峰,許國旺,范建高
·乙型肝炎·
慢性乙型肝炎患者血清脂質(zhì)組學(xué)研究*
楊蕊旭,胡春秀,陳國鳳,孫長(zhǎng)貴,孫婉璐,陳光榆,潘勤,沈峰,許國旺,范建高
目的通過血清脂質(zhì)組學(xué)分析,研究CHB患者脂質(zhì)代謝特征。方法在健康人(n=23)和肝活檢證實(shí)的CHB患者(n=17),采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定血清脂質(zhì)組學(xué)代謝產(chǎn)物;構(gòu)建正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型,結(jié)合單因素分析篩選差異脂質(zhì)。結(jié)果CHB組與健康人脂質(zhì)代謝輪廓有顯著性差異[OPLS-DA: R2=0.775,Q2=0.518,P(CV-ANOVA)=2.81× 10-4],篩選出64種顯著改變的脂質(zhì)(VIP>1,P<0.05)。其中包括游離脂肪酸(FFA)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)、膽固醇酯(CE)、神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、縮醛磷脂酰乙醇胺(PlsEtn)等;CHB組DAG、CE、LPC、PlsEtn、Cer顯著降低(均值較健康人降低百分比分別為18%、17%、10%、32%和29%,P<0.05);TAG中含高碳原子數(shù)目、多不飽和鍵脂肪酸的TAG降低(P<0.05);飽和以及單不飽和鍵的PC升高,含多不飽和鍵的PC下降(P<0.05);CHB組游離單不飽和脂肪酸(F-MUFA)較健康人升高36%(P<0.05),且與METAVIR肝組織炎癥活動(dòng)和纖維化評(píng)分呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)性分析:活動(dòng)性r=0.527,P<0.05,纖維化r=0.540,P<0.05)。結(jié)論CHB患者脂質(zhì)代謝與正常人有顯著差異,脂質(zhì)組學(xué)分析可能為評(píng)價(jià)肝臟炎癥活動(dòng)和纖維化程度提供無創(chuàng)診斷依據(jù)。
慢性乙型肝炎;脂質(zhì)組學(xué);超高效液相色譜;串聯(lián)質(zhì)譜
在全球范圍內(nèi),乙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要病因之一[1]。在我國,慢性乙型肝炎(CHB)是主要的導(dǎo)致肝硬化及肝細(xì)胞癌的疾病[2]。肝活檢作為評(píng)估肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn),但因取樣誤差或可能存在的并發(fā)癥等原因在臨床上應(yīng)用受限,而血清無創(chuàng)診斷研究如血清標(biāo)志物、血清診斷模型、組學(xué)等在慢性肝病的評(píng)估中具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)而逐漸受到重視[3]。脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要分支,可定性定量地研究生物體脂質(zhì)代謝產(chǎn)物,可為疾病脂質(zhì)代謝特征的評(píng)估、發(fā)病機(jī)制的研究、血清標(biāo)志物的篩選提供新的研究策略[4]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析了CHB患者和健康成人血清脂質(zhì)組學(xué)狀況,旨在探討CHB患者脂質(zhì)代謝的特點(diǎn),并初步分析其作為判斷CHB患者肝臟炎癥活動(dòng)和纖維化程度診斷的潛在指標(biāo)的可能性。
1.1 研究對(duì)象2012年1月至2013年6月于上海新華醫(yī)院和北京解放軍第302醫(yī)院診治的CHB患者17例,男性9例,女性8例;平均年齡(38.2± 3.3)歲。診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷,即既往有乙型肝炎病史或者HBsAg陽性超過6個(gè)月,現(xiàn)血清HBsAg和(或)HBV DNA陽性,肝活檢組織病理學(xué)檢查提示慢性肝炎[5]。排除其它嗜肝病毒感染、先天性、自身免疫性、藥物、毒物、酒精性肝病和糖尿病。另選23例健康成人,男性14例,女性9例;平均年齡(39.9±1.2)歲,無酒精濫用(每日飲酒量小于20克乙醇)、慢性肝病病史,肝功能正常,腹部超聲和Fibroscan檢測(cè)正常。本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者給出知情同意書,并遵照《赫爾辛基宣言》的原則實(shí)施研究。
1.2 檢測(cè)和檢查使用7600-120型自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)檢測(cè)肝功能、血脂、空腹血糖;使用Fibroscan(法國Echos公司)檢測(cè)肝硬度(LSM)和受控衰減參數(shù)(CAP)。對(duì)CHB患者采用18 G一次性活檢穿刺針(美國BARD生物系統(tǒng)公司)在超聲定位下行肝臟穿刺,病理標(biāo)本經(jīng)3名病理學(xué)專家采用METAVIR評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)分期。
1.3 血清脂質(zhì)組學(xué)分析在采樣前,要求研究對(duì)象避免劇烈運(yùn)動(dòng)、飲酒和咖啡等。采集空腹靜脈血。采用甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇提取體系預(yù)處理血清。為評(píng)價(jià)測(cè)定過程的穩(wěn)定性,將質(zhì)量控制(QC)樣本穿插在分析序列中。采用超高效液相色譜(美國Waters)和四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(TripleTOF 5600,美國AB SCIEX)測(cè)定。色譜條件:色譜分離柱UPLC ACQUITY C18(2.1 mm× 100 mm×1.7μm),柱溫55℃,流動(dòng)相A:乙腈/水(比例3/2),流動(dòng)相B:異丙醇/乙腈(比例9/1),流動(dòng)相A、B含10 mM乙酸銨,流速:0.26 ml/min。質(zhì)譜條件:ESI正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù):離子源電壓分別為4500 V(-)和5500 V(+),去簇電壓為100 V(-)和100 V(+),接口加熱器溫度為600℃(-)和500℃(+)。應(yīng)用Analyst TF、LipidView、PeakView、MultiQuant系列軟件(美國AB SCIEX)采集數(shù)據(jù)、定性、定量分析。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SIMCA-P 13.0(瑞典Umetrics)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用UV轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù),構(gòu)建正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型,進(jìn)行總結(jié)、分類及判別分析,采用7次交叉驗(yàn)證檢測(cè)模型可靠性。根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重值(VIP),初步篩選CHB患者血清顯著變化的代謝物。應(yīng)用SPSS 22.0(美國SPSS)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以(±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(正態(tài)分布的數(shù)據(jù))或Mann-Whitney U檢驗(yàn)(非正態(tài)分布數(shù)據(jù))進(jìn)行單因素分析,計(jì)數(shù)資料以百分比表示,采用卡方檢驗(yàn),聯(lián)合VIP值>1和P<0.05篩選差異脂質(zhì)。
2.1 一般情況與健康人比,CHB患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等指標(biāo)和LSM顯著升高(P<0.05),而BMI、白蛋白、膽固醇、載脂蛋白則較健康人低(P<0.05),兩組性別、年齡、腰圍、空腹血糖,CAP等指標(biāo)則無顯著性差異(P>0.05,表1)。
表1 研究對(duì)象基本資料(n,±s)
表1 研究對(duì)象基本資料(n,±s)
與健康人比,①P<0.05 BMI:體質(zhì)指數(shù);LSM:肝臟硬度測(cè)定;CAP:受控衰減參數(shù)
2.2 脂質(zhì)組學(xué)多元分析結(jié)果基于UPLC-MS/MS分析40例研究對(duì)象血清,共定性定量檢出239種脂質(zhì)。質(zhì)量控制樣本99%離子峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<30%,表明所測(cè)得的代謝物整體表現(xiàn)穩(wěn)定。數(shù)據(jù)經(jīng)過UV轉(zhuǎn)換后,建立OPLS-DA模型得分圖(圖1),可見CHB組與健康人血清脂質(zhì)分布有明顯差異。7次交叉驗(yàn)證所得模型穩(wěn)定性指標(biāo)R2=0.775,預(yù)測(cè)性指標(biāo)Q2=0.518,說明模型分類預(yù)測(cè)性和可重復(fù)性較高;P(CV-ANOVA)=2.81×10-4,表明組別分離程度顯著。結(jié)合VIP值與單因素分析,篩選出64種差異脂質(zhì)。顯著差異的分子主要包括長(zhǎng)鏈多不飽和鍵的三酰甘油(TAG)下降,飽和以及單不飽和鍵的磷脂酰膽堿(PC)升高,多不飽和鍵的PC下降,部分分子量的二酰甘油(DAG)、膽固醇酯(CE)、神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(PlsEtn)下降,部分分子量的磷脂酰肌醇(PI)升高(表2)。
圖1 慢性乙型肝炎和健康人OPLS-DA得分圖
表2 慢性乙型肝炎與健康人差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物比較
表2 續(xù)表
2.3 CHB患者血清脂質(zhì)組學(xué)改變CHB患者血清總脂質(zhì)與健康人比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);CHB患者游離單不飽和脂肪酸(F-MUFA)較健康人顯著升高(P<0.05);CHB患者DAG(P<0.05)和CE(P<0.005)較健康人顯著下降。在鞘脂中,乙型肝炎患者Cer和部分SM較健康人顯著降低(P<0.005,圖2A、B,表2)。在磷脂中,CHB患者LPC(P<0.05)和縮醛磷脂,如PlsEtn(P<0.005)較健康人顯著下降,總PC、PE、PI與健康人比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);PC/PE比值較健康人顯著下降(P<0.05)。慢性乙型肝炎患者高碳原子數(shù)目和大于三個(gè)不飽和鍵數(shù)目的TAG較健康人顯著下降(P<0.05,圖2C、D,表2)。
圖2 慢性乙型肝炎患者血清脂質(zhì)代謝的變化
2.4 不同肝組織病理學(xué)評(píng)分患者血清脂質(zhì)分析根據(jù)METAVIR評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)CHB患者肝組織炎癥活動(dòng)度,將慢性乙型肝炎患者分為低炎癥活動(dòng)組(METAVIR活動(dòng)性0~1分)10例和高炎癥活動(dòng)組(METAVIR活動(dòng)性2~3分)7例,發(fā)現(xiàn)高炎癥活動(dòng)組F-MUFA較低炎癥活動(dòng)組顯著升高(P<0.05,圖3A);以F-MUFA(>1.215)區(qū)別不同炎癥程度的AUC為0.883(95%CI:0.717~1.000),相關(guān)性分析提示F-MUFA與活動(dòng)性評(píng)分呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)性分析:r=0.527,P=0.036);11例慢性乙型肝炎顯著纖維化(METAVIR纖維化2~4分)患者F-MUFA水平較6例非顯著纖維化(METAVIR纖維化0~1分)患者顯著升高(P<0.05,圖3B);以F-MUFA(>1.346)區(qū)別不同纖維化程度的AUC為0.800(95%CI: 0.570~1.000),且F-MUFA與纖維化評(píng)分呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)性分析:r=0.540,P=0.032)。
圖3 不同肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度CHB患者血清游離單不飽和脂肪酸水平比較
有研究報(bào)道CHB患者肝脂肪變與代謝因素相關(guān)而與病毒因素不相關(guān)[6]。亦有研究報(bào)道,慢性HBV感染與代謝綜合征的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[7],CHB患者血清TAG水平、HDL水平較非感染者降低,而血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素升高,且與病毒載量相關(guān)[8,9]。另一方面,有研究報(bào)道CHB患者合并代謝綜合征可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[10]。
CHB患者血清含高碳原子數(shù)目和多不飽和鍵的TAG顯著下降,意味著長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸減少,可能與慢性炎癥使細(xì)胞抗氧化能力、細(xì)胞增殖和存活能力改變有關(guān)。慢性HBV和HCV感染者多不飽和脂肪酸的補(bǔ)充可減少肝細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[11]。CHB組F-MUFA較健康人顯著升高,意味著硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)活性升高。SCD1作為飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的重要限速酶,其活性與脂質(zhì)代謝密切相關(guān),可能成為一個(gè)治療靶點(diǎn)[12]。
鞘脂是細(xì)胞膜和脂蛋白的組成部分,同時(shí)也參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等過程的調(diào)控。CHB和肝硬化患者SM水平下降[13]。本研究發(fā)現(xiàn),CHB組多數(shù)Cer和SM較健康人顯著降低,可能與SM水解增多,合成受抑制有關(guān)。CHB組超長(zhǎng)鏈Cer顯著降低,而長(zhǎng)鏈Cer與超長(zhǎng)鏈Cer有相反的生理特性,長(zhǎng)鏈Cer升高與超長(zhǎng)鏈Cer下降可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。血清特定分子量Cer和SM與HBV感染導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)MELD評(píng)分、肝活檢炎癥分級(jí)以及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)Cer和SM在CHB患者下降,但與肝臟組織炎癥和纖維化程度以及HBV DNA水平并無顯著性相關(guān)。
本研究CHB組多數(shù)LPC較健康人下降。LPC作為與細(xì)胞增殖、炎癥相關(guān)的重要信號(hào)分子,在慢性肝病和肝細(xì)胞癌患者下降[17],而PlsEtn作為縮醛磷脂,是內(nèi)源性抗氧化劑,與細(xì)胞抗氧化能力相關(guān)[18]。CHB組PLsEtn下降可能意味著抗氧化能力下降。含飽和以及單不飽和鍵的PC升高,說明脂質(zhì)從頭合成過程增多,而作為細(xì)胞膜的組成部分,多不飽和PC下降可導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)流動(dòng)性下降和抗氧化能力下降。PC/PE比值下降意味著PE生成增多、PC生成減少或者磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PEMT)活性降低,導(dǎo)致PE向PC轉(zhuǎn)換減少。該酶表達(dá)的減少往往與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝細(xì)胞增生以及肝細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān)[19,20]。
通過UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)CHB患者血清脂質(zhì)組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)CHB患者脂類代謝如三酰甘油、鞘脂、磷脂分布、縮醛磷脂以及脂肪酸等的代謝有顯著改變,這些脂質(zhì)代謝的差異可能與CHB患者細(xì)胞凋亡、增生、抗氧化能力改變相關(guān)。結(jié)合CHB患者肝臟組織炎癥、纖維化程度與脂質(zhì)相關(guān)性的分析,可為尋找潛在的無創(chuàng)診斷血清標(biāo)志物提供依據(jù)。
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(收稿:2016-05-17)
(本文編輯:陳從新)
Serum lipidom icanalysis of patients with chronic hepatitis B
Yang Ruixu,Hu Chunxiu,Chen Guofeng,et al.Center for Fatty Liver Study,
Department of Gastroenterology,XinHua Hospital,Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China
Fan Jiangao.E-mail:fattyliver2004@126.com
Objective The aim of this study was to investigate serum lipid profiling of patients with chronic hepatitis B(CHB).M ethods A ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/ MS)platform was applied for serum lipid profiling in 17 patients with CHB and 23 healthy volunteers.Orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA)model and univariate analysis were established to analyze the characteristic metabolites and the association with histological severities.Resu lts There were significant lipids changes in the CHB patients[OPLS-DA:R2=0.775,Q2=0.518,P(CV-ANOVA)=2.81×10-4],and 64 lipids with significant differences(VIP>1,P<0.05)between the two groups were found;These lipids belonged to categories of free fatty acid(FFA),triglyceride(TAG),diglyceride(DAG),cholesterol ester(CE),ceramide(Cer),sphingomyelin(SM),phosphatidylcholine(PC),phosphatidylinositol(PI),lysophosphatidylcholine(LPC),ethanolamine plasmalogen(PlsEtn);There were lower levels of CE,DAG,Cer,LPC,PlsEtn in CHB(decreased by 18%,17%,10%,32%and 29%,P<0.05);TAG with higher carbon numbers and double bonds significantly decreased(P<0.05);PC with lower double bonds significantly increased and PC with higher double bonds decreased(P<0.05);The free monounsaturated fatty acids increased in CHB(increased by 36%,P<0.05)and were positively correlated with the METAVIR inflammation and fibrosis scores(Spearman correlation r=0.527,P<0.05 in activity,r=0.540,P<0.05 in fibrosis). Conclusion The patients with CHB have numerous changes in lipid metabolism,and the lipidomic profiling may provide possible non-invasive method for the evaluation of hepatic injuries in patients with CHB.
Hepatitis B;Lipidom ics;Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.006
國家973課題(編號(hào):2012CB517501);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81270491/81470840);上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):10411956300);上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃(編號(hào):XBR2011007)
200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科暨脂肪肝診治中心(楊蕊旭,孫婉璐,陳光榆,潘勤,沈峰,范建高);中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所/中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(胡春秀,許國旺);解放軍第302醫(yī)院肝纖維化診療中心(陳國鳳);江蘇省昆山市錦溪人民醫(yī)院(孫長(zhǎng)貴)
楊蕊旭,女,25歲,博士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病相關(guān)研究。E-mail:ruixu.yang@hotmail.com
范建高,E-mail:fattyliver2004@126.com