杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期數(shù)字基因表達(dá)譜分析

荊　騰,王　淋,烏云塔娜,杜紅巖*

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心,鄭州 450003;2 國(guó)家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心,鄭州 450003)

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杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期數(shù)字基因表達(dá)譜分析

荊騰1,2,王淋1,2,烏云塔娜1,2,杜紅巖1,2*

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心,鄭州 450003;2 國(guó)家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心,鄭州 450003)

摘要:為在轉(zhuǎn)錄水平解析杜仲葉片發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)模式,該研究通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)‘華仲6號(hào)’杜仲葉片從展葉(4月)到落葉(10月)不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較分析,共獲得差異基因3 002個(gè),其中1 764個(gè)表達(dá)量上調(diào),1 238個(gè)下調(diào),這些差異表達(dá)基因主要行使催化、氧化還原等功能,參與代謝過(guò)程和生物過(guò)程等;進(jìn)一步Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),苯丙素類(lèi)生物合成途徑相關(guān)基因被富集,其中調(diào)控綠原酸合成的6個(gè)基因差異表達(dá)顯著;對(duì)這些基因表達(dá)模式進(jìn)行分析顯示,4月中旬和9月中旬基因的表達(dá)量較高,暗示這兩個(gè)時(shí)期對(duì)于綠原酸的合成具有重要作用。熒光定量RT-PCR檢測(cè)6個(gè)綠原酸合成相關(guān)基因和12個(gè)隨機(jī)選擇的差異表達(dá)基因,驗(yàn)證結(jié)果顯示表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果可靠。該研究結(jié)果為揭示杜仲葉片在不同發(fā)育時(shí)期的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為深入解析杜仲綠原酸合成機(jī)理,進(jìn)而通過(guò)分子育種手段提高杜仲綠原酸含量提供新的路徑。

關(guān)鍵詞:杜仲葉片;數(shù)字基因表達(dá)譜;差異基因;綠原酸

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是中國(guó)特有的名貴木本藥用樹(shù)種,在中國(guó)27個(gè)省(市、自治區(qū))均有栽培[1]。長(zhǎng)期以來(lái),人們以杜仲皮入藥,其具有降壓、補(bǔ)腎、強(qiáng)筋骨、保肝利膽、清熱解毒等功效[2-4]。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)杜仲葉和杜仲皮的化學(xué)成分基本一致,具有同等功效,可以以葉代皮入藥[5]。杜仲葉作為一種中藥材已收錄于2010版《中華人民共和國(guó)藥典》。苯丙素類(lèi)是杜仲中主要的藥用活性成分之一,是衡量杜仲葉片藥用價(jià)值的重要指標(biāo)。迄今為止,杜仲中發(fā)現(xiàn)的苯丙素類(lèi)共11種[6],其中研究最多的是綠原酸,綠原酸抗菌作用強(qiáng),具有消炎、止血、抗腫瘤、降壓等多種藥理作用[7]。

過(guò)去對(duì)杜仲葉片的研究主要集中在化學(xué)成分的提取、測(cè)定和藥理功效方面,在基因水平的研究相對(duì)較少。近年來(lái),杜仲全基因組測(cè)序工作已初步完成,并將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到了杜仲研究領(lǐng)域,為杜仲數(shù)字基因表達(dá)譜的研究奠定了基礎(chǔ)。由于基因的表達(dá)受時(shí)間、空間和內(nèi)外因子的影響,是一復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,而基因表達(dá)譜的分析正是通過(guò)對(duì)基因時(shí)空表達(dá)的分析來(lái)探索生物體內(nèi)復(fù)雜的生理過(guò)程[8]。

本研究應(yīng)用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)對(duì)杜仲葉片從展葉(4月)到落葉(10月)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)情況進(jìn)行分析,以相鄰2個(gè)時(shí)期為對(duì)照,分別檢測(cè)各個(gè)比較組合中的差異表達(dá)基因,應(yīng)用生物信息學(xué)方法初步分析了這些差異基因所行使的功能和參與的代謝途徑,以期了解杜仲葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制,獲得綠原酸生物合成途徑相關(guān)的酶基因,為相關(guān)基因的克隆與鑒定,進(jìn)而為提高杜仲綠原酸含量的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料及處理

試驗(yàn)材料選自國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開(kāi)發(fā)中心(河南鄭州)的‘華仲6號(hào)’枝條,根據(jù)該樹(shù)葉片以往生長(zhǎng)發(fā)育特性,分別于2014年4月18日、5月18日、6月17日、7月17日、8月16日和9月20日選形態(tài)特征基本一致的葉片,迅速采集并放入液氮冷凍,后移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1總RNA提取純化及文庫(kù)構(gòu)建總RNA提取、純化和文庫(kù)構(gòu)建委托北京諾禾致源公司完成。

1.2.2測(cè)序數(shù)據(jù)分析高通量測(cè)序(Illumina HiSeqTM2000/MiseqTM)得到的原始序列經(jīng)去接頭、去除不確定堿基信息比例大于10%的reads、去除低質(zhì)量(質(zhì)量值sQ≤5的堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度50%以上的reads)篩選得到過(guò)濾序列,用于后續(xù)分析。通過(guò)測(cè)序Phred數(shù)值、GC含量等評(píng)估測(cè)序質(zhì)量;用TopHat2軟件將過(guò)濾后的測(cè)序序列進(jìn)行基因組定位分析;采用HTSeq軟件對(duì)各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析,使用的模型為union。采用RPM和RPKM[9]值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,將歸一化后的表達(dá)數(shù)據(jù)作為分析對(duì)象。并采用DESeq方法[10]篩選出5個(gè)比較組合的差異表達(dá)基因,并對(duì)所有差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析。

1.2.3熒光定量RT-PCR檢測(cè)為檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的可靠程度,本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)6個(gè)綠源酸合成相關(guān)的基因以及隨機(jī)選取12個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定,其中12個(gè)基因?yàn)閺腅u518 vs Eu418比較組合中隨機(jī)選取的6個(gè)顯著下調(diào)基因;從Eu920 vs Eu816比較組合中隨機(jī)選取的6個(gè)顯著上調(diào)基因。杜仲葉片各個(gè)時(shí)期樣品RNA采用QiAgen公司RNA提取試劑盒(RNeasy Plant mini Kit)提取,cDNA第一鏈合成根據(jù)Inviterogen公司的SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄成第一鏈,依據(jù)數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序所得序列,通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,內(nèi)參基因采用Actin(表1)。熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s、60 ℃退火34 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,以內(nèi)參基因在不同時(shí)期葉片中的表達(dá)量為1.0,采用2-△△Ct法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析計(jì)算。實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估

為分析杜仲葉片不同時(shí)期基因表達(dá)情況,構(gòu)建了EuL418、EuL518、EuL617、EuL717、EuL816和EuL920共6個(gè)cDNA文庫(kù)。對(duì)6個(gè)文庫(kù)進(jìn)行RNA測(cè)序,結(jié)果(表2)表明,6個(gè)文庫(kù)經(jīng)HiSeq2000/MiSeq高通量測(cè)序后得到的過(guò)濾序列分別為7 221 314、6 380 685、6 711 140、6 610 038、6 503 411和3 778 568,各占原始序列的99.47%、99.19%、99.28%、99.44%、95.59%和97.23%(測(cè)序錯(cuò)誤率≤0.1%)。比例接近,且均達(dá)95.59%以上,說(shuō)明cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序質(zhì)量較高,去除雜質(zhì)后的過(guò)濾序列可用于后續(xù)分析。

表1　熒光定量RT-PCR基因信息

表2　數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況一覽表

注:原始序列.高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù);過(guò)濾序列.過(guò)濾后的序列數(shù)據(jù);過(guò)濾堿基.過(guò)濾序列的個(gè)數(shù)乘以長(zhǎng)度,并轉(zhuǎn)化為以G為單位;測(cè)序錯(cuò)誤率.平均堿基錯(cuò)誤率;Q20、Q30.分別計(jì)算Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比;.GC含量.計(jì)算堿基G和C的數(shù)量和占總的堿基數(shù)量的百分比。

Note:Raw reads.Original data from the high-throughput sequencing;Clean reads.Sequence data after raw reads were filtered;Clean bases.Number of sequeneces times length of sequences,then converted to units of G,that is total number of bases;Error rate.Average error rate of sequencing;Q20 and Q30.Bases of phred values greater than 20 and 30 are calculated as a percentage of total bases;GC content.Percentage of bases of G and C to total bases.

利用TopHat2軟件,將上述過(guò)濾序列對(duì)比到杜仲基因組序列,結(jié)果(表3)表明,6個(gè)cDNA文庫(kù)樣品得到的過(guò)濾序列中,分別有95.83%、96%、95.03%、95.1%、94.45%和95.27%的過(guò)濾序列可匹配到杜仲參考基因組。說(shuō)明測(cè)序結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性,滿足下一步數(shù)據(jù)分析要求。

2.2葉片發(fā)育不同時(shí)期基因表達(dá)差異分析

2.2.1不同發(fā)育時(shí)期差異基因的篩選在測(cè)序、組裝和注釋基礎(chǔ)上,將不同發(fā)育時(shí)期杜仲葉片進(jìn)行基因表達(dá)對(duì)比分析。本試驗(yàn)以杜仲葉片發(fā)育相鄰2個(gè)時(shí)期為1個(gè)對(duì)照組合,共設(shè)計(jì)了5個(gè)對(duì)照組合,即EuL518 vs EuL418、EuL617 vs EuL518、EuL717 vs EuL617、EuL816 vs EuL717和EuL920 vs EuL816,來(lái)探究葉片不同發(fā)育時(shí)期差異基因。歸一化數(shù)據(jù)利用DESeq分析從差異倍數(shù)和顯著水平2個(gè)方面設(shè)定閾值進(jìn)行差異基因篩選,其中滿足|log2|>1 且校正值P<0.05為差異表達(dá)基因。根據(jù)5個(gè)組合篩選所得的差異表達(dá)基因(DEGs)列表繪制Venn圖,結(jié)果(圖1)表明,杜仲葉片不同時(shí)期產(chǎn)生的DEGs共計(jì)3 002個(gè),占杜仲基因組總數(shù)的11.23%,其中有1 764個(gè)基因表達(dá)量上調(diào),1 238個(gè)基因表達(dá)量下調(diào),且5個(gè)相鄰時(shí)期組合中沒(méi)有共同的差異基因。在EuL518 vs EuL418的1 989個(gè)DEGs中,有上調(diào)基因780個(gè),下調(diào)基因1 209個(gè);在EuL617 vs EuL518的415個(gè)DEGs中,有上調(diào)基因271個(gè),下調(diào)基因144個(gè);在EuL717 vs EuL617的78個(gè)DEGs中,有上調(diào)基因46個(gè),下調(diào)基因32個(gè);在EuL816 vs EuL717的258個(gè)DEGs中,有上調(diào)基因133個(gè),下調(diào)基因125個(gè);在EuL920 vs EuL816的820個(gè)DEGs中,有上調(diào)基因534個(gè),下調(diào)基因286個(gè)。隨著杜仲葉片的發(fā)育,各個(gè)比較組合的差異基因數(shù)量各不相同,EuL518 vs EuL418組合差異基因數(shù)最多,占總DEGs的66.26%,而EuL717 vs EuL617組合差異基因數(shù)最少,僅占總DEGs的2.6%。

表3　測(cè)序序列與杜仲基因組比對(duì)情況一覽表

注:測(cè)序序列總數(shù).測(cè)序序列經(jīng)過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后的數(shù)量統(tǒng)計(jì)(過(guò)濾序列);被定位序列總數(shù).能定位到基因組上的測(cè)序序列的數(shù)量;多次定位序列數(shù).在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量;定位到正鏈序列數(shù)、定位到負(fù)鏈序列數(shù).測(cè)序序列比對(duì)到基因組上正鏈或負(fù)鏈的數(shù)量;完整比對(duì)序列數(shù).為整段比對(duì)到外顯子的測(cè)序序列數(shù)量;分段比對(duì)序列數(shù).被定位序列中分段比對(duì)到2個(gè)外顯子上的測(cè)序序列數(shù)量。

Note:Total reads.Number of filtered sequencing sequences(clean data);Total mapped.Number of mapped sequencing sequences;Multiple mapped.Number of sequences multiple mapped on reference sequences;Uniquely mapped.Number of sequences uniquely mapped on reference sequence;Reads map to ‘+’,Reads map to ‘-’.Number of sequences mapped on positive and minus strands of the genome;Non-splice reads.Number of sequences mapped in whole on an exons;Splice reads.Number of sequences mapped segmentedly on two exons in mapped sequences.

圖1　差異基因Venn圖

2.2.2不同發(fā)育時(shí)期差異基因的GO富集分析對(duì)差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能注釋,可以確定差異基因及基因產(chǎn)物所在的細(xì)胞位置、分子功能以及參與的生物過(guò)程。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同發(fā)育時(shí)期杜仲葉片差異基因的功能及差異顯著基因的GO富集發(fā)現(xiàn),5個(gè)相鄰的比較組合分別獲得1 394、585、212、413和954個(gè)GO注釋。其中,屬于生物過(guò)程分別為725、303、110、201和497個(gè);屬于細(xì)胞組分分別為146、54、19、35和109個(gè);屬于分子功能分別為523、228、83、177和348個(gè)。

另外,篩選在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO分類(lèi)(P≤0.005),結(jié)果(表4)可以看出,不同組合顯著富集的基因數(shù)量相差很大,所行使的功能也不盡相同。其中EuL518 vs EuL418比較組合顯著富集的基因數(shù)最多,其中基因行使的主要分子功能是代謝活動(dòng)和氧化還原活動(dòng),較多參與了生物過(guò)程和代謝過(guò)程;而EuL717 vs EuL617比較組合沒(méi)有被顯著富集的基因。

2.2.3不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因的Pathway富集分析Pathway富集分析主要是確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,為了研究杜仲葉片不同階段發(fā)育時(shí)期中Pathway富集基因的變化規(guī)律,對(duì)相鄰2個(gè)時(shí)期差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway富集的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖2),在EuL518 vs EuL418比較組合里共鑒定出105條代謝路徑,注釋到934個(gè)基因。通路主要集中在代謝通路、次生代謝物合成、丙酮酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、類(lèi)胡蘿卜素合成、黃酮類(lèi)合成等,其中最顯著富集的通路為次生代謝物合成,所涉及基因占總注釋基因的12.4%;在EuL617 vs EuL518比較組合里共鑒定出51條代謝路徑,注釋到179個(gè)基因。通路主要集中在苯丙素類(lèi)生物合成、光合作用、次生代謝物的合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等,其中最顯著富集的通路為苯丙素類(lèi)生物合成,所涉及基因占總注釋基因的5.0%;在EuL717 vs EuL617比較組合里共鑒定出19條代謝路徑,共注釋到37個(gè)基因。通路主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)過(guò)程、苯丙氨酸及酪氨酸和色氨酸的合成、精氨酸和脯氨酸的代謝、苯丙素類(lèi)生物合成等,其中最顯著富集的通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)過(guò)程,所涉及基因占總注釋基因的10.8%;在EuL816 vs EuL717比較組合里共鑒定出29條代謝路徑,共注釋到69個(gè)基因。通路主要集中在次生代謝物的合成、苯丙素類(lèi)生物合成、淀粉和蔗糖代謝、亞麻酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,其中最顯著富集的通路為苯丙素類(lèi)生物合成,所涉及基因占總注釋基因的8.7%;在EuL920 vs EuL816比較組合里共鑒定出84條代謝路徑,共注釋到397個(gè)基因。通路主要集中在光合作用相關(guān)蛋白、苯丙素類(lèi)生物合成、次生代謝物的合成、檸檬酸循環(huán)等,其中最顯著富集的通路為光合作用相關(guān)蛋白,所涉及基因占總注釋基因的2.0%。綜上5組差異基因通路的富集可以看出,杜仲葉片在不同發(fā)育時(shí)期,進(jìn)行著各種生物合成和代謝活動(dòng),多與各種次生代謝物質(zhì)的合成代謝相關(guān),說(shuō)明杜仲葉片在發(fā)育的同時(shí)合成積累大量的活性物質(zhì)。

表4　差異基因的GO功能顯著性富集結(jié)果

A.Eu518 vs Eu418比較組合;B.Eu617 vs Eu518比較組合;C.Eu717 vs Eu617比較組合;

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)

圖4　DGE測(cè)序結(jié)果和RT-PCR表達(dá)量比對(duì)

2.2.4杜仲綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因發(fā)掘?qū)Σ煌l(fā)育時(shí)期杜仲葉片DGE數(shù)據(jù)進(jìn)行Pathway富集性分析發(fā)現(xiàn),共有6個(gè)基因與綠原酸生物合成相關(guān),其中包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)基因3個(gè);肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxilase,C4H)基因1個(gè);香豆酰-CoA連接酶(4-hydroxycinnamoyl-CoA ligase,4CL)基因1個(gè);香豆酸-3-羥基化酶(coumaroylquinate 3′-monooxygenase,C3H)基因1個(gè)。不同時(shí)期基因的表達(dá)量顯示,6個(gè)與杜仲綠原酸合成相關(guān)的基因在不同時(shí)期的葉片發(fā)育中均有表達(dá),其中4月和9月中旬這2個(gè)時(shí)期基因表達(dá)量相對(duì)較高(圖3)。

2.3熒光定量RT-PCR分析

利用相對(duì)定量法,從Eu518 vs Eu418組合(Eu418為對(duì)照)中將上述6個(gè)與杜仲綠原酸合成相關(guān)的基因(EuPAL1、EuPAL2、EuPAL3、EuC4H、Eu4CL、EuC3H)以及隨機(jī)選擇的6個(gè)顯著下調(diào)的基因(A-F),和從Eu920 vs Eu816組合(Eu816為對(duì)照)中隨機(jī)選擇的6個(gè)顯著上調(diào)的基因(G-L),表達(dá)量改變倍數(shù)的對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較(圖4),結(jié)果顯示:這18個(gè)基因RT-PCR表達(dá)量改變倍數(shù)和DGE結(jié)果雖然不完全成比例,但上下調(diào)趨勢(shì)完全相同,大體趨勢(shì)基本一致。說(shuō)明這次數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果具有較高的可信度。

3討論

數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)能快速檢測(cè)植物在不同組織細(xì)胞、不同發(fā)育階段以及在眾多逆境環(huán)境脅迫下基因的表達(dá)差異,因此,數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)在功能基因組學(xué)方面正在發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)杜仲葉片不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的差異基因進(jìn)行了比較研究,并將差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和Pathway途徑分類(lèi),為進(jìn)一步研究杜仲藥用的分子機(jī)理提供了必要的數(shù)據(jù)平臺(tái),為研究基因表達(dá)變化和多種活性成分之間的關(guān)系奠定了研究基礎(chǔ)。

通過(guò)杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),不同時(shí)期,杜仲葉片的差異基因的數(shù)量相差懸殊,行使的功能也不盡相同,說(shuō)明杜仲葉片在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在著豐富多樣的生化進(jìn)程。在EuL518 vs EuL418中,共檢測(cè)到DEGs 1 989個(gè),為5個(gè)對(duì)比組合中數(shù)量最多的,而據(jù)研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉片從展葉到基本停止生長(zhǎng)僅需要1個(gè)月左右,葉片大小在5月中旬就基本保持恒定不變[12-13],說(shuō)明從4月中旬到5月中旬這一時(shí)期杜仲葉片外部形態(tài)和內(nèi)部基因表達(dá)都發(fā)生了明顯的變化。通過(guò)差異基因GO富集分析發(fā)現(xiàn),這一時(shí)期的葉片中含有大量與微管合成、膜合成、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組分相關(guān)的基因,而這些基因的表達(dá)正是參與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)、快速生長(zhǎng)的必要原料,因此,推測(cè)杜仲葉片在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞組分相關(guān)基因表達(dá)來(lái)影響葉片的生長(zhǎng)。在EuL518 vs EuL418比較組合里共鑒定出105條代謝路徑,其中最顯著富集的通路為次生代謝物的合成,并且其中大多數(shù)次生代謝物途徑相關(guān)酶基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá);而EuL617 vs EuL518、EuL717 vs EuL617和EuL816 vs EuL717三個(gè)比較組合DEGs相對(duì)較少,經(jīng)Pathway富集到的次生代謝物途徑中相關(guān)的DEGs的數(shù)也很少;EuL920 vs EuL816比較組合的DEGs數(shù)量突然增多,且被Pathway富集到的次生代謝物途徑中相關(guān)的DEGs大多數(shù)為上調(diào)。經(jīng)大量杜仲葉中次生代謝物的成分測(cè)定發(fā)現(xiàn),從5月到8月期間杜仲葉片內(nèi)的次生代謝物變化處于相對(duì)平穩(wěn)階段,9月開(kāi)始部分次生代謝物含量又開(kāi)始上調(diào)[14-17],推測(cè)杜仲葉片內(nèi)次生代謝物的增長(zhǎng)速率與其合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)性。我們可以根據(jù)這些基因的變化從中篩選出感興趣的基因作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

苯丙素類(lèi)化合物是杜仲中主要的藥用活性成分,其中綠原酸作為苯丙素類(lèi)重要的化合物之一,已得到了高度的重視[6,18]。迄今為止,杜仲中發(fā)現(xiàn)的苯丙素類(lèi)化合物共11種,其中研究最多的是綠原酸,甚至有研究者認(rèn)為綠原酸的含量直接決定著杜仲的利用價(jià)值[19]。目前,對(duì)杜仲綠原酸的研究主要集中在藥理活性檢測(cè)和成分提取方面,從基因表達(dá)水平對(duì)其進(jìn)行研究鮮有報(bào)道,因此,本研究試圖利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)分析杜仲葉片中綠原酸代謝通路,確定相關(guān)酶基因。本研究中共發(fā)掘出6個(gè)與綠原酸合成相關(guān)的酶基因。其中,苯丙氨酸解氨酶(PAL),已被大量實(shí)驗(yàn)證明是綠原酸合成所必須的關(guān)鍵酶[20-21];肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和香豆酰-CoA連接酶(4CL)是綠原酸奎寧酸和咖啡酰輔酶A縮合途徑[22]與綠原酸香豆?？鼘幩崃u基化途徑[23]共同上游關(guān)鍵酶;而香豆酸-3-羥基化酶(C3H)在綠原酸香豆酰奎寧酸羥基化合成途徑中,可直接催化p-香豆?？鼘幩嵘删G原酸的關(guān)鍵酶基因[23]。對(duì)這6個(gè)基因的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn),不同基因在杜仲葉片發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),但表達(dá)差異相對(duì)較大,具有明顯的偏好性,并以4月和9月基因的表達(dá)量較高。一般而言,基因表達(dá)量相對(duì)較高,且表達(dá)規(guī)律與綠原酸合成一致的基因可能就是關(guān)鍵的綠原酸合成調(diào)控基因。前人研究認(rèn)為,杜仲葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中綠原酸含量變化規(guī)律為4月中旬到5月中旬是杜仲葉片中綠原酸含量增長(zhǎng)速度最快的階段,隨后一直到9月中下旬期間,綠原酸的含量變化相對(duì)較平緩,值得注意的是,從9月中下旬開(kāi)始,綠原酸的含量增長(zhǎng)速度突然上升[24]。EuPAL1和EuPAL2在4月中旬和9月中下旬的表達(dá)量顯著增高,這2個(gè)基因的表達(dá)變化模式剛好與綠原酸含量變化規(guī)律相吻合,呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢(shì),而EuPAL3只在9月中下旬有表達(dá)較高,說(shuō)明同一家族基因成員在功能上應(yīng)存在冗余;EuC4H和Eu4CL與EuPALs的基因表達(dá)模式相近,說(shuō)明對(duì)杜仲葉片中綠原酸的合成應(yīng)起到主要的作用;較比其他基因,EuC3H基因的表達(dá)量相對(duì)較低,因此,推測(cè)EuC3H基因通過(guò)香豆?？鼘幩崃u基化合成途徑合成綠原酸應(yīng)不是合成綠原酸的主要途徑,這一結(jié)果與何柳相一致[25]。

植物數(shù)量性狀的變化是由多個(gè)基因或者基因家族共同控制作用的結(jié)果,是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜又協(xié)調(diào)有序的過(guò)程。單個(gè)基因表達(dá)情況的改變不足以反映特定功能或通路的整體變化情況,但是,個(gè)別功能重要的基因(主效基因)具有“Hub”節(jié)點(diǎn)的重要特性,它的功能改變可能對(duì)于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。本研究首次利用DGE技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上解析杜仲葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中差異基因的表達(dá)模式以及功能分類(lèi),并分析了與杜仲葉片中重要藥用活性成分綠原酸合成相關(guān)的酶基因,以期對(duì)杜仲綠原酸主效基因的篩選奠定理論基礎(chǔ),為挖掘杜仲中控制其它性狀的關(guān)鍵基因提供參考,并為深入研究杜仲次生代謝產(chǎn)物的生物合成與代謝調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Analysis of Digital Gene Expression aboutEucommiaulmoidesOliver Leaves at Different Developmental Stages

JING Teng1,2,WANG Lin1,2,WUYUN Tana1,2,DU Hongyan1,2*

(1 Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry,Zhengzhou 450003,China;2 The Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration,Zhengzhou 450003,China)

Abstract:To clarify the gene expression patterns of Eucommia ulmoides Oliver leaves in the process of development at the transcription level,this study compared and analyzed the gene expression level of ‘Huazhong 6’ leaves in different development periods from expanding (April) to falling (October) by digital gene expression profile technology.A total of 3 002 different expression genes were obtained,in which 1 764 up-regulated expression and 1 238 down-regulated expression.These mainly function referred to catalytic activity or oxidoreductase activity,and involved in metabolic process and biological process.Through further pathway enrichment analysis,we found that several related genes of phenylpropanoid biosynthesis pathway were enriched,in which six significantly different expression genes were related to chlorogenic acid synthesis.The gene expression patterns showed that these genes are highly expressed in mid-April and mid-Septemeber,which suggested that these two periods play an important role for chlorogenic acid synthesis.By real-time fluorescent quantitative PCR,6 chlorogenic acid synthesis genes and 12 randomly different expression genes were detected,and the results verified the reliability of digital gene expression profile.This study lays a solid foundation for revealing the molecular regulation mechanism of E.ulmoides Oliver leaves in different development periods,and provides the reference for further clarifying the synthesis mechanism of E.ulmoides Oliver chlorogenic acid and then improve E.ulmoides Oliver chlorogenic acid content by means of molecular breeding.

Key words:Eucommia ulmoides Oliver leaf;digital gene expression profile;different expression gene;chlorogenic acid

中圖分類(lèi)號(hào):Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:荊騰(1991-),男,在讀碩士研究生,主要從事杜仲育種研究。E-mail:tengshanj315@163.com*通信作者:杜紅巖,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事杜仲育種、栽培與綜合利用的研究。E-mail:dhy515@126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃(2012BAD21B0502);國(guó)家公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201004029)

收稿日期:2015-11-06;修改稿收到日期:2015-12-10

文章編號(hào):1000-4025(2016)02-0257-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0257