4種發(fā)根農(nóng)桿菌對朱砂根組培無菌葉片毛狀根誘導(dǎo)的影響

胡　菊,毛美琴,楊　君,但　方,馬明東

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院,成都 611130)

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4種發(fā)根農(nóng)桿菌對朱砂根組培無菌葉片毛狀根誘導(dǎo)的影響

胡菊,毛美琴,楊君,但方,馬明東*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院,成都 611130)

摘要:以朱砂根(Ardisia crenata Sims)組培無菌葉片為材料,用4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分別侵染進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo),比較朱砂根葉片毛狀根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基種類、預(yù)培養(yǎng)時間、侵染方式、共培養(yǎng)時間以及不同發(fā)根農(nóng)桿菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根無菌葉片毛狀根誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基,預(yù)培養(yǎng)2 d、共培養(yǎng)2 d,毛狀根誘導(dǎo)率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼葉和活化好的菌液(100 mg/L AS)一起在28 ℃、180 r/min黑暗條件下共振蕩8～15 min。(3)4種發(fā)根農(nóng)桿菌均能誘導(dǎo)朱砂根葉片毛狀根產(chǎn)生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小順序依次為ATCC15834>A4>LBA9402>R1601。(4)PCR分子鑒定表明,發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA已成功整合到宿主細(xì)胞核基因組中。

關(guān)鍵詞:朱砂根;組培無菌葉片;發(fā)根農(nóng)桿菌;毛狀根

朱砂根(ArdisiacrenataSims)是隸屬于紫金?？?Myrsinaceae)紫金牛屬(Ardisia)的雙子葉常綠小灌木[1],是中國傳統(tǒng)的觀賞藥用植物,分布于長江流域各省以及福建、臺灣等地[2]。作為園林觀賞植物,是紫金牛屬植物中最具觀果、觀葉價值的代表種之一[3-4];而作為傳統(tǒng)藥用植物,利用歷史已有四五百年,在《中國藥典》(1997年版)中,是被收載記錄的紫金牛屬2種藥用植物之一[5],通過理化鑒定、顯色反應(yīng)等顯示其主要藥用成分為巖白菜素和三萜皂苷[6-7],且具有成為繼喜樹堿和紫杉醇之后的新一代抗HIV和抗腫瘤的天然藥物的重大潛力[8]。

目前對朱砂根的研究主要集中在藥理、藥材鑒定、化學(xué)成分分析方面,少有離體組織培養(yǎng)。隨著基因工程的發(fā)展,已在多種植物上利用發(fā)根農(nóng)桿菌成功誘導(dǎo)了毛狀根,紅豆杉[9]、喜樹[10]、銀杏[11]、杜仲[12]、烏桕[13]等是木本植物中最具代表性的。朱砂根三萜皂苷主要存在于其根部,而其它部位含量相對較低[14],發(fā)根中含有和原植物中相同或相似,含量相當(dāng)或略高甚至更多,以及分化程度、遺傳穩(wěn)定性高且不易變異的次生代謝產(chǎn)物[15],還可從發(fā)根培養(yǎng)物中尋找新的化合物。建立毛狀根培養(yǎng)體系,可以為朱砂根三萜皂苷的生產(chǎn)提供一條新途徑。因此,通過分子生物技術(shù)手段進(jìn)行朱砂根毛狀根誘導(dǎo)顯得十分迫切與必要。再者,目前在朱砂根上應(yīng)用基因工程技術(shù)的研究相比于其他一些植物遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后,建立一種高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系,是朱砂根進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)。但目前尚未見報道有關(guān)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)朱砂根的研究。

本研究以朱砂根組培無菌葉片為受體,用4種發(fā)根農(nóng)桿菌A4、ATCC15834、R1601和LBA9402分別侵染,并進(jìn)行PCR分子鑒定。為后續(xù)試驗準(zhǔn)備豐富的試驗材料,奠定朱砂根遺傳轉(zhuǎn)化與利用發(fā)根體系生產(chǎn)朱砂根有用次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ),為朱砂根可持續(xù)開發(fā)利用及其次生代謝物質(zhì)(三萜皂苷)的高效、規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐,也為其它木本植物進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化提供借鑒。

1材料和方法

1.1實驗材料

朱砂根無菌苗在成都市農(nóng)林科學(xué)院林科所組培室,按照馬明東等[16]方法培育朱砂根無菌苗。

A4、ATCC15834、R1601和LBA9402均購自于ATCC(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心),在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院分子實驗室進(jìn)行活化、超低溫保存以及侵染轉(zhuǎn)化。

1.2實驗方法

1.2.1菌液制備及活化將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的4種發(fā)根農(nóng)桿菌分別進(jìn)行YMB固體平板劃線,28 ℃暗培養(yǎng)1～2 d后挑取單菌落轉(zhuǎn)入3 mL YMB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min暗培養(yǎng)活化24 h后,吸取0.5～1.0 mL菌液轉(zhuǎn)入50 mL YMB液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、180 r/min黑暗振蕩培養(yǎng),如此反復(fù)進(jìn)行3次活化后,測定菌液OD600值達(dá)0.5～0.8時,收集菌液,用于侵染,對照組使用無菌水代替菌液。

1.2.2朱砂根葉片毛狀根的誘導(dǎo)選取朱砂根健壯組培無菌葉片,用A4、ATCC15834、R1601和LBA9402分別進(jìn)行侵染,誘導(dǎo)毛狀根的產(chǎn)生,篩選毛狀根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基種類、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間、侵染方式等,并對毛狀根進(jìn)行形態(tài)和PCR分子檢測。

若無特別說明,幼葉的葉正面向上放置;預(yù)培養(yǎng)溫度設(shè)為(25±1) ℃,黑暗培養(yǎng)。共培養(yǎng)溫度設(shè)為(28±1) ℃,黑暗培養(yǎng)。除菌培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,光照8 h/d,光強1 500～2 000 lx。侵染的菌液以及共培養(yǎng)基均添加100 mg/L AS。發(fā)根時間從侵染的當(dāng)天開始算起。每組試驗生物學(xué)重復(fù)3次,結(jié)果取其平均值,CK則用無菌水代替菌液。

毛狀根誘導(dǎo)率(%)= 產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%

(1)基本培養(yǎng)基用活化好的OD600值為0.5～0.8的4種發(fā)根農(nóng)桿菌,分別侵染朱砂根無菌葉片(近似1 cm×1 cm),比較MS、1/2MS培養(yǎng)基對發(fā)根誘導(dǎo)的影響,觀察比較發(fā)根時間及毛狀根特點。

(2)預(yù)培養(yǎng)時間預(yù)培養(yǎng)的目的是使被侵染的外植體細(xì)胞處于感受狀態(tài),利于發(fā)根農(nóng)桿菌的吸附、轉(zhuǎn)移和整合。預(yù)培養(yǎng)時間設(shè)為0、1、2和3 d。

(3)侵染方式采用3種侵染方式:(Ⅰ)用無菌針管吸取活化好的菌液在剪好的葉片上進(jìn)行針刺劃線;(Ⅱ)將剪好的葉片浸泡在活化好的菌液中;(Ⅲ)將剪好的葉片和活化好的菌液一起28 ℃、180 r/min黑暗共振蕩8～15 min。

(4)共培養(yǎng)時間發(fā)根農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合都是在共培養(yǎng)時間段內(nèi)完成的,因此整個侵染轉(zhuǎn)化過程中共培養(yǎng)時間的確定是最重要的環(huán)節(jié)之一。共培養(yǎng)時間設(shè)為1、2和3 d。

(5)毛狀根的檢測毛狀根檢測主要包括兩方面,即形態(tài)特征檢測和PCR分子檢測。形態(tài)特征檢測,主要記錄和觀察出根初始狀態(tài)、根形態(tài)及顏色、向地性、長度等,并與組培苗根、自然根比較來進(jìn)行初步判斷。而分子檢測則是收獲毛狀根,隨機選取少量用于PCR分子檢測。

發(fā)根的分子檢測,選用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)提取發(fā)根農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA,而采用改良CTAB法[17]提取朱砂根毛狀根和無菌苗組培根的基因組總DNA。用于PCR的rolA基因正向引物為FrolA(5′-CGTTGTCGGAATGGCCCAGACC-3′),反向引物為RrolA(5′-CGTAGGTCTGAATATTCCGGTCC-3′)。將質(zhì)粒DNA、毛狀根DNA、無菌苗組培根DNA進(jìn)行PCR擴增。選用PCR擴增體系25 μL:Buffer 2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,上下游引物各1.0 μL,Taq酶0.35 μL,ddH2O 16.2 μL,模板DNA 2.0 μL。PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;34個循環(huán),72 ℃保溫延伸5 min,4 ℃下保存。

在PCR擴增產(chǎn)物中加入5 μL Loading Buffer,發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物為陽性對照,朱砂根無菌苗組培根DNA擴增產(chǎn)物為陰性對照,用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳。電泳結(jié)果用EB染色10 min后于凝膠成像系統(tǒng)(UV260 nm)下紫外燈掃描觀察分析。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基篩選

從表1可以得知,1/2 MS培養(yǎng)基是朱砂根葉片毛狀根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基,不僅出根時間早、根突點數(shù)量多且生長情況良好。說明不同無機鹽濃度的MS培養(yǎng)基對毛狀根的誘導(dǎo)有著極大的影響,而MS培養(yǎng)基對發(fā)根的誘導(dǎo)效果較差,這可能與其所含無機鹽濃度過高有關(guān),推測朱砂根毛狀根適合在含稍低無機鹽濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上生長。因此,后續(xù)試驗選用1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行侵染。

2.2預(yù)培養(yǎng)時間篩選

從表2可得知,預(yù)培養(yǎng)2 d是最佳預(yù)培養(yǎng)時間,不僅發(fā)根誘導(dǎo)率最高達(dá)32%,而且出根時間早、數(shù)量多且生長狀況良好。適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)時間可以提高轉(zhuǎn)化率,這可能是因為外植體經(jīng)過一定時間的預(yù)處理可以減輕發(fā)根農(nóng)桿菌在侵染過程中對其造成的脅迫傷害,并且能將要轉(zhuǎn)化的外植體細(xì)胞進(jìn)一步調(diào)整到適宜侵染的生理狀態(tài)即感受狀態(tài)。處于感受狀態(tài)的細(xì)胞對發(fā)根農(nóng)桿菌更敏感,更容易整合外源DNA,從而有利于Ri質(zhì)粒T-DNA的轉(zhuǎn)移,提高侵染能力,進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。

表1　不同培養(yǎng)基對毛狀根誘導(dǎo)的影響

表2　預(yù)培養(yǎng)時間對毛狀根誘導(dǎo)的影響

2.3侵染方式比較

從表3可以得知,3種侵染方式均能成功誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根,但方式Ⅲ誘導(dǎo)率(36.67%)較其它2種方式高得多,是最佳侵染方式。這可能是因為,針刺增加了劃傷,使外植體更容易褐化死亡;浸泡雖然可以增加與菌株的接觸時間,但是并不代表會有更多的菌株進(jìn)入外植體;共振蕩不僅增加了各個外植體與菌株的接觸面積,而且同樣增加了單個外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌的接觸時間,從而增加了二者的親和性,即增加接觸機會,因此轉(zhuǎn)化率得到了提高。

2.4共培養(yǎng)時間篩選

從表4可以得知,共培養(yǎng)2 d是最佳共培養(yǎng)時間,毛狀根誘導(dǎo)率最高,可以達(dá)到31.87%;3 d的誘導(dǎo)率次之為12.36%;而1 d的誘導(dǎo)率僅為8.13%。由此可知,在侵染試驗中適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)時間有利于提高外植體轉(zhuǎn)化率,但共培養(yǎng)時間過長,發(fā)根農(nóng)桿菌大量生長會造成外植體嚴(yán)重?fù)p傷,從而降低毛狀根的誘導(dǎo)率。

2.5不同菌株對葉片轉(zhuǎn)化的比較

從表5和圖1可以看出,4種菌株對朱砂根葉片的侵染能力是不同的,其大小順序是:ATCC15834>A4>LBA9402>R1601。ATCC15834、A4菌株的致根能力明顯比R1601、LBA9402強得多,分別為35.56%、29.35%,相同條件下,R1601、LBA9402對葉片誘導(dǎo)率低。4種菌株對朱砂根葉片有不同的轉(zhuǎn)化能力,這可能與其所含Ri質(zhì)粒的性質(zhì)有關(guān),即ATCC15834、A4菌株的Ri質(zhì)粒上編碼誘導(dǎo)發(fā)根的T-DNA片段比R1601、LBA9402菌株更容易轉(zhuǎn)移整合到朱砂根細(xì)胞核基因組中去;還有可能是因為朱砂根外植體對發(fā)根農(nóng)桿菌有一定的選擇性、敏感性。

2.6毛狀根檢測

2.6.1毛狀根形態(tài)檢測從表6可以看出,朱砂根發(fā)根顏色偏淡,多為乳白色或乳黃色,粗細(xì)因菌株類型而異。叢狀或簇狀根突點產(chǎn)生的較細(xì)發(fā)根能夠繼續(xù)發(fā)育分化產(chǎn)生分支,生長良好,而較粗毛狀根一般在1 cm左右長時停止生長。

2.6.2毛狀根分子檢測從PCR凝膠電泳分析圖(圖2、3)分析,根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA上的rolA基因合成上、下游PCR引物,以毛狀根基因組DNA為模板(3～6號為4個重復(fù)),菌株Ri質(zhì)粒總DNA為陽性對照,朱砂根組培苗根總DNA為陰性對照,從毛狀根的總DNA中擴增出了與陽性對照菌株Ri質(zhì)?？侱NA擴增的特異性T-DNA片段大小一致約258 bp左右的特異性DNA片段。即A4、ATCC 15834所含的rolA基因目的條帶已經(jīng)轉(zhuǎn)移并整合到了朱砂根葉片毛狀根基因組中。

表3　不同侵染方式對毛狀根誘導(dǎo)的影響

表4　不同共培養(yǎng)時間對發(fā)根誘導(dǎo)的影響

表5　不同菌株對葉片轉(zhuǎn)化的比較

圖1　不同發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根

菌株Strain顏色Color粗細(xì)Thickness有無分支Branchornot向地性Geotropism其它OtherA4乳黃色Creamyellow細(xì)小SlenderYesNo生長良好,叢狀根突點多,可繼代培養(yǎng)Grewwell,morefasciculaterootpoints,successiveculture15834淡乳黃色Lightcreamyellow細(xì)小SlenderYesNo生長良好,簇狀根突點產(chǎn)生分支Grownwell,andtheclustersofrootpointscouldproducebranches9402乳白色Milkwhite較粗Thick--長至1cm左右停止生長Stopgrowinguntil1cmR1601乳白色Milkwhite較粗Thick--根突點少,未除菌徹底時就停止生長Lessrootpoints,notasepticthor-oughlywhentheystopgrowing

M.DL1000;1.A4的rolA擴增產(chǎn)物(陽性對照);2.組培苗根rolA

毛狀根的檢測是對侵染結(jié)果的檢驗。本試驗中4種發(fā)根農(nóng)桿菌都能侵染朱砂根無菌葉片,從形態(tài)上判斷都是毛狀根,而對A4、ATCC15834侵染幼葉產(chǎn)生的毛狀根進(jìn)行的PCR分子檢測,同樣證實了發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA已整合進(jìn)入宿主細(xì)胞。

M.DL1000;1.ATCC15834的rolA擴增產(chǎn)物(陽性對照);

3討論

自然界中,植物被認(rèn)為是大量具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物生物合成的化學(xué)工廠,但利用完整植株進(jìn)行分離提取會對植物自然種質(zhì)資源造成巨大威脅。由于遺傳穩(wěn)定、生長迅速等使得毛狀根培養(yǎng)成為植物細(xì)胞培養(yǎng)中一個引人注目的體系,不僅可以避免因過度開發(fā)而對自然資源生物多樣性造成損壞,還可以不依賴于季節(jié)性和地理差異性。本研究成功獲得了激素自主、多分支的朱砂根毛狀根,這使得開發(fā)并利用朱砂根毛狀根進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)其所含的次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷具有了可能性和發(fā)展?jié)摿?。毛狀根的誘導(dǎo)受到多種因素的影響,包括外植體種類、培養(yǎng)基種類、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間、侵染方式、菌株種類及活性等。

3.1培養(yǎng)基種類、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間對毛狀根誘導(dǎo)的影響

毛狀根的生長對不同培養(yǎng)基成分表現(xiàn)出一定的差異性[18]。陳永芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)在1/2 MS、MS、B5等固體或液體培養(yǎng)基中,MS液體培養(yǎng)基最有利于新疆紫草毛狀根誘導(dǎo)。郭生虎等[20]研究表明烏拉爾甘草在1/2 MS、MS、B5、1/2 B5培養(yǎng)基中的1/2 MS培養(yǎng)基上生長最好、增殖率最高為79.2%。本研究中1/2 MS培養(yǎng)基更有利于朱砂根毛狀根誘導(dǎo),同樣是對不同培養(yǎng)基成分效應(yīng)的適應(yīng)的結(jié)果。

大量研究表明,預(yù)培養(yǎng)時間對毛狀根誘導(dǎo)率有一定的影響。王麗等[21]探討龍葵毛狀根誘導(dǎo)的研究表明不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)誘導(dǎo)率最低,預(yù)培養(yǎng)2 d誘導(dǎo)率最高,而3 d、4 d則依次降低。本研究中預(yù)培養(yǎng)2 d可提高朱砂根毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)32%。共培養(yǎng)時間也是影響毛狀根誘導(dǎo)率的一個方面。于艷麗等[22]對小金海棠的研究表明過早(1 d)轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng),雖可有效抑制細(xì)菌增殖,但明顯降低了誘導(dǎo)率;過晚(4 d),細(xì)菌過度增殖,導(dǎo)致除菌較困難且誘導(dǎo)率大幅下降;適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)時間(2 d)則可達(dá)最佳效果。本研究結(jié)果與此結(jié)果一致,共培養(yǎng)2 d朱砂根毛狀根誘導(dǎo)率最高為31.87%。發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所進(jìn)行的組織培養(yǎng)不同于純粹的組織培養(yǎng),需要經(jīng)過外植體吸附菌株、外植體與菌株共培養(yǎng),因此選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間有助于提高發(fā)根誘導(dǎo)率。

3.2不同菌株對毛狀根誘導(dǎo)的影響

不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株具有不同的致根能力,可能與不同菌株對不同宿主細(xì)胞的敏感性不同有關(guān)[23]。Moumita等[24]選用3種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株(ATCC15834、A4、LBA9402)以及2種外植體種類(葉片和莖段)對紫花丹進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo),結(jié)果表明ATCC15834侵染葉片誘導(dǎo)的毛狀根出現(xiàn)時間最早、轉(zhuǎn)化頻率最高。發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA片段上Vir區(qū)編碼的產(chǎn)物肩負(fù)接收外界信號、加工T-DNA、轉(zhuǎn)移及整合等功能,因此,不同Ri質(zhì)粒類型決定發(fā)根農(nóng)桿菌不同的致根能力。王躍華等[25]選用A4、R1601、ATCC15834、R1000對川黃柏的毛狀根研究表明ATCC15834致根效果最好。Wu[26]在對杜仲無菌真葉毛狀根誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn),所選的5種菌株LBA9402誘導(dǎo)率最高為100%,ATCC15834次之為80%,其次是ATCC39207、ATCC31798,而ATCC11325最低為0。本研究選用的4種發(fā)根農(nóng)桿菌A4、ATCC15834、LBA 9402、R1601均是農(nóng)桿堿型菌株,致根能力最強,是建立發(fā)根培養(yǎng)體系的首選菌株[27],結(jié)果也表明對于朱砂根無菌幼葉而言,4種菌株均能侵染,但致根能力不同,最有效的是菌株ATCC15834。

3.3毛狀根的形態(tài)為非典型毛狀根

本研究中所獲得的毛狀根均無根毛,為非典型毛狀根,這與李想韻等[28]獲得的桑樹毛狀根形態(tài)相一致。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物誘導(dǎo)的毛狀根存在很大的異質(zhì)性,究其原因最可能是Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段轉(zhuǎn)移整合到植物細(xì)胞核基因組中是隨機的,T-DNA片段整合到同一條染色體的不同位點上或者不同染色體上,產(chǎn)生的發(fā)根的性狀都會不同,可能只有其中一種或幾種整合方式能夠表現(xiàn)出符合我們需要的性狀。

乙酰丁香酮、光照、蔗糖濃度、外源激素等都會影響毛狀根誘導(dǎo)。例如乙酰丁香酮是農(nóng)桿菌毒性基因的酚類誘導(dǎo)劑之一。添加此化學(xué)試劑,發(fā)現(xiàn)可提高根癌農(nóng)桿菌對擬南芥和顛茄的轉(zhuǎn)化率[29-30]。研究顯示,乙酰丁香酮對發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胡蘿卜[31]有促進(jìn)作用。因此研究過程中加入適量的乙酰丁香酮有助于提高發(fā)根的誘導(dǎo)率。

本研究首次對園林觀賞藥用植物朱砂根進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo),選用的培養(yǎng)基、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間、侵染方式、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株等是適合朱砂根葉片毛狀根誘導(dǎo)的。本試驗雖成功誘導(dǎo)了毛狀根,但是從數(shù)量和質(zhì)量上都有待提高,且很多介導(dǎo)因素還需更加完善,尤其是發(fā)根繼代和增殖培養(yǎng)。要想使朱砂根的遺傳轉(zhuǎn)化研究取得長足發(fā)展,達(dá)到理想的轉(zhuǎn)化水平,需進(jìn)一步從相關(guān)因素著手分析原因,優(yōu)化毛狀根離體培養(yǎng),從而去探尋新的生物視野。

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(編輯:宋亞珍)

封面植物介紹——陜西羽葉報春

陜西羽葉報春(Primula filchnerae Knuth)隸屬于報春花科報春花屬,一年生草本,株高8～40 cm,全株被多細(xì)胞柔毛。地上莖短或者近于無,須根少數(shù)或多數(shù)。葉多枚簇生,葉片卵形或卵狀披針形,帶葉柄長3.5～15 cm,寬2～5 cm,先端圓鈍,羽狀全裂,羽片3～4對,長8～25 mm,小裂片再不整齊淺裂；裂片兩面均密生灰白色短茸毛;葉柄長2.5～5.5 cm,被腺毛,基部寬扁?；ㄝ愀?～40 cm,常1～多數(shù)自葉叢中抽出,中空,外被銀白色粗腺毛。傘形花序具3～10(～12)花,花梗長1.5～2.5 cm；苞片線狀披針形,長8～10 mm;花萼圓錐狀,長5～10 mm,外被粗毛,寬約4 mm,先端5～6裂,裂片披針形,果期增大成圓錐狀鐘形；花冠初開時為紫色,開放后為粉紅色,冠檐直徑1.5～2.5 cm,下部呈管狀,管部長5～8 mm,冠筒長于花萼約1/4;上部花冠于花萼外5深裂,裂片倒心形,每裂片先端再2淺裂,裂片先端圓,粉紅并略帶藍(lán)紫色,裂片基部有倒心形先為橘黃色后漸變?yōu)樽霞t色的彩斑。花柱異長,長花柱花：雄蕊著生于冠筒近中部,花絲短或者近無；花藥黃色；花柱長約6～8 mm,柱頭略高于筒口；短花柱花：雄蕊常生于近花冠裂口處內(nèi)側(cè)；花柱內(nèi)藏于花冠筒下部,長4～5 mm,柱頭圓形,綠色。子房球狀,胚珠多數(shù),特立中央胎座。蒴果球形,外果皮膜質(zhì),成熟后不裂或者頂裂；種子圓球狀,直徑1.5 mm,成熟后黑褐色,有皺紋?；ㄆ?～4月,果期3～5月。

陜西羽葉報春為中國特有物種,陜西省地方重點保護植物。一般生于海拔900～1 000 m天然次生落葉闊葉林下、濕潤且多砂石土壤上。分布地較為狹窄,自1904年2月德國植物學(xué)家W.Filchner在陜西南部的秦嶺山區(qū)采到模式標(biāo)本后,百余年來再未見到存活的植物。2006年在湖北省重新發(fā)現(xiàn),2015年3月在陜西省也被重新發(fā)現(xiàn)。

(圖文由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張建強提供)

Four Kinds ofAgrobacteriumrhizogeneson Sterile Leaves Induction ofArdisiacrenataSims

HU Ju,MAO Meiqin,YANG Jun,DAN Fang,MA Mingdong*

(College of Landscape Architecture,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

Abstract:With sterile leaves of Ardisia crenata Sims by tissue culture as explants,we performed hairy root induction by using four kinds of Agrobacterium rhizogenes strains,named A4,ATCC15834,LBA9402,R1601,respectively.The investigation selected optimal media types,pre-culture time,infection ways,co-culture time,and the ability of A.rhizogenes on hairy root induction.The study showed that 1/2 MS was the better medium for sterile leaves on hairy root induction,and hairy root induction rate was the highest (31.87%) under pre-cultured 2 d and co-cultured 2 d.It was the best way for infection that put sterile leaves and bacteria which was supplied with AS (100 mg/L) co-shake under dark,28 ℃ and 180 r/min for 8 to 15 min.All of the four strains could induce hairy root on A.crenata Sims,but ATCC15834 was the most effective strain,and A4 followed it.For ATCC15834,A4,LBA9402 and R1601,the ability of hairy root induction on A.crenata Sims was declining in turn.It demonstrated that T-DNA on Ri plasmid of A.rhizogenes had been integrated into the genome of the host cell successfully through molecular identification by PCR.

Key words:Ardisia crenata Sims;sterile leaves;Agrobacterium rhizogenes;hairy root

中圖分類號:Q813.1+2;Q785

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:胡菊(1986-),女,在讀博士研究生,主要從事園林植物培育與利用。E-mail:1029191614@qq.com*通信作者:馬明東,教授,碩,博士生導(dǎo)師,主要從事園林植物培育與利用。E-mail:1670364138@qq.com

基金項目:四川省教育廳攻關(guān)項目(2006A016)

收稿日期:2015-11-20;修改稿收到日期:2016-01-13

文章編號:1000-4025(2016)02-0411-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0411