丹皮酚對肝癌HepG2/ADM細(xì)胞株多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

孫愛華，陳勁，關(guān)恒明，李平

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001；2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥醫(yī)院·合肥市第二人民醫(yī)院)

?

·論著·

丹皮酚對肝癌HepG2/ADM細(xì)胞株多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

孫愛華1,2，陳勁2，關(guān)恒明2，李平1

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001；2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥醫(yī)院·合肥市第二人民醫(yī)院)

摘要：目的探討丹皮酚體外給藥對肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/阿霉素(ADM)多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能分子機(jī)制。方法 采用人的肝癌細(xì)胞株HepG2,體外ADM濃度遞增法誘導(dǎo)建立耐藥肝癌細(xì)胞HepG2/ADM 耐藥模型。分別用0、5、10、25、50、100 μmol/L的丹皮酚培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2/ADM、HepG2細(xì)胞48 h,選定25、50 μmol/L丹皮酚進(jìn)行下一步實驗。分別采用ADM(0.01、0.2、0.5、0.75、1.5、3.0 μmol/L)和氟尿嘧啶(0、1、2、4、10、20、40 μmol/L)單獨刺激，及25、50 μmol/L丹皮酚聯(lián)合上述各濃度的氟尿嘧啶及ADM聯(lián)合刺激2種細(xì)胞株。采用MTT法檢測HepG2/ADM、HepG2細(xì)胞的增殖水平，流式細(xì)胞儀檢測HepG2/ADM、HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞毒藥物含量，蛋白免疫印跡法檢測腫瘤細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)水平。結(jié)果ADM抑制HepG2/ADM、HepG2細(xì)胞株的IC50依次為1.48、124.14 μmol/L，耐藥指數(shù)為83.9；丹皮酚(25、50 μmol/L)能夠明顯增強(qiáng)ADM、氟尿嘧啶對HepG2/ADM細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用，并降低IC50值(P均<0.01)，但對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用無明顯影響；丹皮酚(25、50 μmol/L)能夠明顯增加HepG2/ADM細(xì)胞株對ADM的攝取能力(P均<0.01)，但對HepG2細(xì)胞株無明顯影響；丹皮酚能顯著降低HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)水平(P均<0.01)，但對HepG2細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白水平無明顯影響。結(jié)論 丹皮酚對HepG2/ADM細(xì)胞株多藥耐藥性具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，可能與其抑制HepG2/ADM 細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)、增加細(xì)胞毒藥物細(xì)胞內(nèi)攝取有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；HepG2/阿霉素細(xì)胞株；丹皮酚；多藥耐藥；P-糖蛋白

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制未完全闡明[1]。目前臨床用于治療肝癌的化療藥物療效差，不良反應(yīng)明顯[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，P-糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是導(dǎo)致常規(guī)化療藥物藥效較低的主要原因。丹皮酚是中藥牡丹根皮、徐長卿全草的主要活性成分，具有抗心律失常、預(yù)防動脈粥樣硬化、抑制血小板聚集、抗腫瘤和抗炎等多種藥理活性[4，5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚不僅對腫瘤細(xì)胞株具有顯著抑制作用，同時還可以增加人白血病細(xì)胞株K562/阿霉素(ADM)對化療藥物的敏感性[7]，提示丹皮酚可能會逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象。2015年6~10月，本文初步探討了丹皮酚對人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM是否具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用以及其潛在的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料HepG2細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。藥物與試劑：丹皮酚購自宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度99%，批號：100321；ADM(純度>98%)、氟尿嘧啶(純度>98%)、維拉帕米(VRP)(純度>98%)、溴化-3購自美國Sigma公司；DMEM購自美國Gibco公司；鼠抗人P-gp抗體購自美國Abcam公司；β-actin 抗體和化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Bradford蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，其余試劑均為分析純。實驗儀器：BioTek ELx800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；FACSCanto流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；3427型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM模型的建立及培養(yǎng)耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM參照ADM濃度梯度倍增進(jìn)行誘導(dǎo)[8]，具體步驟如下：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好，棄去培養(yǎng)液，用含有ADM(0.005 mg/L) 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 棄含藥液、胰酶消化，收集細(xì)胞，按2×105/mL重新接種于培養(yǎng)瓶(不含ADM培養(yǎng)液)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，進(jìn)入對數(shù)期，重取1×106個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用ADM培養(yǎng)液(0.01 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，重復(fù)上述操作，直至HepG2細(xì)胞可在含有0.5 mg/L ADM培養(yǎng)液中進(jìn)行生長。耐藥細(xì)胞株在正式實驗前1周撤去含藥培養(yǎng)液。HepG2及其耐藥株HepG2/ADM均采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。

1.3丹皮酚對HepG2和HepG2/ADM 細(xì)胞株無毒劑量的篩選采用MTT法[9]。丹皮酚細(xì)胞毒實驗：取對數(shù)生長期HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞種植于96孔板(1×104/孔)，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，換上含有不同濃度(0、5、10、25、50、100 μmol/L)丹皮酚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在終止培養(yǎng)前4 h，每孔加入10 μL MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，均勻振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度值。腫瘤細(xì)胞生存率(%)=(A570加藥組/A570不加藥組)×100%。腫瘤細(xì)胞生長抑制率(%)=100%-腫瘤細(xì)胞生存率(%)。 丹皮酚加藥濃度小于50 μmol/L時，對HepG2及其耐藥株HepG2/ADM毒性相對較小，兩者存活率均在90%以上，因此選定25、50 μmol/L進(jìn)行下一步實驗。

1.4丹皮酚對HepG2及HepG2/ADM細(xì)胞株中細(xì)胞毒藥物IC50值影響的檢測采用MTT法，方法同1.3。HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞分別采用單獨給藥和聯(lián)合給藥進(jìn)行處理。HepG2 細(xì)胞株給藥情況如下：① HepG2單獨給藥：分別采用ADM(0、0.1、0.2、0.5、0.75、1.5、3.0 μmol/L)和氟尿嘧啶(0、1、2、4、10、20、40 μmol/L)進(jìn)行刺激；② HepG2聯(lián)合給藥：25 μmol/L丹皮酚+ADM；50 μmol/L丹皮酚+ADM；25 μmol/L丹皮酚+氟尿嘧啶；50 μmol/L丹皮酚+氟尿嘧啶；5 μmol/L VRP+ ADM；5 μmol/L VRP+ 氟尿嘧啶，所采用ADM和氟尿嘧啶濃度同①。HepG2/ADM細(xì)胞株給藥情況如下：①單獨藥物：分別采用ADM(0、10、25、50、100、200、400μmol/L)和氟尿嘧啶(0、10、25、50、100、200、400 μmol/L)進(jìn)行刺激；② HepG2/ADM聯(lián)合給藥：包括以下分組，25 μmol/L丹皮酚+ADM；50 μmol/L丹皮酚+ADM；25 μmol/L丹皮酚+氟尿嘧啶；50 μmol/L丹皮酚+氟尿嘧啶；5 μmol/L VRP+ ADM；5 μmol/L VRP+ 氟尿嘧啶，所采用的ADM和氟尿嘧啶濃度同①。通過計算單獨給藥與聯(lián)合給藥IC50的比值評價丹皮酚對耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)活性，所有實驗均平行制備3份，結(jié)果取平均值。

1.5腫瘤細(xì)胞攝取ADM能力的檢測取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，按照每孔5×106個進(jìn)行鋪板，在含有不同濃度(25、50 μmol/L)丹皮酚培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，隨后細(xì)胞以冰冷磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌(重復(fù)3次)，棄清洗液，細(xì)胞重懸于含有ADM的培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照前述步驟，以冰冷緩沖液清洗3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

1.6腫瘤細(xì)胞P-糖蛋白的檢測采用Western blotting法。將HepG2及其耐藥株HepG2/ADM 接種于6孔板上，按照前述方法培養(yǎng)、加藥。培養(yǎng)結(jié)束，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，每間隔5分鐘輕微振蕩離心管，離心(10 000 r/min,4 ℃,10 min)取上清液， Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，常規(guī)方法孵育一抗(4 ℃過夜)和通用二抗，超敏免疫印跡試劑檢測蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

2.1丹皮酚對HepG2及HepG2/ADM細(xì)胞株中細(xì)胞毒藥物IC50值的影響見表1。在HepG2細(xì)胞株中，丹皮酚對ADM、氟尿嘧啶的IC50值無明顯影響；在HepG2/ADM細(xì)胞株中，丹皮酚能明顯降低ADM、氟尿嘧啶IC50值(P均<0.01)；此外丹皮酚在50 μmol/L劑量下，對ADM、氟尿嘧啶逆轉(zhuǎn)倍數(shù)依次為3.49、6.13，弱于陽性對照藥VRP。

表1　丹皮酚對HepG2及HepG2/ADM細(xì)胞株中細(xì)胞毒藥物IC50值的影響

注：與ADM比較，##P<0.01；與氟尿嘧啶比較，ΔΔP<0.01。

2.2丹皮酚對HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞攝取ADM的影響結(jié)果見圖1, HepG2/ADM細(xì)胞株內(nèi)平均熒光強(qiáng)度明顯低于HepG2細(xì)胞株(P<0.01，圖1D), 而丹皮酚處理過的HepG2/ADM細(xì)胞株內(nèi)平均熒光強(qiáng)度明顯高于未處理的HepG2/ADM細(xì)胞株(P<0.01,圖1D)。另外，丹皮酚處理的HepG2細(xì)胞株內(nèi)平均熒光強(qiáng)度與未處理的HepG2細(xì)胞株之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)。

注：A、B: 丹皮酚對HepG2細(xì)胞株攝取ADM的影響；C、D: 丹皮酚對HepG2/ADM細(xì)胞株攝取ADM的影響;與HepG2/ADM相比，**P<0.01。

圖1丹皮酚對HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞株攝取ADM的影響

2.3丹皮酚對HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖2所示，丹皮酚體外加藥能夠明顯降低HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白的表達(dá)(P<0.01，圖2B)，而對HepG2細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白的表達(dá)則無影響(圖2D)。

注：A、B:丹皮酚對HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)的影響；1：HepG2/ADM;2:HepG2/ADM+25 μmol/L丹皮酚；3:HepG2/ADM+50 μmol/L丹皮酚；4:HepG2/ADM+5 μmol/L VRP；與HepG2/ADM相比較，**P<0.01; C、D：丹皮酚對HepG2細(xì)胞株 P-糖蛋白表達(dá)的影響;1：HepG2;2:HepG2+25 μmol/L丹皮酚；3:HepG2+50 μmol/L丹皮酚；4:HepG2+5 μmol/L VRP。

圖2丹皮酚對HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)的影響

3討論

肝癌細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象是指臨床上長期應(yīng)用某一類細(xì)胞毒藥物誘導(dǎo)出的耐藥肝癌細(xì)胞株會對其他細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生交叉耐藥。傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物選擇性相對較差，對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均具有明顯殺傷性，因此即使在臨床常規(guī)劑量下長期服用也能夠產(chǎn)生明顯的不良作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)等[10]。針對肝癌多藥耐藥現(xiàn)象，單純提高細(xì)胞毒藥物劑量不是理想途徑。P-糖蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員，可將其作用底物從胞內(nèi)泵出胞外，進(jìn)而減弱藥物效應(yīng)[3]。早先研究證實，P-糖蛋白高度活化是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的主要誘因[3]，因此近年來關(guān)于P-糖蛋白抑制劑的研究廣受關(guān)注。迄今為止，已經(jīng)報道的P-糖蛋白抑制劑可分為三代[11，12]。第一代抑制劑主要是Ca2+抑制劑(VRP)和免疫抑制劑(環(huán)孢素)。雖然具有較強(qiáng)的體外逆轉(zhuǎn)活性，但在臨床允許使用的劑量下往往達(dá)不到抑制P-糖蛋白所需的濃度；第二代抑制劑是在第一代抑制劑基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化的產(chǎn)物，如右旋VRP、PSC-833。雖然具有更強(qiáng)生物活性，但對代謝細(xì)胞毒藥物相關(guān)p450酶具有明顯的抑制作用，延緩細(xì)胞毒藥物體內(nèi)清除和代謝，增加了毒性反應(yīng)；第三代P-糖蛋白抑制劑，諸如LY335979和XY9576，雖然具有高選擇性、較弱的藥物相互作用，但目前尚無通過臨床實驗評價的藥物上市。丹皮酚主要來源于毛茛科植物牡丹干燥根皮和蘿藦科植物徐長卿的全草，具有良好生物活性。目前臨床上應(yīng)用的純丹皮酚制劑主要有丹皮酚磺酸鈉注射液、丹皮酚片和丹皮酚軟膏，長期應(yīng)用安全性較高[13]。研究[6,7, 14]發(fā)現(xiàn),丹皮酚可以顯著抑制肝癌細(xì)胞惡性增殖，與順鉑可聯(lián)合抑制人肝癌細(xì)胞，同時其還可以顯著增加人白血病細(xì)胞株K562/ADM對化療藥的敏感性，這些結(jié)果提示丹皮酚對耐藥肝癌細(xì)胞株具有一定增敏作用。本文通過ADM體外刺激、培養(yǎng)出具有多藥耐藥性HepG2/ADM細(xì)胞株。研究發(fā)現(xiàn)無毒濃度下丹皮酚體外聯(lián)合作用不僅可以增加HepG2/ADM對細(xì)胞毒性藥物ADM和氟尿嘧啶攝取，同時也能明顯降低這些抗癌藥物IC50值；研究同時也表明丹皮酚對HepG2細(xì)胞株敏感性無明顯影響?？紤]到ADM是P-糖蛋白作用底物[15]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚能夠明顯降低HepG2/ADM細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白的表達(dá)，提示降低P-糖蛋白異常表達(dá)是丹皮酚增加HepG2/ADM化療敏感性的原因之一?？紤]到丹皮酚具有良好抗肝癌活性，因此在抗癌濃度下與細(xì)胞毒藥物聯(lián)合應(yīng)用可能與藥理作用機(jī)制上協(xié)同、促細(xì)胞毒藥物胞內(nèi)攝取兩方面均有關(guān)。

綜上所述，丹皮酚對HepG2/ADM細(xì)胞株的耐藥性具有明顯的逆轉(zhuǎn)活性，可能與其降低耐藥細(xì)胞株異常高表達(dá)的P-糖蛋白及促進(jìn)細(xì)胞毒藥物細(xì)胞內(nèi)攝取有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Xu LB, Liu C. Role of liver stem cells in hepatocarcinogenesis[J]. World J Stem Cells, 2014,6(5):579-590.

[2] Cao H, Phan H, Yang LX. Improved chemotherapy for hepatocellular carcinoma[J]. Anticancer Res, 2012,32(4):1379-1386.

[3] Namisaki T, Schaeffeler E, Fukui H, et al. Differential expression of drug uptake and efflux transporters in Japanese patients with hepatocellular carcinoma[J]. Drug Metab Dispos, 2014,42(12):2033-2040.

[4] 楊正生,彭振輝,姚青海,等.丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥物與臨床,2011,11(5):545-547.

[5] 孫愛華,周碧蓉.小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚抗血小板聚集研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,49(6):777-779,784.

[6] Sun GP, Wang H, Xu SP, et al. Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-alpha production[J]. Eur J Pharmacol, 2008,584(2-3):246-252.

[7] 孫慧君,王曉琦,于麗敏,等.丹皮酚對MDR逆轉(zhuǎn)作用的研究[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2000,6(1):59-62.

[8] Zhai BJ, Shao ZY, Zhao CL, et al. Development and characterization of multidrug resistant human hepatocarcinoma cell line in nude mice[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(41):6614-6619.

[9] Liu DL, Li YJ, Yao N, et al. Acerinol, a cyclolanstane triterpenoid from Cimicifuga acerina, reverses ABCB1-mediated multidrug resistance in HepG2/ADM and MCF-7/ADR cells[J]. Eur J Pharmacol, 2014,733:34-44.

[10] Cohen MH, Chen H, Shord S, et al. Approval summary: Cetuximab in combination with cisplatin or carboplatin and 5-fluorouracil for the first-line treatment of patients with recurrent locoregional or metastatic squamous cell head and neck cancer[J]. Oncologist, 2013,18(4):460-466.

[11] 劉念,耿小平,熊茂明.P-糖蛋白抑制劑的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊,2006(2):107-110.

[12] Saneja A, Khare V, Alam N, et al. Advances in P-glycoprotein-based approaches for delivering anticancer drugs: pharmacokinetic perspective and clinical relevance[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2014,11(1):121-138.

[13] 王祝舉,唐力英,赫炎.牡丹皮的化學(xué)成分和藥理作用[J].國外醫(yī)藥:植物藥分冊,2006,21(4):155-159.

[14] Xu SP, Sun GP, Shen YX, et al. Synergistic effect of combining paeonol and cisplatin on apoptotic induction of human hepatoma cell lines[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007,28(6):869-878.

[15] Zhang J, Sun T, Liang L, et al. Drug promiscuity of P-glycoprotein and its mechanism of interaction with paclitaxel and doxorubicin[J]. Soft Matter, 2014,10(3):438-445.

Reversal effect of paeonol on multidrug resistance of liver cancer cell line HepG2/ADM

SUNAihua1,CHENJin,GUANHeng-ming,LIPing

(1TheAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the reversal activity of paeonol on multidrug resistance of liver cancer cell line HepG2/adriamycin (ADM) and its potential molecular mechanism. MethodsThe human HepG2 cell line was used to make the HepG2/ADM model which was induced by the increased concentrations of adriamycin (ADM). MTT assay was performed to detect the proliferation of HepG2/ADM and HepG2. The flow cytometer was used to measure the intracellular accumulation of cytotoxic drugs in HepG2/ADM and HepG2. Western blotting was carried out to determine the levels of P-glycoprotein. ResultsPaeonol with the concentrations from 0 to 50 μmol/L had no cytotoxicity to the HepG2/ADM and HepG2. The IC50values for inhibiting proliferation of HepG2/ADM and HepG2 were 1.48 μM and 124.14 μM, and the resistance index was 83.9. Paeonol (25 μmol/L, 50 μmol/L) could significantly enhance the cytotoxic effects of ADM and 5-fluorouracil on HepG2/ADM, and therefore reduced their IC50values (P<0.01), while It had no effect on those of HepG2. Moreover, Paeonol increased the accumulation of ADM in HepG2/ADM (all P<0.01), but not in HepG2. The further study found that Paeonol obviously reduced the expression level of P-glycoprotein in HepG2/ADM (all P<0.01), while had no effect on that of HepG2. ConclusionPaeonol can reverse the multidrug resistance of HepG2/ADM significantly, which may be related with the inhibition of P-glycoprotein expression and the increased accumulation of cytotoxic drugs.

Key words:liver neoplasms; HepG2/ADM cell line; paeonol; multidrug resistance; P-glycoprotein

(收稿日期：2015-10-12)

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.001

通信作者簡介：李平(1964-),男，主任醫(yī)師，主要研究方向為老年醫(yī)學(xué)、中醫(yī)腫瘤的診治。E-mail：LiPing64@sina.com

作者簡介：第一孫愛華(1979-),男,主治醫(yī)師,主要研究方向為老年醫(yī)學(xué)。E-mail：409019580@qq.com

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局科研基金項目(2009030)。