鐵皮石斛DORCA基因的克隆及表達(dá)分析

崔　波,王潔瓊,宋彩霞,袁秀云,

蔣素華1,梁　芳1,劉　佳2,葉永忠2*

(1 鄭州師范學(xué)院,鄭州 450044;2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)

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鐵皮石斛DORCA基因的克隆及表達(dá)分析

崔波1,2,王潔瓊2,宋彩霞2,袁秀云1,

蔣素華1,梁芳1,劉佳2,葉永忠2*

(1 鄭州師范學(xué)院,鄭州 450044;2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)

摘要:為了研究鐵皮石斛的光合特性,根據(jù)Rubisco活化酶(RCA)基因的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物,采用RT-PCR和RACE方法從鐵皮石斛葉中分離到一個(gè)RCA基因,命名為DORCA(GenBank登錄號(hào)KT205841)。DORCA基因cDNA全長為1 724 bp,包含1 317 bp開放閱讀框(ORF),編碼438個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,DORCA與馬蹄蓮ZaRCA(AAK25801.1)親緣關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析表明,DORCA與其他植物的RCA蛋白具有較高一致性,屬于RCA的β亞基。DORCA蛋白具有定位于葉綠體的N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽,2個(gè)保守的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,DORCA基因在莖、葉中表達(dá);在自然光周期條件下,DORCA基因在8:30時(shí)表達(dá)量最高,20:30時(shí)表達(dá)量最低,具有明顯的光誘導(dǎo)表達(dá)特性。

關(guān)鍵詞:鐵皮石斛;Rubisco活化酶;分子特征;表達(dá)特性

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科(Orchidaceae)多年生附生草本植物,是石斛屬(Dendrobium)藥用植物中珍稀名貴的品種,在中國主要分布在浙江、云南、四川、福建、廣西、安徽等地。鐵皮石斛富含多糖、生物堿、菲類化合物等藥用成分,在提高人體免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等方面具有顯著的功效。

近年來,光合機(jī)理研究日益受到研究者的重視,其中Rubisco(核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)活性的調(diào)節(jié)機(jī)制是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。Rubisco是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵酶,它能催化RuBP(1,5-二磷酸核酮糖)的羧化和加氧反應(yīng),并調(diào)節(jié)二者之間的關(guān)系,這2個(gè)反應(yīng)的比值決定了植物的碳同化效率[1]。已有研究表明,雖然Rubisco含量占葉片可溶性蛋白的一半,但它的效率卻很低[2]。Rubisco只有處于活化態(tài)時(shí),才能催化CO2固定。因此,提高Rubisco利用效率和活力是提高光合作用的重要途徑[3]。在植物體中Rubisco活性受Rubisco活化酶(rubisco activase,RCA)的調(diào)節(jié)和控制,RCA是一種核編碼的可溶性葉綠體蛋白,廣泛存在于光合生物中,具有ATPase活性,屬于AAA+蛋白家族成員[4]。RCA的主要功能是活化Rubisco,在適溫條件下,RCA利用光合磷酸化產(chǎn)生的ATP使Rubisco迅速與生理濃度CO2和Mg2+結(jié)合形成ECM復(fù)合體(酶-CO2-Mg)而達(dá)到最大的活化程度,解除磷酸糖對(duì)Rubisco活性的抑制作用,完成對(duì)Rubisco的活化[5]。

目前關(guān)于RCA的研究主要集中在糧食作物如水稻[6]、小麥[7]、玉米[8]和觀賞性園藝植物如彩葉草[9]、羽衣甘藍(lán)[10]等。鐵皮石斛作為名貴中草藥,因獨(dú)特的保健功能使其市場需求逐年增加,但是生長卻比較緩慢。因此,促進(jìn)鐵皮石斛的生長,提高生產(chǎn)效率,是目前鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。為了更好地研究鐵皮石斛的光合特性,本研究采用RACE法克隆了RCA基因,并對(duì)其分子特性和表達(dá)模式進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步研究鐵皮石斛的光合作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1植物材料

實(shí)驗(yàn)材料為1年生鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale),來源于鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)研究中心。選取生長一致的幼苗,從當(dāng)晚20:30開始每隔4 h取樣1次,到次日20:30結(jié)束,且采相同部位的葉片,保存于-80 ℃冰箱,用于RNA提取。

1.2方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取實(shí)驗(yàn)材料總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性;用DU800核酸蛋白分析儀(美國Beckman)測定其A260、A280值,計(jì)算RNA濃度和純度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)以提取的總RNA為模板,合成單鏈cDNA,具體方法參照試劑盒的說明書。

1.2.2鐵皮石斛RCA基因全長cDNA克隆利用生物軟件DNAMAN和Primer 5.0,根據(jù)已有植物RCA序列的保守區(qū),設(shè)計(jì)1對(duì)簡并引物,上游引物RCA-F1(5′-GAYGACCAGCAGGACATAACCA-3′)和下游引物RCA-R1(5′-TTGTTGACGGTGTACTGGGTG-3′),以葉cDNA為模板,擴(kuò)增鐵皮石斛RCA基因的保守片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包含10×PCR緩沖液2.0 μL,dNTP Mix 2.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,cDNA模板 1.0 μL,rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL,加滅菌雙蒸水至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,56 ℃復(fù)性40 s,72 ℃延伸40 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸20 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用凝膠試劑盒(Tiangen公司)回收目的片段,連接pGEM-T Easy載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α挑選陽性克隆送至上海英駿生物技術(shù)公司測序。

根據(jù)上步所得的RCA基因片段序列,設(shè)計(jì)1對(duì)3′端特異引物GSP1(5′-TGTGCTGCCTCTTCATCAATG-3′)和GSP2(5′-ACCACCCAGTACACCGTCAA-3′),1對(duì)5′端特異引物GPS3(5′-ATACTGACGAAGACCTTGGCTGAT-3′)和GPS4(5′-CACCCTTTCCTCTGGTTATGTCCT-3′),按Clontech公司SMARTer RACE cDNA Amplification Kit操作說明進(jìn)行反應(yīng),回收擴(kuò)增產(chǎn)物,連接到pGEM-T Easy載體上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α菌株,鑒定后進(jìn)行測序。

1.2.3鐵皮石斛RCA基因生物信息學(xué)分析用DNAMAN軟件分析拼接cDNA測序序列,得到正確的鐵皮石斛RCA基因序列。鐵皮石斛RCA蛋白的分子特征主要采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。Blast搜索分析、ORF finding、核苷酸翻譯以及蛋白保守結(jié)構(gòu)域均在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上進(jìn)行;不同RCA蛋白序列的多重比對(duì)利用ClustalX和DNAMAN軟件生成比對(duì)結(jié)果,再利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建;應(yīng)用ExPASy、SMART、Net Phos.2.0 server、TMPRED、TargetP 1.1 server等綜合軟件分析包預(yù)測RCA蛋白的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位等。

1.2.4鐵皮石斛RCA基因表達(dá)分析利用Primer 5.0設(shè)計(jì)鐵皮石斛RCA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物qRT-RCAF(5′-TGTCAACCGAGTTCCACTTACC-3′)和qRT-RCAR(5′-TCGAGGTCAGCAGCCAAGA-3′)。以鐵皮石斛的EF1α作為內(nèi)參基因[11],引物為EF1αF(5′-TCAGGCTGACTGTGCTGTCCT-3′)和EF1αR(5′-GTGGTGGCGTCCATCTTGTT-3′)。分別提取鐵皮石斛不同組織部位,不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA,使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序參照寶生物工程(大連)有限公司SYBR PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書。反應(yīng)體系為20 μL,所用儀器為Eppendorf Mastercycler ep realplex 2。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 s,58 ℃變性15 s,72 ℃退火15 s,40個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)3次,采用公式2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1鐵皮石斛RCA基因全長cDNA克隆

以鐵皮石斛葉片cDNA為模板,擴(kuò)增出1條長度為503 bp的特異保守片段(圖1),測序并在NCBI上Blast分析,該片段與多種植物的RCA序列有較高一致性(80%以上),證明該片段為RCA片段。根據(jù)該片段設(shè)計(jì)RACE引物,利用3′端引物GSP1和GSP2擴(kuò)增得到3′端目的片段,用5′端引物GPS3和GPS4擴(kuò)增得到5′端目的片段(圖2)。將特異保守片段、3′-RACE和5′-RACE序列拼接獲得鐵皮石斛RCA的cDNA,命名為DORCA,全長為1 724 bp,利用NCBI在線工具ORF finder確定該基因的ORF長1 317 bp,編碼438個(gè)氨基酸,包含起始密碼子和終止密碼子。5′端非編碼區(qū)為81 bp,3′端非編碼區(qū)為325 bp。

2.2DORCA蛋白序列的理化性質(zhì)

DORCA基因編碼一個(gè)438 aa的前體蛋白,蛋白的分子量為48.25 kD,理論等電位點(diǎn)為6.19。應(yīng)用在線分析軟件TargetP 1.1 Server對(duì)DORCA氨基酸序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),此氨基酸序列的前57個(gè)氨基酸殘基為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(圖3),因此成熟蛋白分子量為41.1 kD,推測以β(41～43 kD)亞基存在。TMPRED對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明在N端區(qū)域內(nèi)(第17～33位aa)具有跨膜結(jié)構(gòu)。NetPhos 2.0 Server預(yù)測表明,DORCA蛋白有8個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn),4個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn),這表明蛋白翻譯后修飾對(duì)DORCA蛋白功能的實(shí)現(xiàn)起重要作用。SMART和CDS保守結(jié)構(gòu)域搜索表明,DORCA蛋白含有一個(gè)ATP酶的高度保守的P-loop NTPase Superfamily結(jié)構(gòu)域(圖3),其中在162～309 aa位點(diǎn)范圍內(nèi)包含AAA+蛋白家族折疊區(qū),含有2個(gè)保守的ATP結(jié)合基序(motif),分別為“WGGKGQGKS”(A區(qū))和“GKMCCLFINDLD”(B區(qū))。

M.Marker;1.PCR產(chǎn)物

M.Marker;1.5′-RACE;2.3′-RACE

2.3不同植物RCA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

用NCBI上的Blastp程序和DNAMAN多序列對(duì)比分析表明,DORCA蛋白序列與許多植物的RCA具有較高的一致性,其中與油棕(Elaeisguineensis)的一致性最高,達(dá)87%。將DORCA基因氨基酸序列與GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)具有較高一致性的植物包括:海棗(Phoenixdactylifera)、荷花(Nelumbonu-cifera)、葡萄(Vitisvinifera)、可可(Theobromacacao)、麥冬(Ophiopogonjaponicus)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopics)和大豆(Glycinemax)等,與這些基因的一致性都在80%以上。在MEGA 5.0軟件上運(yùn)用Custal X對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖4),結(jié)果表明,DORCA與單子葉植物馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopics)的親緣關(guān)系最近。多序列比對(duì)也表明DORCA蛋白的C末端沒有受硫氧化蛋白f (Trx-f)的氧化還原作用所調(diào)節(jié)的2個(gè)Cys殘基(圖5),表明DORCA蛋白屬于β亞基,這與DORCA蛋白分子量為41.1 kD屬于β亞基的分析一致。

起始密碼子ATG用下劃線表示,終止子TAG用星號(hào)和下劃線表示;灰色背景表示定位于

方框代表本研究的DORCA在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的位置;圖中分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中

α亞基C末端的特異C-extension結(jié)構(gòu)用方框表示;2個(gè)推測的ATP結(jié)合位點(diǎn)P-環(huán)序列用方框A、B表示;

2.4DORCA表達(dá)模式分析

為了研究DORCA基因在鐵皮石斛組織中的表達(dá)模式,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)鐵皮石斛的根、莖、葉進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,DORCA主要在綠色組織中表達(dá),其中葉片中的表達(dá)量最高,在莖中相對(duì)表達(dá)量較少,而在根中幾乎檢測不到(圖6)。本研究得出的結(jié)論與玉米[8]、水稻[6]等RCA只在綠色組織中特異性表達(dá)相一致。研究表明,大量光合作用相關(guān)基因受光照和生物鐘節(jié)律的調(diào)控,為了檢測DORCA是否受光調(diào)節(jié),選取生長在每天12 h自然光照(6:00～18:00)和12 h黑暗條件(18:00～6:00)下的鐵皮石斛幼苗,提取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的葉RNA,進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析。結(jié)果顯示(圖6),在自然光周期條件下,DORCA表達(dá)量變化呈現(xiàn)出明顯的生物鐘特性。黑暗周期過程中,DORCA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,至上午8:30時(shí)達(dá)到最大值,隨后逐漸降低,到晚上20:30降至最低。另外結(jié)果還顯示,DORCA基因表達(dá)水平較高的時(shí)間段主要集中在4:30～12:30。DORCA受光調(diào)節(jié)的特點(diǎn)與玉米[8]、蘋果[11]等多種植物RCA受光調(diào)節(jié)并具有晝夜節(jié)奏的表達(dá)特性相同。

R、S和L分別代表根、莖、葉

3討論

在植物光合作用的研究中,關(guān)于 Rubisco活化酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制一直是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。Rubisco活化酶是維持和調(diào)節(jié)Rubisco活性所必需的,在植物體中只有Rubisco活化酶存在時(shí)Rubisco才能保持較高的催化活性[12]。在本研究中利用RT-PCR和RACE技術(shù)從鐵皮石斛中擴(kuò)增出了一個(gè)RCA基因的全長cDNA序列DORCA(GenBank登錄號(hào)KT205841)。并利用生物信息學(xué)方法對(duì)DORCA蛋白的分子特征進(jìn)行分析和預(yù)測。結(jié)果表明DORCA基因cDNA全長1 724 bp,編碼438個(gè)氨基酸的前體蛋白,N端具有57個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽,是核基因編碼的葉綠體蛋白。DORCA編碼的成熟蛋白具有RCA蛋白都含有的2個(gè)保守的ATP結(jié)合基序,屬于AAA+蛋白家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示DORCA基因的氨基酸序列與其他已知植物RCA具有高度一致性,且與馬蹄蓮親緣關(guān)系最近屬于同一支。

大量研究表明,植物RCA基因具有組織表達(dá)特異性。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥RCA基因只在綠色組織如葉、莖、角果中表達(dá)。Watillon等[14]研究發(fā)現(xiàn)蘋果RCA基因同樣在葉片中能大量檢測到,但在根和莖中幾乎檢測不到。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法得出的檢測結(jié)果與前人結(jié)果相似[13-14],且與Rubisco僅在綠色組織中特異表達(dá)相一致。同時(shí)多數(shù)植物RCA基因的表達(dá)還受到光的誘導(dǎo)及生物鐘的調(diào)控[15-16],本研究中同樣發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛RCA基因晝夜表達(dá)變化節(jié)奏性,開始時(shí)表達(dá)水平最低,然后表達(dá)量逐漸增加,至上午8:30時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值,隨后逐漸降低,表現(xiàn)出了生物鐘特性。

不同植物RCA亞基的種類和數(shù)量是不同的,如小麥[7]、水稻[6]、擬南芥[17]、大豆[18]、菠菜[17]、棉花[19]等植物均含有α和β亞基,而有些植物如黃瓜[20]、玉米[8]、煙草[15]等卻只表達(dá)β亞基。植物RCA的α亞基大小范圍在45～47 kD,而且只有α亞基的C末端具有調(diào)節(jié)硫氧還蛋白f (Trx-f)的2個(gè)Cys殘基,β亞基的大小為41～44 kD,C末端沒有保守結(jié)構(gòu)[16]。DORCA蛋白經(jīng)多重序列對(duì)比表明,其C端沒有α亞基所具有的2個(gè)Cys殘基,并且成熟蛋白大小為41.1 kD,說明屬于β亞基形式。研究表明無論何種形式的亞基,來源于同種或是不同種的植物抗體之間都有可能發(fā)生交叉反應(yīng)[18]。另外,RCA基因的表達(dá)方式也各不相同,有的是由一個(gè)RCA基因通過選擇性剪接編碼2個(gè)亞基,有的是不同基因編碼同一個(gè)亞基[21]。因此,在鐵皮石斛中是否還具有α亞基形式,以及其β亞基是否是由一個(gè)或者多個(gè)基因編碼的,還需要利用Southern blotting及Western blotting等技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行分析確定。

蘇文華等[22]研究表明,鐵皮石斛葉片具有兼性CAM植物的特點(diǎn),晴天呈CAM途徑、陰雨天呈C3途徑,多云天氣在上述兩種途徑之間變化。本試驗(yàn)關(guān)于DORCA基因的分子克隆與表達(dá)特性的研究,為進(jìn)一步研究鐵皮石斛復(fù)雜的光合作用奠定了基礎(chǔ)。目前正在構(gòu)建DORCA基因的超表達(dá)載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,試圖進(jìn)一步解釋其調(diào)控的分子機(jī)制。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis ofDORCAGene fromDendrobiumofficinale

CUI Bo1,2,WANG Jieqiong2,SONG Caixia2,YUAN Xiuyun1,JIANG Suhua1,LIANG Fang1,LIU Jia2,YE Yongzhong2*

(1 Zhengzhou Normal College,Zhengzhou 450044,China;2 College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Abstract:To study the photosynthesis of Dendrobium officinale,we isolated a full-length cDNA of Rubisco activase DORCA(Accession No.KT205841) from this plant by the method of RT-PCR and RACE using degenerate primers designed according to the conserved region of RCA.The full-length cDNA of DORCA was 1 724 bp,with an ORF of 1 317 bp encoding 438 putative amino acids.Phylogenetic analysis showed that DORCA closed to ZaRCA(AAK25801.1).Bioinformatics analysis showed that DORCA belonged to β isoform of RCA protein and had high identities with other plant RCAs.The DORCA contained a predicted N-terminal transit peptide to chloroplast,two high conserved ATP-binding domains and multiple phosphorylation sites.The real-time quantitative PCR(qRT-PCR) results showed that DORCA was only detected in green tissues.In the 12 h dark and 12 h natural light photoperiods,maximal and minimal DORCA mRNA expression levels were detected at 8:30 and 20:30,respectively,which indicated that DORCA has the obvious characteristics of light-induced expression.

Key words:Dendrobium officinale;Rubisco activase;molecular characteristics;expression patterns

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:崔波(1962-),男,博士,教授,主要從事花卉分子生物學(xué)研究。E-mail:laocuibo@163.com*通信作者:葉永忠,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事植物生態(tài)學(xué)研究。E-mail:yeyzh@163.com

基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110128);鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PPTGG420)

收稿日期:2015-09-25;修改稿收到日期:2015-12-08

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0023-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0023