鐵皮石斛莖段離體快繁研究進(jìn)展

朱啟發(fā)+朱亞雄

摘 要：鐵皮石斛是具有藥用價值及經(jīng)濟(jì)價值的名貴草藥。該文對近年來鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁相關(guān)研究情況進(jìn)行了整理與分析，從外植體的預(yù)處理與滅菌方法、基本培養(yǎng)基的選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑等方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；以芽繁芽；離體快繁

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）08-37-03

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為我國傳統(tǒng)草藥，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物，以干燥莖入藥。是有藥用價值及經(jīng)濟(jì)價值的名貴草藥，2010年版《中國藥典》將鐵皮石斛從石斛中單獨(dú)列出。因其原生地生境破壞和常年過度采挖，鐵皮石斛野生資源遭到嚴(yán)重破壞，瀕臨滅絕，已列入中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[1]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立其離體快繁體系是獲得大量種苗的有效途徑。研究表明，帶芽莖段具有分生能力強(qiáng)的特點(diǎn)，作為組織培養(yǎng)的外植體，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接萌發(fā)出芽，有利于保持該品種遺傳性狀穩(wěn)定，是最理想的外植體[2]。為此，筆者將近年來鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁相關(guān)研究情況進(jìn)行了整理與分析，從外植體的預(yù)處理與滅菌方法、基本培養(yǎng)基的選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑等方面進(jìn)行了綜述，以期能為鐵皮石斛組織培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)參考。

1 外植體的預(yù)處理與滅菌方法

目前研究者們在采用鐵皮石斛帶芽莖段進(jìn)行組培快繁時，使用的表面滅菌技術(shù)主要包括：選擇生長旺盛的鐵皮石斛幼嫩枝條，剝?nèi)ス?jié)上葉片和膜質(zhì)葉鞘，先用洗潔精或洗衣粉清洗后，用水龍頭下用自來水沖洗30～40min，濾干水分，將嫩枝剪成約1.5cm長帶莖節(jié)的小段，放入燒杯中在超凈工作臺中進(jìn)行滅菌。滅菌采用常規(guī)方法，即75%酒精+0.1%升汞溶液的滅菌組合，75%酒精浸泡時間為35s，接著用0.1%升汞溶液浸泡，浸泡時間為10min，2次滅菌間隔用無菌水漂洗1次，滅菌結(jié)束后用無菌水漂洗4～5次，最后將經(jīng)無菌濾紙吸干表面水分的外植體接種到適宜的腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基中[3-5]。經(jīng)過上述滅菌方法處理后，外植體攜帶的微生物基本被清除，能夠達(dá)到較好的滅菌效果。

2 基本培養(yǎng)基的選擇

選擇何種基本培養(yǎng)基的是影響植物組織培養(yǎng)快速繁殖的重要因素。MS、B5、SH和White是常用的蘭科植物組織培養(yǎng)基，曹天旭等選擇這4種基本培養(yǎng)基研究不同基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛生長的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在MS和SH培養(yǎng)基中，鐵皮石斛的成苗數(shù)、鮮重和干重顯著高于White和B5培養(yǎng)基，兩者之間無顯著差異，但相比SH培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)的鐵皮石斛試管苗顏色深綠，生長旺盛，芽數(shù)分化最多。綜合各項(xiàng)生長指標(biāo)，MS基本培養(yǎng)基為營養(yǎng)成分比較全面的培養(yǎng)基，符合鐵皮石斛叢生芽的誘導(dǎo)和生長要求，為其最適培養(yǎng)基[6]。馬玉申等進(jìn)行外植體腋芽誘導(dǎo)影響的對比試驗(yàn)，從4種不同濃度的MS（MS、1/2MS、1/3MS和1/4MS）培養(yǎng)基中篩選鐵皮石斛組培快繁最適宜的基本培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，鐵皮石斛芽在MS基本培養(yǎng)基中萌發(fā)率極低（7.5%），褐化嚴(yán)重而致外植體死亡；1/2MS培養(yǎng)基中，腋芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到65.0%，萌發(fā)的芽葉色翠綠、莖徑較粗，和其他3種培養(yǎng)基相比，芽的長勢最好；1/3MS和1/4MS培養(yǎng)基中的外植體，腋芽不萌發(fā)，絕大部分死亡[3]。目前在鐵皮石斛快繁技術(shù)的研究中一般采用MS或1/2MS培養(yǎng)基做為基本培養(yǎng)基[7-9]。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

生長調(diào)節(jié)劑在植物組培快繁體系建立的過程中起著關(guān)鍵的作用。在植物組織培養(yǎng)中，生長素單獨(dú)使用時，主要起到促進(jìn)細(xì)胞生長和伸長及根的分化的作用[10]，而單獨(dú)使用細(xì)胞分裂就能起到促進(jìn)芽萌發(fā)的增殖的效果，但同時添加生長素和細(xì)胞分裂素，兩者的聯(lián)合作用對組培苗的生長更有利，更能促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長[11]。在培養(yǎng)過程中，生長素和細(xì)胞分裂素的種類及濃度是影響組培苗快繁的關(guān)鍵因素之一。在鐵皮石斛以芽繁芽離體快速繁殖體系建立過程中，增值培養(yǎng)基可以和誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，一般采用6-BA和NAA組合居多，NAA濃度一般為0.2～1.0mg/L，6-BA濃度一般為0.5～3mg/L；生根階段一般采用IBA和NAA，IBA濃度為0.2～3.0mg/L，NAA濃度一般為0.2～0.5mg/L[12-15]。細(xì)胞分裂素KT也常被添加到培養(yǎng)基中用于鐵皮石斛組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)的研究，洪森榮等的研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加的KT濃度一定的情況下，在一定濃度范圍內(nèi)，添加NAA濃度越高，鐵皮石斛帶芽莖段的增殖率越高，且芽增值率的高低與KT與NAA的濃度配比高低成正比[16]。多效唑是一種高效、低毒的植物生長延緩劑，且有廣譜殺菌作用[17]。在植物離體快繁體系建立中，主要用于壯苗和促進(jìn)試管苗生長以及生根，蒙愛東等將多效唑用于鐵皮石斛試管苗培養(yǎng)，試驗(yàn)效果好，適宜濃度的多效唑起到壯苗、促進(jìn)試管苗生根以及提高移栽成活率的作用[18]。

4 影響鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁的其他因素

4.1 添加物 在建立植物組培快繁體系研究中，常在不同階段培養(yǎng)基中添加附加物以達(dá)到提高產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。選擇的添加物其有效成分多為氨基酸、酶、植物激素等物質(zhì)，常用的添加物有馬鈴薯泥、香蕉泥、甘薯汁、冬瓜汁、木瓜乳、南瓜汁和椰乳等，多數(shù)研究證明它們能明顯促進(jìn)組培苗的增殖和分化[19]。羅煥明等研究試驗(yàn)結(jié)果得出馬鈴薯汁和木瓜乳有利于誘導(dǎo)鐵皮石斛組培苗芽的增殖，香蕉乳有利于誘導(dǎo)組培苗生根。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)加入活性炭可以促進(jìn)根系生長，利于試管苗的生長[20]。李霖明等研究分別在培養(yǎng)基中添加殼聚糖、綠豐源、海藻精和極可善對鐵皮石斛組培苗生長的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)條件下，不同添加物對組培苗生長影響不同，極可善和殼聚糖有利于鐵皮石斛壯苗和促進(jìn)試管苗生根；在增殖階段，添加極可善和海藻精可以提供鐵皮石斛組培苗增殖率[21]。

4.2 pH值 培養(yǎng)基的pH亦是影響鐵皮石斛離體組培快繁的關(guān)鍵因素，植物組織培養(yǎng)pH一般以5.0～6.0較適宜，pH高于6.0時，培養(yǎng)基硬度高，不利于外植體吸收養(yǎng)分；pH低于5.0時，培養(yǎng)基太軟，甚至不凝固，不利于外植體固定[22]。一般情況下鐵皮石斛組培的適宜pH范圍在5.6～5.8之間，pH過高或過低都會影響鐵皮石斛組培苗的生長。

4.3 瓊脂和碳源 在進(jìn)行植物組織固體培養(yǎng)時，瓊脂是良好的固化劑。植物組織培養(yǎng)基中使用瓊脂的一般濃度為0.3%～1%，因?yàn)椴煌瑥S家生產(chǎn)的瓊脂質(zhì)量不同會導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固的適宜濃度不同，所以在使用前應(yīng)進(jìn)行不同瓊脂濃度的預(yù)實(shí)驗(yàn)加以確定。鐵皮石斛組織培養(yǎng)中添加瓊脂濃度一般為0.4%～0.7%。植物本來能夠進(jìn)行光合作用，合成碳水化合物，滿足自身生長的能量需求，不需要從外部供給糖。可是植物組織在離體后，依靠自養(yǎng)作用制造的碳水化合物難以滿足自身需求，必須從培養(yǎng)中吸收碳水化合物。蔗糖相對于其他碳源不僅價格低廉、購買方便，而且能滿足絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)所需的碳源[23]。目前，大部分植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究或者工廠化生產(chǎn)都選擇蔗糖作為碳源[24]。鐵皮石斛的離體組培快繁也采用糖作為碳源，其使用濃度范圍一般為2%～3%。

4.4 培養(yǎng)條件 組培苗的正常生長也像生長在自然界中的植物一樣依賴適宜的溫度和光照等培養(yǎng)條件。適宜組培苗生長的溫度一般在25～30℃，不同的品種的最適宜溫度差別很大[25]。光質(zhì)、光照強(qiáng)度和光照時間長短都影響鐵皮石斛組培苗的生長。在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件一般設(shè)置為：溫度（25±1）℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度1 000～2 000lx。

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（責(zé)編：徐煥斗）