外源Spd預(yù)處理對(duì)甜瓜白粉病抗性及其內(nèi)源多胺的誘導(dǎo)分析

劉長(zhǎng)命,楊瑞平,莫言玲,王永琦,鄭俊鶱,張　顯*

(1 商洛學(xué)院,陜西商洛 726000;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西楊陵 712100)

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外源Spd預(yù)處理對(duì)甜瓜白粉病抗性及其內(nèi)源多胺的誘導(dǎo)分析

劉長(zhǎng)命1,楊瑞平2,莫言玲2,王永琦2,鄭俊鶱2,張顯2*

(1 商洛學(xué)院,陜西商洛 726000;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西楊陵 712100)

摘要:以甜瓜感病品種‘0544’為試材,測(cè)定外源亞精胺(Spd)預(yù)處理和白粉病菌接種后甜瓜幼苗的光合參數(shù)、抗氧化酶活性、內(nèi)源多胺含量及多胺合成與代謝相關(guān)基因表達(dá)等的變化,探討外源Spd處理對(duì)甜瓜幼苗白粉病抗性的誘導(dǎo)作用機(jī)制。結(jié)果顯示:(1)1.0 mmol·L-1外源Spd處理可顯著降低甜瓜幼苗的白粉病病情指數(shù),緩解植株發(fā)病癥狀;(2)外源Spd處理可誘導(dǎo)甜瓜幼苗的多胺合成以及代謝相關(guān)基因(SAMDC、ADC、ODC、Spd、Spm、PAO)顯著上調(diào)表達(dá);(3)外源Spd處理可誘導(dǎo)甜瓜幼苗腐胺(Put)和Spd含量顯著增加,而外源Spd并接種白粉病菌處理對(duì)甜瓜幼苗精胺(Spm)含量積累的誘導(dǎo)更加顯著;(4)接種白粉病菌誘導(dǎo)了甜瓜幼苗的多酚氧化酶 (PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,外源Spd預(yù)處理后再接種白粉病的誘導(dǎo)作用更大,同時(shí)外源Spd處理還誘導(dǎo)了甜瓜幼苗過(guò)氧化氫(H2O2)含量的升高;(5)在觀測(cè)期(120 h)內(nèi),接種白粉病菌對(duì)甜瓜葉片的光合作用抑制較小,而外源Spd預(yù)處理并接種白粉病菌共同誘導(dǎo)了甜瓜幼苗的光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)的顯著升高。研究認(rèn)為,在外源Spd預(yù)處理甜瓜幼苗后再接種白粉病菌,甜瓜幼苗可以通過(guò)多胺的快速積累及代謝產(chǎn)生的H2O2來(lái)啟動(dòng)響應(yīng)機(jī)制,進(jìn)而通過(guò)增強(qiáng)防御酶活性等途徑來(lái)提高對(duì)白粉病的抗性。

關(guān)鍵詞:亞精胺;病情指數(shù);防御酶活性;光合參數(shù);基因表達(dá)

白粉病作為甜瓜(Cucumismelo)一種世界性真菌病害,可造成植株光合能力下降、早衰,甚至死亡,給世界各國(guó)的甜瓜生產(chǎn)造成了重大損失。同時(shí),大量農(nóng)藥的濫用易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性,對(duì)環(huán)境也會(huì)造成嚴(yán)重污染。利用誘抗劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance,SAR)來(lái)防治病害,具有抗病譜廣、有效期長(zhǎng)和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),是一種具有較大潛力的植物病害防治方法。

多胺(PAs)是一類廣泛存在于高等植物中的具有很強(qiáng)生理活性的含氮堿,與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性密切相關(guān)。研究表明,在植物受脅迫前或脅迫中施用外源多胺,可以誘導(dǎo)植物體通過(guò)調(diào)控多種途徑來(lái)緩解脅迫壓力,如降低自由基和過(guò)氧化氫的含量、保護(hù)細(xì)胞膜的完整性、調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)、增加抗氧化酶的活性等[1-2]。亞精胺(Spd)屬于多胺類化合物中的三胺,由腐胺經(jīng)過(guò)加入氨丙基殘基逐步形成。研究發(fā)現(xiàn),Spd在植物響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫中起著重要的作用。如在大麥感染葉銹病真菌(Pucciniahordei)后,多胺特別是Spd在被感染葉片中出現(xiàn)了快速的響應(yīng)積聚[3];外源Spd不但能誘導(dǎo)黃瓜對(duì)鹽脅迫和冷脅迫等非生物脅迫的抗性[4],還能提高黃瓜對(duì)灰霉病[5]和白粉病[6]等生物脅迫的抗性,有效降低其發(fā)病病情指數(shù)。作者課題組前期在對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行外源Spd處理并接種白粉病菌的研究中也發(fā)現(xiàn)[7],外源Spd處理可以不同程度地誘導(dǎo)甜瓜幼苗對(duì)白粉病的抗性,并以1.0 mmol·L-1濃度效果最佳,且感病材料‘0544’的反應(yīng)更敏感,但不同品種的抗病性強(qiáng)弱仍主要由遺傳因素決定。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)[8-9],在甜瓜與白粉病菌的互作中,多胺合成與代謝相關(guān)基因參與了白粉病的防御反應(yīng)。然而,對(duì)甜瓜幼苗多胺含量變化與其抗病性的關(guān)系還不很清楚。因此,本研究以甜瓜感病品種‘0544’為試驗(yàn)材料,對(duì)其進(jìn)行外源Spd處理并接種白粉病菌后的病情指數(shù)、光合特性、抗氧化酶活性以及多胺類基因表達(dá)和內(nèi)源多胺含量變化等進(jìn)行研究,以探討多胺類物質(zhì)在植物抵抗病原菌侵染中的作用機(jī)理,為甜瓜的白粉病防治提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甜瓜栽培品種‘0544’[CucumismeloL.ssp.melo(Pang.) Greb]為白粉病感病品種;參試白粉病菌(Podosphaeraxanthii)采自田間甜瓜植株的自然感病葉片,經(jīng)人工氣候室擴(kuò)繁而來(lái)。試劑Spd為Sigma公司產(chǎn)品,純度≥99%,分子量145.25,為無(wú)色液體。

1.2材料培養(yǎng)與處理

1.2.1材料培養(yǎng)甜瓜種子經(jīng)55 ℃消毒10 min后,室溫下浸泡5 h,人工氣候箱內(nèi)催芽,培養(yǎng)環(huán)境條件為溫度30 ℃/20 ℃(晝/夜)、光照16 h/8 h(光/暗)、相對(duì)濕度70%～85%。 待甜瓜幼苗第2片真葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2.2外源Spd處理及接種試驗(yàn)共設(shè)噴水、噴水+接種、噴Spd、噴Spd+接種4個(gè)處理。待甜瓜幼苗第2片真葉完全展開(kāi)時(shí),于傍晚向葉面、葉背均勻噴施1.0 mmol·L-1濃度Spd溶液,布滿葉片但不下滴為宜,每個(gè)處理用量50 mL(Spd濃度及用量為預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果),對(duì)照植株葉片噴施等量蒸餾水,連續(xù)處理72 h后接種白粉病菌,4次重復(fù)。接種時(shí),將白粉病菌孢子配成1×106孢子/L的懸浮液,加2%表面活性劑后進(jìn)行噴霧接種,對(duì)照噴施等量蒸餾水,保濕24 h后,置相同生長(zhǎng)環(huán)境管理。分別于接種后0、12、24、48、72和120 h取各處理第2片完全展開(kāi)的真葉,液氮冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1病情指數(shù)分別于發(fā)病后第2天(接種后第8天)、第4天采用十字交叉法測(cè)量病斑的縱徑、橫徑,取其平均值作為病斑的直徑,病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同文獻(xiàn)[7],病情指數(shù)按下式計(jì)算;同時(shí)于發(fā)病后第8天、第18天采用離體葉面積儀測(cè)定葉面積,病情指數(shù)按儀器采集病斑面積/葉片面積計(jì)算。

1.3.2光合氣體交換參數(shù)利用便攜式光合儀(Li-6400)于上午8:30～11:00進(jìn)行光合氣體交換參數(shù)測(cè)定,直接讀出葉片凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)等光合參數(shù),水分利用效率(WUE)和氣孔限制度(Ls)分別利用公式計(jì)算:WUE=Pn/Tr,Ls=1-Ci/Ca,Ca為空氣CO2濃度。測(cè)定時(shí)使用紅藍(lán)LED光源,光強(qiáng)設(shè)定為800 μmol·m-2·s-1,每張葉片重復(fù)讀數(shù)3次,3次重復(fù)。

1.3.3抗氧化酶活性和H2O2含量分別稱取各處理葉片約0.5 g(分別計(jì)重),加入pH 7.8磷酸緩沖液(含1 mmol·L-1EDTA,2% PVP)8 mL研磨勻漿,4 ℃低溫15 000 g離心30 min,上清液即為酶粗提液。H2O2含量以及過(guò)氧化氫酶CAT(EC1.11.1.6)、多酚氧化酶PPO(EC1.14.18.1)、過(guò)氧化物酶POD(EC1.11.1.7)和超氧化物歧化酶SOD(EC1.15.1.1)活性測(cè)定參照Kubis等[10]和李合生[11]的方法。

1.3.4多胺合成代謝相關(guān)基因表達(dá)分析總RNA提取參考OMEGA試劑盒(OMEGA,北京)的方法,260 nm下利用紫外分光光度計(jì)(V-550,JASCO,Japan)檢測(cè)濃度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取1 μg總RNA參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI,USA)的方法合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析利用qRT-PCR定量?jī)x(Bio-Rad,USA)和SYBR?PremixExTaqTMⅡ(2×)試劑盒(日本,TAKARA),引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán),以甜瓜Actin基因作為內(nèi)參,3次重復(fù)。

1.3.5內(nèi)源腐胺、亞精胺和精胺含量甜瓜葉片多胺含量測(cè)定參照Flores等[12]的方法,并稍做改進(jìn)。稱取約0.5 g葉片(單個(gè)計(jì)重),加入4 mL預(yù)冷的5%(V/V)高氯酸(PCA)冰上研磨勻漿;冰浴1 h后4 ℃低溫15 000 g離心30 min,取500 μL上清液,加入1 mL NaOH(2 mol·L-1)和7 μL苯甲酰氯混勻,劇烈渦旋后37 ℃溫浴30 min;然后向混合液里加入2 mL飽和NaCl溶液終止反應(yīng),再加入2 mL乙醚進(jìn)行萃取,1 500 g離心5 min,取1 mL乙醚相蒸發(fā)干燥,溶于400 μL色譜級(jí)甲醇中待測(cè)。3種多胺(腐胺、亞精胺、精胺)的標(biāo)樣先配置成1.0 mmol·L-1的儲(chǔ)存液,各取40 μL按樣品相同的處理方法進(jìn)行苯甲?；６喟窚y(cè)定利用高效液相色譜法(LC-2010AHT,Japan;C18反相柱,直徑4.6 mm,長(zhǎng)150 mm,粒徑5 μm),進(jìn)樣10 μL,柱溫25 ℃,流速0.7 mL·min-1,流動(dòng)相為64%甲醇,在230 nm紫外下檢測(cè)吸收峰值。做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),以Sigma公司產(chǎn)品做標(biāo)樣,分別取苯甲?；蟮亩喟窐?biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4 nmol·μL-1進(jìn)樣,以峰面積對(duì)進(jìn)樣量作曲線,計(jì)算相關(guān)性系數(shù)。

表1　實(shí)時(shí)定量PCR所用引物列表

1.4數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,用Excel和Photoshop軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1外源Spd處理對(duì)甜瓜植株白粉病發(fā)病的影響

圖1顯示,甜瓜感病品種‘0544’在噴施1.0 mmol·L-1Spd并接種白粉病菌后,其葉片病情指數(shù)在噴施Spd處理下比對(duì)照(噴水+接種白粉菌)顯著降低,葉片白粉病斑數(shù)量也較對(duì)照明顯減少。其中,在接種后第8天,噴水+接種處理植株下部第2片葉病情指數(shù)達(dá)0.25,為Spd處理+接種處理植株的近2倍,上部第2片葉的病情指數(shù)也明顯高于Spd處理的植株(圖1,A、B);在接種后第18天,噴水+接種處理植株的下部第2片葉的病情指數(shù)近0.9,上部第2片葉也達(dá)0.4,而Spd處理+接種植株相應(yīng)葉片的病情指數(shù)則分別為0.7和0.3,病情指數(shù)分別比噴水對(duì)照降低了16%和10%(圖1,B)?？梢?jiàn),噴施1.0 mmol·L-1外源Spd能顯著誘導(dǎo)增強(qiáng)感病甜瓜品種幼苗對(duì)白粉病的抗性。

2.2外源Spd處理對(duì)接種甜瓜幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

從表2可知,單獨(dú)Spd處理(Spd)或噴水后接種(H2O+PM)早期(120 h內(nèi))對(duì)甜瓜幼苗葉片凈光合速率(Pn)影響不大,但噴施外源Spd并接種白粉病菌處理(Spd+PM)植株的Pn在接種后72 h時(shí)顯著高于噴水后接種植株,并在接種后120 h時(shí)顯著高于其余處理,而其余處理間無(wú)顯著差異。

同時(shí),氣孔導(dǎo)度(Gs)的變化規(guī)律在噴亞精胺后接種和噴水后接種處理中與Pn相似,不同之處在于,噴水后接種的植株Gs除在處理24 h較對(duì)照(H2O)呈顯著上升外,其他處理時(shí)間均與對(duì)照無(wú)顯著差異。胞間CO2濃度(Ci)與Gs的變化趨勢(shì)基本一致。另外,Spd處理后再接種能顯著提高甜瓜幼苗的蒸騰速率(Tr),與各處理時(shí)間對(duì)照植株以及處理72和120 h噴水后接種的植株差異均達(dá)到了顯著性水平,而其水分利用效率(WUE)與氣孔限制值(Ls)卻低于對(duì)照植株,并在接種后72 h內(nèi)呈顯著性差異水平?？傊?單接種白粉病或Spd處理對(duì)感病甜瓜幼苗的光合參數(shù)影響較小,而在外源Spd處理和白粉病菌的共同作用下卻能顯著增強(qiáng)感病甜瓜幼苗的Pn、Gs和Tr。

2.3外源Spd處理對(duì)接種甜瓜幼苗葉片多胺類基因表達(dá)的影響

關(guān)于各處理植株葉片的多胺類基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)(圖2),各基因的表達(dá)水平均以單獨(dú)外源Spd處理隨處理時(shí)間的變化最為突出,其余處理變幅相對(duì)較小。

PM.白粉病菌接種,下同;A.接種后第8天的感病情況;

處理時(shí)間Treatmenttime/h處理Treatment凈光合速率Pn/(μmol·m-2·s-1)氣孔導(dǎo)度Gs/(mol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci/(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1)水分利用效率WUE氣孔限制值Ls24H2O21.30±0.15a 0.30±0.01cde251.00±2.00cd 4.74±0.06cde4.49±0.03c0.39cdH2O+PM20.30±0.46abcd0.38±0.01b276.67±0.88a5.27±0.09bcd3.85±0.03ef0.32efSpd20.80±0.50abc0.36±0.01bc271.67±1.86ab5.24±0.10bcd3.97±0.06def0.34efSpd+PM20.30±0.26abcd0.39±0.01b277.67±1.76a5.47±0.06b3.71±0.01efg0.32ef72H2O 20.57±0.61abcd0.24±0.03ef218.33±10.60e4.11±0.34ef5.04±0.26b0.46±0.03bH2O+PM19.40±0.36d0.19±0.01f196.33±6.01f3.57±0.13f5.44±0.10a0.51±0.02aSpd20.43±0.42abcd0.27±0.02de233.33±6.36de4.60±0.23de4.46±0.15c0.42±0.02bcSpd+PM20.97±0.49abc0.29±0.03de236.00±9.85de4.85±0.31bcd4.34±0.18cd0.41±0.02c120H2O19.43±0.38d0.37±0.03bc267.33±3.93abc5.41±0.23cd3.60±0.09fg0.33±0.01efH2O+PM19.70±0.15cd0.37±0.03bc266.67±6.69abc5.35±0.25bc3.69±0.14efg0.33±0.02efSpd19.90±0.44bcd0.34±0.03bcd257.67±6.17bc4.92±0.20bcd4.05±0.12de0.35±0.02deSpd+PM21.13±0.37ab0.48±0.03a279.67±2.40a6.14±0.20a3.45±0.06g0.30±0.01f

注:同列不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異。

Note:The different normal letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level.

就單獨(dú)外源Spd處理而言,甜瓜SAMDC基因在處理24 h后迅速上調(diào)表達(dá)并達(dá)到峰值,達(dá)到噴水對(duì)照組的3倍多,隨后在接種48 h快速下降后又呈上升趨勢(shì),在整個(gè)接種處理期間(120 h內(nèi))均呈高水平上調(diào)表達(dá);其ADC基因表達(dá)情況與SAMDC基因類似,于處理24 h時(shí)明顯上升到噴水對(duì)照的2.2倍,隨后于處理120 h達(dá)到峰值,為噴水對(duì)照的3.7倍;而其ODC基因卻在接種處理24 h時(shí)呈下調(diào)表達(dá),并顯著低于噴水對(duì)照,之后在處理48和120 h時(shí)出現(xiàn)2個(gè)高峰值,分別為噴水對(duì)照的4.3和4.4倍;其Spd合酶基因也于處理48和120 h時(shí)呈迅速上調(diào)表達(dá),分別為噴水對(duì)照的4和8倍,而在處理24和72 h時(shí)下調(diào)表達(dá);其Spm合酶基因在整個(gè)處理期均上調(diào)表達(dá),于24 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的12倍;其PAO基因在處理期間也呈不同程度上調(diào)表達(dá),于處理24 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的6倍多,且比其他處理都高,隨后呈急劇下降趨勢(shì)。同時(shí),在噴施Spd并接種白粉病菌處理中,其葉片ADC和Spm合酶基因明顯比噴水對(duì)照上調(diào)表達(dá),均比噴水后接種處理表達(dá)水平要高;而其SAMDC和ODC基因表達(dá)水平在接種后72 h明顯高于噴水后接種處理;其PAO基因除在24 h時(shí)比噴水后接種處理明顯高外,之后表達(dá)量顯著低于噴水后接種處理。此外,噴水后接種處理也在不同程度誘導(dǎo)了植株葉片多胺類基因的表達(dá),但對(duì)代謝類基因的上調(diào)誘導(dǎo)比合成類基因更明顯?？傮w上看,單獨(dú)噴施外源Spd不同程度誘導(dǎo)了甜瓜幼苗葉片多胺合成與代謝相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá),而外源噴施Spd并接種白粉病菌促使植株維持較高的多胺合成類基因表達(dá)水平。

2.4外源Spd處理對(duì)接種甜瓜幼苗葉片3種多胺含量的影響

外源噴施Spd后增加了甜瓜幼苗葉片中3種內(nèi)源多胺的含量,并以Put和Spd表現(xiàn)尤為明顯(圖3)。其中,圖3,A顯示甜瓜幼苗葉片內(nèi)源Put含量在單獨(dú)噴施Spd后48 h出現(xiàn)明顯上升(為噴水對(duì)照的1.4倍),于72 h達(dá)到最高值,較噴水對(duì)照顯著上升了67%;噴施Spd并接種條件下,接種白粉病菌抑制了外源Spd處理對(duì)葉片內(nèi)源Put含量的促進(jìn)效應(yīng),內(nèi)源Put含量除在24 h時(shí)比其他處理高外,接種48 h后其含量總體低于其他處理;由圖3,B可以看出,噴水后接種植株內(nèi)源Put含量在接種24和120 h也表現(xiàn)出升高趨勢(shì)。甜瓜幼苗葉片內(nèi)源Spd含量在單獨(dú)外源Spd處理后各時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)了明顯升高現(xiàn)象,接種72和120 h分別較噴水對(duì)照顯著上升了44%和74%;而噴施外源Spd并接種處理植株的內(nèi)源Spd含量在處理48 h之前顯著高于其他處理,在48 h后低于或與其他處理持平;噴水后接種處理植株內(nèi)源Spd含量只在處理72 h出現(xiàn)上升,其他時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化。圖3,C顯示,各處理甜瓜幼苗植株葉片內(nèi)源Spm含量變化與前兩者差異較大,其在單獨(dú)外源噴施Spd處理下變化不顯著,而在噴施Spd并接種白粉病處理植株中于接種48 h后呈顯著升高,在噴水后接種處理的植株內(nèi)于接種24、48和120 h后也都有顯著性增加。以上結(jié)果表明,外源Spd處理可以顯著誘導(dǎo)內(nèi)源Put和Spd含量的累積,而內(nèi)源Spm含量表現(xiàn)為在外源Spd處理并接種的雙重誘導(dǎo)下上升更為明顯。

圖2　外源亞精胺處理對(duì)甜瓜接種白粉病菌后多胺類基因表達(dá)的影響

2.5外源Spd處理對(duì)接種甜瓜幼苗葉片抗氧化酶活性及H2O2含量的影響

如圖4所示,甜瓜幼苗葉片PPO活性在2個(gè)接種處理中均高于2個(gè)未接種處理,并且噴施Spd并接種處理引起了PPO活性升高的時(shí)間更早,于接種48 h即達(dá)到峰值,而噴水后接種植株則在接種72 h達(dá)最高值。幼苗葉片POD活性在未接種處理中隨時(shí)間變化趨勢(shì)相似,且均處于較低水平;其活性在噴水后接種處理中呈先下降后上升的趨勢(shì),而在噴Spd并接種處理的植株中一直維持較高的活性水平,在接種后期才逐漸趨于對(duì)照水平。幼苗葉片SOD活性在2個(gè)未接種處理中變化均不大,均呈緩慢下降趨勢(shì);在2個(gè)接種處理中均表現(xiàn)出上升→下降→再上升→再下降的趨勢(shì),并且在Spd處理并接種后24 h的SOD活性高于噴水后接種處理,在其他時(shí)間點(diǎn)2個(gè)接種處理的SOD活性基本接近。另外,幼苗葉片H2O2含量在噴水對(duì)照中相對(duì)穩(wěn)定,其在噴水后接種處理植株中于整個(gè)接種期也均無(wú)明顯峰值,但始終高于噴水對(duì)照。但2個(gè)外源Spd處理葉片H2O2含量隨處理時(shí)間變化幅度較大,它們后處理24 h即出現(xiàn)明顯上升,于處理48 h稍下降后,又于處理72 h同時(shí)達(dá)到峰值,且單獨(dú)外源Spd處理植株基本高于同期噴施外源Spd后接種處理植株。

以上結(jié)果表明外源Spd處理不僅促進(jìn)了內(nèi)源多胺的生物合成,還可能引起多胺的降解,從而產(chǎn)生了更多的H2O2。并且,在噴水處理或外源Spd處理后再接種白粉病菌,均不同程度誘導(dǎo)了抗氧化酶活性的升高,尤以外源Spd處理后再接種的植株上升更為明顯。

圖3　外源亞精胺處理對(duì)甜瓜‘0544’接種

3討論

通過(guò)外源化學(xué)制劑誘導(dǎo)植物抗病基因的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)病原菌的抵抗力,不僅可以解決由病原菌不斷變異引起的抗性遺失,還可以解決農(nóng)藥濫用導(dǎo)致的環(huán)境污染問(wèn)題。大量研究表明,多胺在植物抗逆中起著極其重要的作用,常被認(rèn)為作為第二信使參與植物的抗逆反應(yīng)過(guò)程[10,13-14]。然而,關(guān)于多胺在抵御病原菌侵染中的作用機(jī)理研究?jī)H見(jiàn)到少量報(bào)道。Walters等研究白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.hordei)侵染大麥時(shí)發(fā)現(xiàn),接種白粉病菌后引起大麥葉片中的多胺含量出現(xiàn)快速積累,而利用外源多胺,尤其是外源Spd能顯著增強(qiáng)植物的抗性[15]。作者前期的研究也發(fā)現(xiàn)[9],抗性甜瓜品種在接種白粉病菌后48 h,一些抗性基因和多胺合成相關(guān)基因SAMDC出現(xiàn)了快速上調(diào)表達(dá)。本研究通過(guò)對(duì)感病甜瓜品種葉面噴施外源Spd處理表明,外源Spd處理誘導(dǎo)了甜瓜幼苗內(nèi)源Put、Spd和Spm在基因表達(dá)水平和物質(zhì)含量上的明顯積累,尤其是Spd的含量及其基因表達(dá)量,并表現(xiàn)出感病葉片病情指數(shù)的顯著降低,植株的發(fā)病癥狀得到了緩解。這與尚慶茂等[5]和于力等[6]在研究不同濃度外源Spd處理能顯著增強(qiáng)黃瓜灰霉病及白粉病抗性的結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn),外源Spd處理后接種白粉病菌也誘導(dǎo)了多胺代謝相關(guān)基因PAO的顯著上調(diào)表達(dá),推測(cè)一方面與植物維持體內(nèi)多胺合成與代謝平衡有關(guān),分解體內(nèi)過(guò)多的高級(jí)胺為二胺,另一方面可能通過(guò)多胺氧化酶活性的增加,分解多胺的同時(shí)積累大量H2O2,引起H2O2迸發(fā),進(jìn)而誘導(dǎo)早期的過(guò)敏反應(yīng)。Yoda等[16]研究也表明,多胺氧化酶(PAO)在降解多胺時(shí)產(chǎn)生的H2O2參與了細(xì)胞壁大分子的交聯(lián)和植物的過(guò)敏反應(yīng),誘導(dǎo)了植物的抗性基因表達(dá)。

圖4　外源亞精胺處理對(duì)甜瓜‘0544’接種白粉病菌后葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Induction of Endogenous Polyamine Contents and Powdery Mildew Resistance by Exogenous Spermidine in Melon Seedlings

LIU Changming1,YANG Ruiping2,MO Yanling2,WANG Yongqi2,ZHENG Junxian2,ZHANG Xian2*

(1 Shangluo University,Shangluo,Shaanxi 726000,China;2 College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:The effect of exogenous spermidine(Spd) on inducing resistance of Cucumis melo L.to powdery mildew was conducted with the susceptible cultivars ‘0544’,and the photosynthetic parameters,activities of antioxidant enzymes,contents of endogenous polyamines and the genes expression of polyamine synthesis and metabolism were tested in melon seedlings after pretreated with Spd then inoculated with powdery mildew.The results showed that:(1)1.0 mmol·L-1exogenous Spd could significantly reduce the disease index in melon seedlings resistance to powdery mildew and relieve the symptoms;(2)the genes related to polyamine syntheses and metabolism(SAMDC,ADC,ODC,Spd,Spm,PAO) were significantly induced by the exogenous Spd treatment during the seedling stage;(3)the contents of putrescine (Put) and spermine (Spd) were induced more significantly by the exogenous Spd while the spermine (Spm) content accumulated more by both the exogenous Spd treatment and powdery mildew inoculation;(4)the defense enzymes of melon seedlings such as polyphenol oxidase(PPO),peroxidase (POD) and superoxide dismutase(SOD) activities were induced after powdery mildew inoculation,with both the exogenous Spd treatment and powdery mildew inoculation.Meanwhile,the H2O2contents increased as well after the exogenous Spd treatment;(5)during the period of observation(120 h),the photosynthetic parameters were less affected after the powdery mildew inoculation.However,the photosynthetic rate(Pn),stomatal conductance(Gs) and transpiration rate (Tr) increased significantly by both the exogenous Spd treatment and powdery mildew inoculation.This study suggested that pretreatment melon seedlings with the exogenous Spd before powdery mildew inoculation could obviously improve the resistance of melon to powdery mildew,which might via rapid accumulation of PAs and H2O2contents metabolized form polymine,and then induced the activities of defense enzymes.

Key words:spermidine;disease index;defense enzyme activities;photosynthetic characteristics;gene expression

中圖分類號(hào):Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:劉長(zhǎng)命(1980-),男,博士,講師,主要從事園藝植物抗性育種研究。E-mail:liujie2061@163.com*通信作者:張顯,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事西甜瓜育種研究。E-mail:zhangxian098@126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(K305021310);商洛學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(15SKY026)

收稿日期:2015-08-19;修改稿收到日期:2015-11-26

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0085-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0085