碳離子束輻照選育截短側(cè)耳素菌原生質(zhì)體

都雯玥陸錫宏李雪虎周 翔梁劍平辛志君

1（中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）2（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730000）

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碳離子束輻照選育截短側(cè)耳素菌原生質(zhì)體

都雯玥1,2陸錫宏1李雪虎1周 翔1梁劍平1,2辛志君1

1（中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）
2（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730000）

摘要使用12C6+離子束輻照Clitopilus pinsitus 原生質(zhì)體至不同吸收劑量，運(yùn)用瓊脂柱預(yù)篩和96孔板固體發(fā)酵選育截短側(cè)耳素高產(chǎn)變異株。結(jié)果顯示，最佳12C6+離子束吸收劑量為1.5 Gy，在該吸收劑量下正變異率為37.58％。選育出C.pin15I5E和C.pin15II6B兩株正變異株，其產(chǎn)量較出發(fā)菌株分別提高16.17％和15.47％。表明重離子束輻照原生質(zhì)體是行之有效的工業(yè)微生物誘變育種方法。

關(guān)鍵詞碳離子束，輻照，Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體，高產(chǎn)變異株，截短側(cè)耳素

Supported by National High Technology Research and Development Program of China (863Program) (2011AA10A214) and Gansu Local Pharmaceutical Industry Development Fund (Y361010SJ0)

Frist author: DU Wenyue, female, was born in June 1988 and graduated from Gansu Agricultural University in 2011. Now she is a master candidate of Lanzhou University of Technology, majoring in microbial mutation breeding

Received 10 September 2015, accepted 10 November 2015

Breeding pleuromutilin protoplasts strains by carbon ion beam irradiation

DU Wenyue1,2LU Xihong1LI Xuehu1ZHOU Xiang1LIANG Jianping1,2XIN Zhijun1

1(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)
2(Life Science and Engineering College, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT Clitopilus pinsitus protoplast was irradiated by12C6+ion beam at varied absorbed doses for mutagenesis, and high-yielding pleuromutilin mutant strains were screened using high-throughput method and solid fermentation. The results showed that the optimum12C6+ion beam absorbed dose is 1.5 Gy, and under this condition the positive mutation rate is 37.58％. By agar column prescreening and 96-plate solid fermentation, the mutant strains, C.pin15I5E and C.pin15II6B, were selected. The yields of the strain increased by 16.17％ and 15.47％, respectively, compared with that of the original strain. The research suggests that applying heavy ion irradiation to protoplast is a possible method to breed mutant strains.

KEYWORDS Carbon ion beam, Irradiation, Clitopilus pinsitus protoplast, High-yielding mutant strain, Pleuromutilin

CLC Q691.5, TL99

截短側(cè)耳素是斜蓋菇屬(Clitopilus)真菌產(chǎn)生的一種二萜抗生素，對支原體和一些革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)抗菌活性，其衍生物如泰妙菌素具有生物利用率高、毒性低和殘留少的優(yōu)勢，作為飼料添加劑應(yīng)用于家畜家禽養(yǎng)殖[1-3]。目前，國內(nèi)截短側(cè)耳素生產(chǎn)企業(yè)少，發(fā)酵技術(shù)不成熟，菌株截短側(cè)耳素產(chǎn)量低，發(fā)酵周期長[2,4]，通過誘變選育截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

重離子束輻照是一種新型的誘變手段，具有突變頻率高、突變譜廣、能夠打破基因連鎖、促進(jìn)基因重組等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。離子注入細(xì)胞，可以引起DNA損傷，激發(fā)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，最終形成堿基缺失和顛換，DNA片段缺失和插入等突變[8-10]。陳宇等[11]使用N+離子束輻照紅霉素產(chǎn)生菌，經(jīng)過篩選得到高產(chǎn)突變菌，其搖瓶發(fā)酵證明產(chǎn)量較原始菌株提高20％以上。頡紅梅等[12]使用O6+離子束輻照慶大霉素產(chǎn)生菌，通過選育得到產(chǎn)量提高30％的高產(chǎn)菌。重離子束輻照微生物菌株為醫(yī)藥行業(yè)提供高產(chǎn)菌株，顯示出較大的先進(jìn)性，探索重離子對微生物突變劑量閾值具有重要的理論價值和應(yīng)用價值[5]。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)采用對數(shù)生長期的細(xì)胞制備代謝旺盛、對誘變劑敏感、變異幅度大的原生質(zhì)體，再輔以常規(guī)的物理、化學(xué)誘變方法，從而選育理想的突變株[13]。李霞光[14]用氮離子注入誘變L-異亮氨酸產(chǎn)生菌及其原生質(zhì)體，進(jìn)行理化誘變，對比發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體的總突變率和正突變率高于菌絲體，而且原生質(zhì)體存活率也高于菌絲體。丁曉兵[15]使用N+注入的鈍齒棒桿菌原生質(zhì)體，選育獲得遺傳穩(wěn)定性較好的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌，其產(chǎn)率比原始菌株提高43.66％。本實驗使用12C6+離子束輻照Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體，結(jié)合截短側(cè)耳素對金色葡萄球菌有較高抗菌作用的特點(diǎn)建立高通量篩選方法[1,3]，期望選育出截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株，并為原生質(zhì)體重離子誘變提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

Clitopilus pinsitus由山東東藥藥業(yè)股份有限公司提供。金色葡萄球菌Staphyloccocus aureus保存于中國科學(xué)院近代物理研究所重離子輻照藥物研發(fā)中心。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、磷酸氫二鉀0.5％、氯化鈉1％、瓊脂1.8％～2.0％、pH=7.0。斜面培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：麥芽提取物1.9％、葡萄糖0.4％、酵母浸粉0.4％、棉籽粉0.3％、瓊脂2.0％、pH自然。液體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：麥芽提取物1.9％、葡萄糖0.4％、酵母浸粉0.4％、棉籽粉0.3％、硝酸鈣0.05％、碳酸鈣0.05％、pH=6.2。再生培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）麥芽提取物1.9％、葡萄糖0.4％、酵母浸粉0.4％、棉籽粉0.3％、瓊脂0.8％、pH值自然，使用0.4 mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑代替純水配制。

0.4mol/L甘露醇(Spectrum)穩(wěn)滲劑：稱取109 g甘露醇溶解于1 L去離子水中，高壓滅菌備用。2.5％破壁酶解液：精確稱取蝸牛酶（北京索寶生物科技有限公司）、纖維素酶，溶解于0.4 mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑中，使用0.22 μm濾膜過濾除菌備用。

磷酸二氫鉀（分析純）、乙腈（色譜純）、去離子水、截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.3實驗儀器

高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、BSP-250生化培養(yǎng)箱（上海博訊公司）、HF Super NW超純水系統(tǒng)（上?？道追治鰞x器有限公司）、HFsafe1200生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、電子天平(Sartorius)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Coaster)、35 mm輻照培養(yǎng)皿(Corning)、Waters2695E高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體制備

根據(jù)文獻(xiàn)報道[16]，經(jīng)過試驗優(yōu)化，確定原生質(zhì)體的制備條件為：液體靜置培養(yǎng)5 d的菌絲體，以0.4 mol/L甘露醇為穩(wěn)滲劑，2.5％蝸牛酶+2.5％纖維素酶混合酶，25℃酶解1.5 h，純化酶解液，獲得原生質(zhì)體懸浮液。對照組吸取1 mL原生質(zhì)體懸浮液，稀釋10倍，吸取1 mL稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，計算原生質(zhì)體再生個數(shù)。

1.2.212C6+離子束輻照誘變

吸取1 mL原生質(zhì)體懸浮液加入無菌35 mm輻照培養(yǎng)皿中，放在中科院近代物理所自制的旋轉(zhuǎn)輪盤上，利用蘭州重離子加速器國家重點(diǎn)實驗室提供的重離子束12C6+，設(shè)定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 Gy 6個吸收劑量，劑量率為1.0 Gy/min，每組3個平行。重離子束12C6+的輻射參數(shù)為：初始能量80 MeV/u 的12C6+穿透50 μm不銹鋼窗、 1.3 m的空氣和1 mm的PE輻照培養(yǎng)皿后能量為76.37 MeV/u，預(yù)計穩(wěn)滲劑中射程16 mm，峰位15.5 mm。輻照后，將處理組Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體懸浮液稀釋10倍，將稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7～14 d，按公式(1)計算致死率。

式中：rF(Fatality rate)為輻照致死率；Ni(Number of regenerated strains from irradiation group)為處理組再生菌株個數(shù)；Nc(Number of regenerated strains from control group)為對照組再生菌株個數(shù)。

1.2.3Clitopilus pinsitus變異菌株瓊脂柱預(yù)篩選

參考文獻(xiàn)[17]和文獻(xiàn)[18]中瓊脂柱篩選法，用高壓滅菌的牙簽挑取培養(yǎng)了7～14 d、約1 mm2大小誘變再生菌株，接入96孔板中，進(jìn)行編號，培養(yǎng)5 d后使用牙簽對號接種到新的96孔板中，再培養(yǎng)7 d后用牙簽連同瓊脂柱一起挑出，均勻放在涂布了500 μL、濃度106～8菌落/mL金色葡萄球菌的90 mm一次性培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)48 h。選取抑菌圈大于空白組的菌株，進(jìn)行96孔板固體發(fā)酵培養(yǎng)。正變異率是某吸收劑量下誘變菌株中抑菌圈直徑大于空白組的菌株個數(shù)占總菌株個數(shù)的百分比。

1.2.4固體發(fā)酵培養(yǎng)篩選

預(yù)篩選出的菌株使用96孔板發(fā)酵培養(yǎng)11 d，甲醇超聲提取發(fā)酵產(chǎn)物，使用高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)法檢測菌株的截短側(cè)耳素發(fā)酵產(chǎn)量，檢測條件為：Agilent Zorbax C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈混合液（二者體積比為55:45），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長205 nm，進(jìn)樣量20 μL[19]。

2　結(jié)果與分析

2.1輻照致死率和正突變率

使用12C6+離子束輻照Clitopilus pinsitus 原生質(zhì)體至不同吸收劑量，統(tǒng)計輻照致死率，結(jié)果見圖1。由圖1可知：吸收劑量在0.5 Gy和3 Gy時致死率分別為92.56％和93.46％；吸收劑量為1 Gy時，致死率最低為90.92％；總體輻照致死率高于90％。根據(jù)圖2所示，當(dāng)吸收劑量為1.5 Gy時，篩選得到較多的正變異菌株，其正變異率為37.58％。結(jié)果表明，Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體12C6+離子束輻照最佳吸收劑量為1.5 Gy。同時，實驗得到典型“馬鞍型”曲線，并且在“馬鞍型”區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)較高的正變異率，符合重離子輻照微生物的生物學(xué)效應(yīng)規(guī)律，即當(dāng)吸收劑量為1～1.5 Gy時，Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體激發(fā)DNA修復(fù)，細(xì)胞存活率、變異率提高[6]。

2.2截短側(cè)耳素高產(chǎn)變異菌株篩選

使用SPSSv21統(tǒng)計分析軟件對出發(fā)菌株C.pin0的抑菌圈直徑大小進(jìn)行單樣本t檢驗，最終確定選取誘變菌株中抑菌圈直徑大于25 mm的菌株為正變異菌株。本次實驗共計預(yù)篩選得到104株高產(chǎn)變異菌株，表1為部分抑菌圈直徑大于等于28 mm的高產(chǎn)變異菌株，較出發(fā)菌株截短側(cè)耳素產(chǎn)量提高22.8％以上。其中選取個別產(chǎn)量提高27.2％以上的菌株進(jìn)行96孔板固體發(fā)酵培養(yǎng)11 d，甲醇提取發(fā)酵產(chǎn)物，使用HPLC進(jìn)行檢測。

表1　截短側(cè)耳素高產(chǎn)變異菌株瓊脂柱預(yù)篩選結(jié)果Table 1 Screening results of high pleuromutilin producing mutant strains by agar plug method

通過瓊脂柱預(yù)篩實驗，選出5株抑菌圈直徑超過29 mm的菌株，在25℃、40％～50％濕度條件下固體發(fā)酵培養(yǎng)11 d，HPLC檢測誘變菌株截短側(cè)耳素的含量，篩選出兩株高產(chǎn)變異菌株，產(chǎn)量分別為330.4和328.4 μg/mL，較出發(fā)菌株提高16.17％和15.47％（見表2）。

表2　變異菌株截短側(cè)耳素產(chǎn)量Table 2 Pleuromutilin production of the mutant strains

3　討論

Clitopilus pinsitus是高等絲狀真菌，實驗室培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢子[20-21]，為獲得單核細(xì)胞，筆者進(jìn)行了Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體制備并采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)育種。12C6+離子束輻照Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體在1.5 Gy吸收劑量下選育出兩株截短側(cè)耳素高產(chǎn)變異菌株，其截短側(cè)耳素產(chǎn)量較出發(fā)菌株分別提高16.17％和15.47％。重離子束輻照原生質(zhì)體后，其再生菌株呈現(xiàn)“馬鞍形”存活曲線，即隨著吸收劑量的增加，致死率先出現(xiàn)降低趨勢，1 Gy時致死率最低，隨后致死率又升高，體現(xiàn)了重離子束輻照后細(xì)胞的HRS/IRR效應(yīng)，即低劑量輻照超敏感效應(yīng)及增強(qiáng)的輻射抗性[6]。實驗結(jié)果還表明1.5 Gy是產(chǎn)生最高的正變異率的最佳吸收劑量?！罢T導(dǎo)修復(fù)”模型對這一效應(yīng)的解釋為[6]：1～1.5 Gy閾值的12C6+離子束輻照激發(fā)Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體對損傷DNA的修復(fù)，結(jié)果提高了細(xì)胞的存活率，并出現(xiàn)較高的正變異率。

目前，原生質(zhì)體誘變技術(shù)最常用的物理誘變劑有紫外線、激光、γ-射線等[13]。紫外線促使DNA分子形成嘧啶二聚體，產(chǎn)生基因突變，這種單一的損傷難以產(chǎn)生較高的突變率[22]。如薛正蓮等[23]使用紫外-激光復(fù)合誘變Streptmyces lincolsis原生質(zhì)體選育林可霉素高產(chǎn)菌株，正突變率最高為20％。激光輻照產(chǎn)生光、熱、壓力和電磁場效應(yīng)，主要引起細(xì)胞酶活性和細(xì)胞代謝活動的改變，對DNA突變和染色體畸變的影響較低[22]。如陳五嶺等[24]使用He-Ne激光誘變原生質(zhì)體選育四環(huán)素高產(chǎn)菌，四環(huán)素平均產(chǎn)量較原始菌株提高9.32％。與傳統(tǒng)的理化誘變方法相比，重離子束傳能線密度大，與微生物細(xì)胞相互作用過程中發(fā)生質(zhì)量沉積，形成的Bragg峰使樣品局部受損，通過調(diào)節(jié)離子能量改變局部受損位置能實現(xiàn)定點(diǎn)、定位誘變，相對生物學(xué)效應(yīng)高，產(chǎn)生大量穩(wěn)定突變體[5-7]。而且，Clitopilus pinsitus是多核體，截短側(cè)耳素合成受基因簇主導(dǎo)[25-27]，遺傳背景復(fù)雜，目的基因難找，重離子束輻照是最直接可靠的誘變手段。調(diào)節(jié)質(zhì)量數(shù)、電荷數(shù)和能量等重離子參數(shù)，并且采用不同方法處理微生物，可以篩選符合不同需求的突變體。針對不產(chǎn)孢子的擔(dān)子菌類，重離子輻照技術(shù)與原生質(zhì)體誘變技術(shù)結(jié)合進(jìn)行微生物育種具有一定的應(yīng)用價值。

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Corresponding author:Ph.D. LI Xuehu, associate professor, E-mail: lixh@impcas.ac.cn

收稿日期：初稿2015-09-10；修回2015-11-10

通訊作者：李雪虎，博士，副研究員，E-mail: lixh@impcas.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010402

中圖分類號Q691.5，TL99

基金資助：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）(2011AA10A214)和甘肅省隴藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(Y361010SJ0)項目資助

第一作者：都雯玥，女，1988年6月出生，2011年畢業(yè)于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，現(xiàn)為蘭州理工大學(xué)在讀碩士研究生，方向為微生物誘變育種