雪峰蟲草高效液相色譜指紋圖譜研究

秦　優(yōu)，陳　林，梁雪娟,3，糜亞男，肖　娟，張水寒,3*（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙41008；.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南長(zhǎng)沙410013；3.湖南省011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙41008）

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雪峰蟲草高效液相色譜指紋圖譜研究

秦優(yōu)1,2，陳林2，梁雪娟2,3，糜亞男1,2，肖娟2，張水寒1,2,3*
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南長(zhǎng)沙410013；3.湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410208）

〔摘要〕目的建立雪峰蟲草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為月旭AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；體積流量0.5 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果建立了11批雪峰蟲草藥材高效液相色譜指紋圖譜，確定共有峰15個(gè)，采用對(duì)照品結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)7個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，并采用相似度分析、主成分分析、聚類分析的方法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)論建立的雪峰蟲草高效液相指紋圖譜方法簡(jiǎn)便、可靠且重復(fù)性好，為雪峰蟲草的質(zhì)量控制提供了有效的手段。

〔關(guān)鍵詞〕雪峰蟲草；高效液相色譜；指紋圖譜；質(zhì)量控制；聚類分析度；相似度分析

HPLC Fingerprint of Ophiocordyceps xuefengensis

QIN You1,2, CHEN Lin2, LIANG Xuejuan2,3, MI Yanan1，2, XIAO Juan2, ZHANG Shuihan1,2,3*
（1.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2.Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410013, China;3.2011 Collaboeation and Innovation Center for Digital Chinese Medicine in Hunan, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To establish HPLC fingerprint for Ophiocordyceps xuefengensis and provide conference for quality evaluation. Methods The HPLC method was used with the condition that the column was Yuexu AQ-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）; The detection wavelength was set at 260 nm; The mobile phase was eluted with gradient by mixture of methanol and water（0.1%formic acid）; The flow rate was 0.5 mL/min; The column temperature was 30℃; The injection was 20 μL. Results The HPLC fingerprint for Ophiocordyceps xuefengensis collected from eleven different sources was set up. Fifteen common peaks werefound, seven of them had been identified by reference substances and HPLC -Q -TOF -MS/MS. The fingerprint was analyzed with methods of cluster analysis, principal component analysis and similarity computation. Conclusion The method of HPLC fingerprint for Ophiocordyceps xuefengensis is simple, rapid and can be used for identification and evaluation of Ophiocordyceps xuefengensis.

〔Keywords〕Ophiocordyceps xuefengensis; HPLC; fingerprints; quality control; cluster analysis; simillarity analysis

雪峰蟲草為線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體或充滿菌絲的干燥幼蟲尸體（菌核體），為線蟲草菌科線蟲草菌屬的一個(gè)新種，經(jīng)鑒定是目前同屬真菌中與冬蟲夏草親緣關(guān)系最近的一個(gè)種[1]，因其產(chǎn)于雪峰山脈而得名。主要成分是腺苷、蟲草素、D-甘露醇、多糖、氨基酸等[2]。目前，其市場(chǎng)需求量較大，但尚無統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用高效液相色譜法，建立了雪峰蟲草的高效液相色譜指紋圖譜，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)指紋圖譜中主要特征峰進(jìn)行了化學(xué)指認(rèn)，綜合運(yùn)用相似度分析、聚類分析以及主成分分析方法對(duì)雪峰蟲草色譜圖進(jìn)行分析，為全面評(píng)價(jià)雪峰蟲草的品質(zhì)，嚴(yán)格控制其質(zhì)量提供有效方法和科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試劑

1200Series型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技公司）；6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS/MS（安捷倫科技公司）；月旭AQ-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（METTLER）。

甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；甲酸（色譜純，美國TEDIA公司）；水（湖南長(zhǎng)沙娃哈哈飲料有限公司）；其他試劑為分析純。

腺苷（批號(hào)110879-200202），蟲草素（批號(hào)858-200202），尿苷（批號(hào)887-200202），尿嘧啶（批號(hào)1004697-200401），均購自中國藥品生物制品檢定所。鳥嘌呤（批號(hào)140631-201205）購自中國食品藥品檢定研究院。11批雪峰蟲草樣品編號(hào)和批號(hào)分別為S1：0140318、S2：20140324、S3：20140920、S4：20120426、S5：20120512、S6：20121026、S7：20130601、S8：0130602、S9：20130603、S10：20140421、S11：20141221）采自雪峰山脈不同縣市，經(jīng)貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心文庭池教授和湖南省中醫(yī)藥研究院朱如彩研究員共同鑒定為雪峰蟲草Ophiocordyceps xuefengensis。

2　方法與結(jié)果

2.1雪峰蟲草供試品溶液的制備取雪峰蟲草粉末約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加15%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，取出，放至室溫，用15%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。濾過，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2對(duì)照品溶液的制備分別取腺苷、蟲草素、鳥嘌呤、尿苷、甘露醇、尿嘧啶對(duì)照品約10 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度作為對(duì)照品溶液。

2.3色譜條件月旭AQ-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）;梯度洗脫: 0～25 min保持2% A，25～30min從2%A洗脫至10%A, 30～40 min從10%A洗脫至40%A。

2.4質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；檢測(cè)方式：正負(fù)離子檢測(cè)；掃描范圍：30～1 000 m/z；干燥氣溫度325℃；干燥氣體積流量6.8 L/min；鞘氣溫度350℃；毛細(xì)管電壓4.0 kV；碎片電壓130 V。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗(yàn)取S3 1份，按照“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間（tR）和相對(duì)峰面積的一致性，各主要色譜峰的tR的RSD＜1.5%，相對(duì)峰面積RSD＜2%，表明方法精密度良好。

2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)取S3 6份，按照2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，考察色譜峰tR和相對(duì)峰面積的一致性，各主要色譜峰的tR的RSD＜1.5%，相對(duì)峰面積RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取S3 1份，按照“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，考察色譜峰tR和相對(duì)峰面積的一致性，各主要色譜峰的tR的RSD＜1.5%，相對(duì)峰面積RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

2.6.1指紋圖譜的建立按照“2.1”項(xiàng)下的方法制備11批樣品的供試品溶液，各取20 μL，在“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到11批雪峰蟲草高效液相色譜指紋圖譜（圖1）。確定15個(gè)色譜峰為雪峰蟲草所共有，且共有峰的總面積占總峰面積的90%，因此確定該15個(gè)色譜峰為雪峰蟲草共有峰，建立共有指紋圖譜（R）見圖1。由圖1可知，雪峰蟲草特征明顯的主要有4個(gè)色譜峰（分別為8、9、11、13號(hào)峰），這4個(gè)色譜峰即構(gòu)成雪峰蟲草高效液相色譜指紋圖譜的特征峰，其中以峰高最高的9號(hào)峰化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時(shí)間以及峰面積重復(fù)性良好，與其它相鄰峰分離良好，采用化學(xué)工作站計(jì)算該峰的純度表明該峰為一純化合物。因此選擇9號(hào)峰為指標(biāo)峰，其保留時(shí)間和峰面積均設(shè)為1，用于計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各共有峰的tR與相對(duì)峰面積的RSD大部分都小于1%，個(gè)別峰的RSD大于1%，但小于5%，可以初步說明10批雪峰蟲草樣品的成分以及各成分的量都較穩(wěn)定。

2.6.2特征峰的指認(rèn)采用對(duì)照品并結(jié)合高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)雪峰蟲草指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行分析指認(rèn)，HPLC工作條件同“2.3”項(xiàng)下色譜條件，在“2.4”項(xiàng)下質(zhì)譜條件下對(duì)雪峰蟲草提取物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合色譜峰的紫外色譜圖、一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，指認(rèn)出5、6、7、9、11、12、13號(hào)峰，分別為甘露醇、鳥嘌呤、尿嘧啶、尿苷、腺苷、蟲草素。指認(rèn)結(jié)果見表1。

圖1　雪峰蟲草高效液相色譜指紋圖譜

表1　雪峰蟲草色譜峰的HPLC-Q-TOF-MS/MS分析結(jié)果

2.7雪峰蟲草指紋圖譜的分析

2.7.1相似度評(píng)價(jià)將測(cè)定獲得的11批雪峰蟲草指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），進(jìn)行色譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜（見圖1），用于11批雪峰蟲草樣品相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，11批雪峰蟲草藥材中除第1、2批藥材的相似度低于0.90外，其他9批藥材指紋圖譜均在0.90以上，相似度均較高，見表2。

表2　11批雪峰蟲草藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.7.2主成分分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)雪峰蟲草藥材指紋圖譜的15個(gè)峰進(jìn)行主成分分析。由表3和表4可以看出，第一主成分以12、15、9、7、13、14、8、6號(hào)峰為主，占信息量的42.8%；第二主成分以10、2、4、3號(hào)峰為主，占信息量的24.5%；第三主成分以5、6、7號(hào)峰為主，占信息量的14.8%；第四主成分以3、9、11、5號(hào)峰為主，占信息量的7.0%。前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.2%，基本反映了總體信息。由“2.6.2”項(xiàng)下特征峰的指認(rèn)結(jié)果可知，第一主成分中的6、7、9、11、12、13號(hào)峰均為核苷類化合物。

表3　4個(gè)主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

表4　主成分載荷矩陣表

2.7.3系統(tǒng)聚類分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)雪峰蟲草藥材高效液相色譜指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。由聚類分析結(jié)果（圖2）可知：11批樣品大致分為2類，其中S4、S5、S6、S3、S8、S10、S7、S11、S9歸為一類；S1和S2歸為一類。由相似度分析結(jié)果可知，S1和S2相似度相對(duì)較低，而S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11相似度相對(duì)較高，聚類分析結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，兩種評(píng)價(jià)方法得到了相互印證。由此可知，不同批次雪峰蟲草的質(zhì)量基本穩(wěn)定，但部分共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分的量還存在一定的差異。

圖2　雪峰蟲草指紋圖譜聚類分析結(jié)果

3　討論

3.1流動(dòng)相的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)共考查了6個(gè)不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，即甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液。結(jié)果表明，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，完成出峰時(shí)間較短，得到的色譜峰的數(shù)目不多，且色譜峰的分離度不如甲醇，故有機(jī)相選擇甲醇。甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液考查結(jié)果表明，甲醇-0.1%甲酸水溶液分離的色譜峰峰形狀與分離度最好，故將其作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。

3.2流速的優(yōu)化

本研究分別考察了1 mL/min、0.8 mL/min及0.5 mL/min三種不同流速下色譜圖的出峰情況，結(jié)果顯示在0.5 mL/min下能獲得最佳的分析效果。

3.3色譜柱的優(yōu)化

本研究分別考查了月旭AQ -C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent Poroshell 120 SB-AqC18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色譜柱，結(jié)果顯示，在月旭AQ-C18色譜柱中本實(shí)驗(yàn)所分離的色譜峰分離度較好，峰數(shù)多，穩(wěn)定性好。

3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行200～400 nm的全波長(zhǎng)掃描，并對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，在260 nm下檢測(cè)到的峰的數(shù)目較多，分離度較好，特征峰明顯且峰形較好。

3.5小結(jié)

指紋圖譜技術(shù)運(yùn)用到中藥質(zhì)量控制，避免了利用單一成分含量測(cè)定中藥質(zhì)量的不足，在一定程度上反應(yīng)了中藥的“真實(shí)面目”，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路和新方法，已日益成為國內(nèi)外廣泛接受的中藥及其制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[3-7]。

本研究首次建立雪峰蟲草藥材高效液相色譜指紋圖譜，選取了15個(gè)穩(wěn)定性好，特征性明顯的色譜峰作為共有峰，并采用對(duì)照品結(jié)合HPLC-Q-TOFMS/MS技術(shù)對(duì)7個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為甘露醇、鳥嘌呤、尿嘧啶、尿苷、腺苷、蟲草素和鳥苷。采用相似度對(duì)雪峰蟲草11批樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，除批號(hào)S1和S2之外，其他的9批樣品相似度系數(shù)均大于0.90。系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本吻合，說明不同批次雪峰蟲草藥材化學(xué)組成存在一定差異性。共有峰主成分分析結(jié)果可知，核苷類成分在區(qū)分雪峰蟲草藥材中起到重要作用，可作為評(píng)價(jià)雪峰蟲草藥材的質(zhì)量的指標(biāo)成分。本研究建立的指紋圖譜方法簡(jiǎn)便易行，且穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性較好，為雪峰蟲草的質(zhì)量控制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯蘇維）

〔通訊作者〕*張水寒，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，E-mail: zhangshuihan0220@126.com。

〔作者簡(jiǎn)介〕秦優(yōu)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥制劑與中藥資源綜合開發(fā)。

〔基金項(xiàng)目〕湖南省科技重大專項(xiàng)（2014FJ1007）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（201267; 201322）；中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(xiàng)“國家基本藥物所需中藥原料資源調(diào)查和監(jiān)測(cè)項(xiàng)目”[財(cái)社（2011）-76]。

〔收稿日期〕2015-10-21

〔中圖分類號(hào)〕R284.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.013