4 -氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人白血病K562細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

孟　遙，張冬玲，夏　泉，2，葛金芳，陳飛虎

(安徽醫(yī)科大學(xué)1．藥學(xué)院;2．第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥　230032)

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4 -氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人白血病K562細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

孟遙1，張冬玲1，夏泉1，2，葛金芳1，陳飛虎1

(安徽醫(yī)科大學(xué)1．藥學(xué)院;2．第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥230032)

中國圖書分類號: R341; R329．25; R733．7; R977. 6; R979. 1

摘要:目的研究新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞分化作用的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制。方法1×10－6mol·L－1的ATPR及ATRA分別作用于人白血病K562細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并提取總蛋白，純化之后使用胰蛋白酶酶解，固相萃取法脫鹽，高分辨率液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測肽段，使用Proteome Discoverer 1. 2軟件尋找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，利用生物信息學(xué)DAVID數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、STRING數(shù)據(jù)庫，分析鑒定出的差異蛋白質(zhì)所具有的分子功能、所參與的生物學(xué)過程等信息。結(jié)果ATPR組特異性的蛋白質(zhì)鑒定出120個(gè)，ATRA組特異性蛋白質(zhì)有143個(gè)，兩者共有蛋白422個(gè)。DAVID分析顯示ATPR特異性蛋白質(zhì)主要參與39個(gè)生物學(xué)過程，包括蛋白質(zhì)和大分子的代謝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，ATPR組特異性蛋白質(zhì)主要參與新陳代謝過程、PI3K-Akt信號通路、TGF-β信號通路等其他癌癥相關(guān)信號通路。STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示ATPR特異性蛋白質(zhì)，如EIF3A、EIF6、RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、NACA、BTF3、NHP2L1、PPP2CA蛋白與其他≥10個(gè)相關(guān)蛋白存在直接相互作用關(guān)系。結(jié)論ATPR組特異性中心蛋白質(zhì)均參與對細(xì)胞生長增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等過程的調(diào)控，這些蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)及特異性中心蛋白質(zhì)是ATPR誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化作用的可能機(jī)制。

關(guān)鍵詞:4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯;全反式維甲酸;人白血病K562細(xì)胞;蛋白質(zhì)組學(xué);抑制增殖;誘導(dǎo)分化

陳飛虎( 1962－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者，研究方向:抗炎免疫藥理學(xué)及分子藥理學(xué)，Tel: 0551-65161116，E-mail: cfhchina@ sohu．com

全反式維甲酸可誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病( acute promyelocytic leukemia，APL)細(xì)胞分化成熟，療效明顯，其基本特點(diǎn)在于不直接殺傷腫瘤細(xì)胞而是誘導(dǎo)其分化為正?；蚪咏５募?xì)胞。但由于ATRA會出現(xiàn)維甲酸綜合癥［1］、耐藥性［2］等問題使其在臨床上的應(yīng)用受到了限制。本課題組以ATRA為先導(dǎo)化合物，通過對其碳鏈末端極性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成并經(jīng)過體外藥效學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( ATPR)具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化的活性［3－7］。目前，ATPR已經(jīng)申請自主知識產(chǎn)權(quán)(專利號: CN101591280、CN102008443A)，有望成為一種新型抗腫瘤藥物，為腫瘤患者帶來希望。

蛋白質(zhì)組( proteome)的概念最先由Marc Wilkins在1994年提出的，是指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域，并已成為尋找疾病分子標(biāo)志和藥物靶點(diǎn)最有效的方法之一。本研究以人白血病K562細(xì)胞為研究對象，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，研究ATPR與ATRA分別作用于K562細(xì)胞后蛋白質(zhì)的表達(dá)變化情況，并通過生物信息學(xué)分析來解釋ATPR對K562細(xì)胞作用的特異性可能機(jī)制及分子靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1．1材料4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( Fig 1)由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成，純度為99. 66%，用無水乙醇溶解成濃度為20 mmol·L－1的貯存液，－20℃避光保存。K562細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。RPMI 1640為Hyclone公司產(chǎn)品，小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。ATRA、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺為美國Sigma公司產(chǎn)品;總蛋白提取試劑盒購自Vazyme公司;蛋白純化試劑盒( 2D Clean-Up Kit)、蛋白定量試劑盒( 2D Quant Kit)購自GE healthcare; Trypsin Gold(貨號V5280)購自美國Promega公司;丙酮、乙腈、醋酸、甲醇、甲酸、三氟乙酸均為色譜級。高速冷凍離心機(jī)購自Beckman公司; ACCELA 600 Pump液相色譜和傅立葉變換靜電場軌道肼質(zhì)譜( LTQ Orbitrap XL)購自美國Thermo fisher公司; Xcalibur 2．1軟件和Proteome Discoverer軟件購自美國Thermo公司。

Fig 1 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate structural formula

1．2細(xì)胞培養(yǎng)和加藥處理K562細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640并加入青霉素1×105IU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱，每2天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為對照組、ATPR及ATRA組，ATPR和ATRA的終濃度均為1×10－6mol·L－1，培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集細(xì)胞。

1．3制備蛋白質(zhì)組學(xué)樣品離心收集細(xì)胞，加入500 μL細(xì)胞裂解液(臨用前加入2 μL蛋白酶抑制劑)，搖床震蕩15 min后，離心15 min，吸出上清液即為細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后取含200 μg總蛋白的裂解液，加入4倍體積的丙酮過夜沉淀。離心收集沉淀后加入12. 5 μL復(fù)溶液(尿素7 mol，硫脲2 mol，3-［( 3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸65 mmol)，完全溶解后加入87. 5 μL 50 mmol碳酸氫銨混勻。稀釋后的蛋白溶解液加入4 μL 100 mmol的二硫蘇糖醇，金屬浴50℃15 min;避光，加入4 μL 300 mmol的碘乙酰胺，放置15 min，加入4 μg胰酶(酶∶蛋白= 1∶50)混勻，于37℃恒溫水浴，孵育過夜。1 500×g離心2 min，收集液體。使用Strata-X柱樹脂脫鹽后收集洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中干燥樣品。

1．4高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜( ESI-LC-MS/MS)分析干燥后的樣品用30 μL 0. 1%甲酸溶解后進(jìn)入ESI-LC-MS/MS檢測，流動相A為0. 1%甲酸水溶液，流動相B為100%乙腈溶液，180 min梯度洗脫樣品，過程為0～10 min，B相為10%; 10～110 min，B相從10%上升至40%; 110～140 min，B相從40%上升至95%; 140～165 min，B相維持95%; 165 ～170 min，A相從5%上升至90%; 170～180 min，A相維持90%。洗脫的肽段經(jīng)納升級電噴霧離子源接口噴出，進(jìn)入LTQ Orbitrap XL高分辨率質(zhì)譜儀后分析。質(zhì)譜掃描條件如下:采用數(shù)據(jù)依賴模式，在正離子模式下進(jìn)行掃描，電噴霧電壓: 3. 8 kV;質(zhì)量掃描范圍: 300～2 000;離子傳輸毛細(xì)管溫度為200℃;一級質(zhì)譜Orbitrap分辨率: 60 000;母離子窗口: 2 u;串級質(zhì)譜碰撞歸一化能量: 35。

1．5蛋白質(zhì)鑒定和生物信息學(xué)分析對質(zhì)譜輸出的原始文件通過Proteome Discovery 1. 2軟件進(jìn)行Sequest搜索，數(shù)據(jù)庫為人源的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，來源于ftp: / /ftp．uniprot．org/pub/databases/uniprot/ current_release/knowledgebase/proteomes/。檢索參數(shù)如下: M/Z為350～5 000 u，母離子容忍度為10 ppm，碎片離子容忍度為0. 8 u，肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR均小于1%。利用生物信息學(xué)DAVID、KEGG、STRING數(shù)據(jù)庫，分析鑒定出的差異蛋白質(zhì)所具有的分子功能、所參與的生物學(xué)過程等信息。

2　結(jié)果

2．1蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果毛細(xì)管色譜柱分離樣品( Fig 2)，質(zhì)譜鑒定顯示ATPR組共計(jì)542個(gè)蛋白質(zhì)，ATRA組共計(jì)565個(gè)蛋白質(zhì)。其中，ATPR組特異性的蛋白質(zhì)有120個(gè)，ATRA組特異性的蛋白質(zhì)有143個(gè)，ATPR和ATRA共有的蛋白質(zhì)有422個(gè)( Fig 3)。

Fig 2 The total ion current of groups

2．2DAVID功能分析及KEGG通路分析結(jié)果使用DAVID數(shù)據(jù)庫分析ATPR、ATRA各自的特異性蛋白質(zhì)所參與的生物進(jìn)程( Fig 4)，ATPR特異性蛋白質(zhì)參與39個(gè)生物學(xué)過程，主要有蛋白質(zhì)和大分子的代謝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位、大分子和蛋白復(fù)合物組裝、翻譯、RNA剪接、氮化合物生物合成、核苷酸生物合成等生物學(xué)過程，ATRA特異性蛋白質(zhì)參與了22個(gè)生物學(xué)過程，涉及到翻譯、激素代謝、9-順式維甲酸代謝過程、蛋白質(zhì)折疊、核糖體小亞基的生物合成、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程的負(fù)調(diào)控、蛋白復(fù)合物組裝、非編碼RNA代謝等過程。

Fig 3 Number of specific proteins in ATPR or ATRA groups and their common proteins

Fig 4 The biological processes involved in ATPR( A) or ATRA( B) specific proteins

同時(shí)，使用KEGG pathway對特異性蛋白質(zhì)可能參與的信號通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ATPR組蛋白質(zhì)主要參與Metabolic pathways、Ribosome、RNA transport、 Spliceosome、Protein processing in endoplasmic reticulum、Purine metabolism、Parkinson’s disease、Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、TGF-beta signaling pathway等信號通路，而ATRA組蛋白質(zhì)則主要參與Ribosome、Metabolic pathways、RNA transport、Alzheimer’s disease、DNA replication、MAPK signaling pathway等信號通路。

2．3ATPR組特異性蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING在線工具分析ATPR特異性蛋白質(zhì)間的蛋白－蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)( Fig 5)，結(jié)果顯示整個(gè)網(wǎng)絡(luò)里，同其他≥6個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系的至少有33個(gè)蛋白，其中以核糖體家族蛋白RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、初期多肽相關(guān)復(fù)合體α亞基蛋白NACA、轉(zhuǎn)錄因子BTF3、真核翻譯起始因子家族蛋白EIF3A、EIF6、非組蛋白染色體蛋白NHP2L1、蛋白質(zhì)磷酸酶PPP2CA蛋白與其他≥10個(gè)相關(guān)蛋白存在直接相互作用關(guān)系，為此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心蛋白，刪除這些中心蛋白后，互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)就變得比較渙散。

Fig 5 Protein-protein interaction map of ATPR group

3　討論

ATRA能夠明顯地抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化。但由于ATRA出現(xiàn)維甲酸綜合癥等問題，限制了其應(yīng)用。課題組對ATRA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了新型維甲酸衍生物ATPR。大量體內(nèi)外研究表明［4～7］，新型維甲酸衍生物ATPR對多種腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。前期研究［4］發(fā)現(xiàn)ATPR對K562細(xì)胞也具有抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。本研究通過對ATPR和ATRA分別作用于K562細(xì)胞后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行鑒定以及生物信息學(xué)分析，從整體上研究ATPR及ATRA 對K562細(xì)胞作用下蛋白質(zhì)組學(xué)變化中的差異，研究ATPR特異性作用于K562細(xì)胞的分子機(jī)制和靶點(diǎn)。

DAVID數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果說明，ATPR特異性蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程主要集中在蛋白質(zhì)的組裝、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，核苷酸的生物合成等方面，與ATRA特異性蛋白質(zhì)涉及的過程存在差異性。同時(shí)，KEGG結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ATPR組特異性蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)處理，癌癥相關(guān)等通路，而ATRA組蛋白質(zhì)則主要參與DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路。通過STRING數(shù)據(jù)庫分析ATPR特異性蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)以EIF3A、EIF6、RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、NACA、BTF3等蛋白為中心構(gòu)成相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

真核翻譯起始因子( eukaryotic initiation factor，EIF)是參與真核生物翻譯過程的重要蛋白超家族。許多研究［8］表明，真核啟動因子EIF3A不僅在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中起重要調(diào)控作用，還參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，它與細(xì)胞的生長、分化和增殖存在著重要聯(lián)系。EIF3A可以調(diào)控核糖核苷酸還原酶M2亞基( ribo nucleotide reductase M2，RRM2)和周期依賴性激酶抑制因子p27kip( cyclin dependent kinase inhibitor p27，p27kip)等因子。Liu等［9］證實(shí)，EIF3A對鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的分化發(fā)揮著重要的作用。這說明，EIF3A在不成熟的細(xì)胞中有表達(dá)，并且其功能很可能是促進(jìn)這些細(xì)胞向成熟階段分化。另外，EIF3A與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后緊密相關(guān)。何暉等［10］認(rèn)為EIF3A的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展過程負(fù)相關(guān);對于化療藥物干預(yù)的腫瘤細(xì)胞，EIF3A的高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞不易產(chǎn)生耐藥，患者的預(yù)后更好。之后的研究中發(fā)現(xiàn)分化程度高的腫瘤中，EIF3A的表達(dá)高于低分化的腫瘤組織，此外，EIF3A高表達(dá)的患者減少了腫瘤轉(zhuǎn)移。根據(jù)本課題組前期研究［4］，ATPR可使細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E表達(dá)量減少，周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK4、CDK6也有不同程度的減少，細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子p27kip1表達(dá)變化不明顯而抑制因子p57kip2的表達(dá)量則明顯增加，提示ATPR很可能是通過EIF3A的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，EIF3A可能是ATPR抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化的靶點(diǎn)之一。

真核啟動因子6( EIF6)又叫ITGB4BP、p27BBP，作為一種核基質(zhì)，可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中調(diào)控翻譯起始。Wnt信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移、分化、凋亡等過程，其中β-catenin是關(guān)鍵分子。Wnt蛋白與Wnt配體結(jié)合后，會促使胞質(zhì)內(nèi)游離出β-catenin進(jìn)入核內(nèi)，與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子( T cell factor/ lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結(jié)合，進(jìn)而啟動下游靶基因或蛋白(如c-myc、cyclin D1)的表達(dá)。一旦Wnt信號通路激活，可促進(jìn)細(xì)胞增殖而不進(jìn)入分化。EIF6可以明顯下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的活性［11］。Wang等［12］發(fā)現(xiàn)EIF6高表達(dá)于分化后的細(xì)胞，提示可能參與癌細(xì)胞分化。結(jié)合本課題組前期研究ATPR誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過程中［13］，cmyc蛋白表達(dá)與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的表達(dá)水平均呈下降趨勢，所以預(yù)測ATPR可能是通過EIF6表達(dá)來抑制c-myc蛋白從而抑制hTERT及端粒酶活性，最終誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，提示EIF6可能是ATPR作用于K562細(xì)胞的靶點(diǎn)。

已有研究表明［14］，核糖體蛋白不僅參與蛋白質(zhì)合成，而且還參與其他功能，如細(xì)胞生長、分化、凋亡等。核糖體蛋白( ribosomal protein)表達(dá)下調(diào)及功能不全可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。作為核糖體大亞基蛋白，核糖體蛋白RPL3可通過p53來調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡，RPL3可致細(xì)胞G1/S期阻滯或細(xì)胞凋亡［15］。核糖體蛋白RPL8已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤中表達(dá)［16］。核糖體蛋白RPL13參與調(diào)控抑癌基因等過程［17］。核糖體蛋白RPL7A則與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化有關(guān)，且其所在9號染色體往往在骨肉瘤中缺失［14］，Burris等［18］報(bào)道，RPL7A還能特異性結(jié)合維甲酸受體( retinoic acid receptor，RAR)。而作為核糖體小亞基蛋白，在臨床上，RPS3的異常表達(dá)與白血病、乳腺癌、肺癌等相關(guān)。郭恒西等［19］研究顯示下調(diào)RPS3表達(dá)，會造成細(xì)胞G2/M期及S期阻滯等。另外，Ebert等［20］報(bào)道，減少造血干細(xì)胞內(nèi)核糖體小亞基蛋白RPS14表達(dá)，可導(dǎo)致造血干細(xì)胞向紅系分化受阻。本研究結(jié)果表明，ATPR作用后，可誘導(dǎo)K562細(xì)胞核糖體大小亞基蛋白RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14表達(dá)，而在ATRA組沒有誘導(dǎo)這些蛋白表達(dá)，提示這些核糖體亞基蛋白也可能是ATPR特異性發(fā)揮作用的靶標(biāo)。

初期多肽相關(guān)復(fù)合體( nascent polypeptide-associated complex，NAC)是一種多功能的蛋白，其α亞基即NACA，能調(diào)控Fas相關(guān)死亡域蛋白( Fas associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)等一系列相關(guān)的功能。Lopez等［21］研究了NACA在人體造血中的作用，發(fā)現(xiàn)NACA不僅能加快紅細(xì)胞的分化速度，還可以正向調(diào)控人紅細(xì)胞的分化。與NACA蛋白二聚化的對象為轉(zhuǎn)錄因子BTF3。Liu等［22］在胃癌SGC7901細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BTF3可使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，下調(diào)BTF3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。還有研究［23］證實(shí)了蛋白質(zhì)磷酸酶PPP2CA參與皮膚組織分化信號通路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ATPR誘導(dǎo)的特異性中心蛋白質(zhì)的改變均參與對細(xì)胞生長增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等過程的調(diào)控，而ATRA作用下不具有這些蛋白質(zhì)，這是兩者的差異性。另外，我們推斷，這些特異性蛋白質(zhì)及其組建的相互作用網(wǎng)絡(luò)，是ATPR抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化等作用的可能機(jī)制，而本研究也從整體上為ATPR誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化作用的分子靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝導(dǎo)師陳飛虎教授對我的課題的悉心指導(dǎo)，感謝夏泉老師對我的課題及實(shí)驗(yàn)的耐心傳授，感謝葛金芳老師課題的細(xì)心解答，感謝實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們對我的實(shí)驗(yàn)提供的幫助。)

參考文獻(xiàn):

［1］Dhar A K，Barman P K．Retinoic acid proteomics syndrome-cardiac complication［J］．J Assoc Physicians India，2012，60: 63－5．

［2］Tomita A，Kiyoi H，Naoe T．Mechanisms of action and resistance to all-trans retinoic acid ( ATRA) and arsenic trioxide( As2O3) in acute promyelocytic leukemia［J］．Int J Hematol，2013，97( 6) : 717－25．

［3］阮晶晶，陳飛虎，徐佼，等．新型維甲酸衍生物誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的初步研究［J］．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13 ( 11) : 1237－42．

［3］Ruan J J，Chen F H，Xu J，et al．Preliminary study of NB4 cell differentiation induced by retinoic acid derivatives［J］．Chin J Clin Pharmacol Ther，2008，13( 11) : 1237－42．

［4］阮晶晶，陳飛虎，徐佼，等．4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對K562細(xì)胞分化和細(xì)胞周期的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25( 9) : 1238－43．

［4］Ruan J J，Chen F H，Xu J，et al．4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate induced K562 cell differentiation and cell cycle influence［J］．Chin Pharmacol Bull，2009，25( 9) : 1238－43．

［5］汪楠，陳飛虎，葛金芳，等．4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對MCF-7細(xì)胞增殖和分化的影響及其機(jī)制研究［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29( 6) : 767－72．

［5］Wang N，Chen F H，Ge J F，et al．Effects of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on proliferation and differentiation of MCF-7 cell and its possible mechanisms［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29( 6) : 767－72．

［6］彭曉清，陳飛虎，葛金芳，等．4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯通過PTEN/PI3K/Akt抑制YAC-1細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其分化［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30( 1) : 60－5．

［6］Peng X Q，Chen F H，Ge J F，et al．Effects of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on proliferation and differentiation of YAC-1 cells via PTEN/PI3K/Akt［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 1) : 60－5．

［7］雷靜，陳飛虎，葛金芳，等．4 -氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231誘導(dǎo)分化作用及可能的機(jī)制研究［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31( 7) : 973－9．

［7］Lei J，Chen F H，Ge J F，et al．Inducing effect of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on differentiation of human breast cancer MDA-MB-231 cell and its possible mechanisms［J］．Chin Pharmacol Bull，2015，31( 7) : 973－9．

［8］徐瀟靜，周宏灝，劉昭前．eIF3a的生物學(xué)功能研究進(jìn)展［J］．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15( 2) : 219－24．

［8］Xu X J，Zhou H H，Liu Z Q．Recent research progress of eIF3 in biological function［J］．Chin J Clin Pharmacol Ther，2010，15 ( 2) : 219－24．

［9］Liu Z，Dong Z，Yang Z，et al．Role of eIF3a ( eIF3 p170) in intestinal cell differentiation and its association with early development［J］．Differentiation，2007，75( 7) : 652－61．

［10］何暉，尹繼業(yè)，周宏灝，等．eIF3a與腫瘤的研究進(jìn)展［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30( 4) : 445－8．

［10］He H，Yin J Y，Zhou H H，et al．Research progress on eIF3a and cancer［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 4) : 445－8．

［11］賴慶梧，彭旭，譚江琳，等．ITGB4BP對Wnt/β-catenin信號通路活性的下調(diào)作用［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32 ( 18) : 1945－8．

［11］Lai Q W，Peng X，Tan J L，et al．ITGB4BP downregulates activity of Wnt/β-catenin signaling pathway in HEK293 cells［J］．J Third Mil Med Univ，2010，32( 18) : 1945－8．

［12］Wang J，Jiao H，Stewart T L，et al．Improvement in postburn hypertrophic scar after treatment with IFN-alpha2b is associated with decreased fibrocytes［J］．J Interferon Cytokine Res，2007，27 ( 11) : 921－30．

［13］陳慧慧，陳飛虎，徐佼，等．c-myc、hTERT在4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化中的作用［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46( 3) : 235－9．

［13］Chen H H，Chen F H，Xu J，et al．Effects of c-myc，hTERT on differentiation of NB4 cells induced by 4-amino-2-trifluoromethy-l phenyl retinate［J］．Acta Univ Med Anhui，2011，46( 3) : 235－9．

［14］鄭水兒，林峰，沈贊，等．核糖體蛋白L7A在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義［J］．中國癌癥雜志，2009，19( 2) : 101－5．

［14］Zheng S E，Lin F，Shen Z，et al．Expression of ribosomal protein L7a ( RPL7A) in human osteosarcoma and its clinical significance ［J］．China Oncol，2009，19( 2) : 101－5．

［15］Russo A，Esposito D，Catillo M，et al．Human rpL3 induces G1/ S arrest or apoptosis by modulating p21waf1/cip1levels in a p53-in-dependent manner［J］．Cell Cycle，2013，12( 1) : 76－87．

［16］Swoboda R K，Somasundaram R，Caputo L，et al．Shared MHC class II-dependent melanoma ribosomal protein L8 identified by phage display［J］．Cancer Res，2007，67( 8) : 3555－9．

［17］Takemasa I，Kittaka N，Hitora T，et al．Potential biological insights revealed by an integrated assessment of proteomic and transcriptomic data in human colorectal cancer［J］．Int J Oncol，2012，40( 2) : 551－9．

［18］Burris T P，Nawaz Z，Tsai M J，et al．A nuclear hormone receptor-associated protein that inhibits transactivation by the thyroid hormone and retinoic acid receptors［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995，92( 21) : 9525－9．

［19］郭恒西，陳慧，詹軼群，等．核糖體蛋白RPS3 Ser209影響NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及其與DNA結(jié)合能力［J］．軍事醫(yī)學(xué)，2015，39( 2) : 117－22．

［19］Guo H X，Chen H，Zhan Y Q，et al．Effect of ribosomal protein S3 Ser209 on NF-κB transcriptional activity and its DNA binding capacity［J］．Mili Med Sci，2015，39( 2) : 117－22．

［20］Ebert B L，Pretz J，Bosco J，et al．Identification of RPS14 as a 5q- syndrome gene by RNA interference screen［J］．Nature，2008，451( 7176) : 335－9．

［21］Lopez S，Stuhl L，F(xiàn)ichelson S，et al．NACA is a positive regulator of human erythroid-cell differentiation［J］．J Cell Sci，2005，118 ( 8) : 1595－605．

［22］Liu Q，Zhou J P，Li B，et al．Basic transcription factor 3 is involved in gastric cancer development and progression［J］．World J Gastroenterol，2013，19( 28) : 4495－503．

［23］陳霞．小鼠皮膚特異性敲除Ppp2ca基因?qū)γl(fā)生長的影響［D］．南京:南京醫(yī)科大學(xué)，2014．

［23］Chen X．Effect of mouse skin specific knockout Ppp2ca gene on hair growth［D］．Nanjing: Nanjing Medical University，2014．

The proteomics research of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on human leukemia K562 cells

MENG Yao1，ZHANG Dong-ling1，XIA Quan1，2，GE Jin-fang1，CHEN Fei-hu1
( 1．College of Pharmacy，Anhui Medical University; 2．Dept of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:AimTo explore the proteomics mechanism of the differentiation induction effect of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate( ATPR) on human leukemia K562 cells．Methods Human leukemia K562 cells were incubated with the same concentration ( 1×10－6mol·L－1) of ATPR or ATRA for 48 hours．The total cell proteins were collected，purified and digested by trypsin，solid phase extraction，and the peptides were detected by ESI-LC-MS/MS．The difference of the protein expression between the cells treated with ATPR and ATRA was compared by using the Discoverer Proteome 1. 2 software，and the molecular function，the biological process and other information of those proteins were analyzed based on the DAVID，KEGG，STRING databases．Results120 specific proteins were identified only in the ATPR group，143 only in the ATRA group，and 422 other proteins in both groups．Results of DAVID analysis showed that ATPR-induced specific proteins were mainly involved in 39 biological processes of proteins and macromolecules metabolism，protein transport and localization and so on．Results of KEGG analysis revealed that ATPR-induced proteins participated in signal pathways，mainly metabolic pathways，PI3K-Akt signal pathway，TGF-beta signal pathway and other pathways in cancer．String protein interaction network analysis displayed that ATPR-induced proteins，like EIF3A，EIF6，RPL3，RPL8，RPL13，RPL7A，RPL21，RPS3，RPS14，NACA，BTF3，NHP2L1，PPP2CA proteins had direct interactions with more than or equal to 10 associated proteins．ConclusionThe differentiation induction effect of ATPR on K562 cells might be ascribed to the ATPR-induced proteins interaction network and the specific central proteins it induced，which are involved in the regulation of cell proliferation，differentiation and apoptosis．

Key words:ATPR; ATRA; human leukemia K562 cells; proteomics; inhibition of proliferation; induced differentiation

作者簡介:孟遙( 1991－)，女，碩士生，研究方向:藥學(xué)，E-mail: mengyaochina@ gmail．com;

基金項(xiàng)目:國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)( No 2011 ZX09401-021)

收稿日期:2015－10－27，修回日期: 2015－11－16

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0027－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．007