高架〇迷宮實驗:昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型的重測信度研究

孫世光

( 1．山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥學部，山東濟南　250001;2.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學部，山東濟南　250001; 3．山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南　250355)

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高架〇迷宮實驗:昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型的重測信度研究

孫世光1，2，3

( 1．山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥學部，山東濟南250001;2.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學部，山東濟南250001; 3．山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南250355)

中國圖書分類號: R-332; R363-332; R749．72

摘要:目的探討高架〇迷宮實驗( elevated zero maze，EZM)作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型的重測信度。方法昆明小鼠( 4周齡，♂/♀)進行EZM實驗，實驗間隔1周進行2次，采用攝像系統(tǒng)記錄5 min行為變化，包括兩臂區(qū)進入時間及進入次數(shù);納入實驗參數(shù)有:開臂區(qū)進入時間百分率( Otime%)、開臂區(qū)進入時間( Otime)、閉臂區(qū)進入時間( Ctime)、開臂區(qū)進入次數(shù)百分率( Oentries%)、開臂區(qū)進入次數(shù)( Oentries)、閉臂區(qū)進入次數(shù)( Centries)及兩臂區(qū)進入總次數(shù)( Entries) ;通過組內(nèi)相關(guān)系數(shù)( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數(shù)( kappa agreement index，κ) 對EZM進行重測信度檢驗，并分析性別、重復(fù)測量等因素對EZM行為模式的影響。結(jié)果ICC結(jié)果顯示，Otime% (♂ICC =0．753，P＜0．01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC = 0. 719，P＜0. 01;♀ICC = 0. 494，P ＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測重測信度相對較好，且有統(tǒng)計學意義;κ結(jié)果顯示，Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries(♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ=0. 469，P＜0. 01)有統(tǒng)計學意義，但初測重測信度相對較差。結(jié)論Otime%、Entries作為EZM評價狀態(tài)焦慮動物模型的穩(wěn)定參數(shù)，具有尚可接受的重測信度;尤其應(yīng)注意♂/♀(強烈推薦♂)對EZM重測信度影響效應(yīng)相對較大，而重復(fù)測量影響效應(yīng)相對較小。

關(guān)鍵詞:高架〇迷宮;狀態(tài)焦慮;動物模型;重測信度;性別;重復(fù)測量;昆明小鼠

高架〇迷宮實驗( elevated zero maze，EZM)是評價狀態(tài)焦慮動物模型的經(jīng)典方法之一，廣泛應(yīng)用于精神神經(jīng)藥理學基礎(chǔ)研究; EZM源于高架十字迷宮實驗( elevated plus maze，EPM)，兩者原理都是基于實驗動物探索習性與危險環(huán)境之間的矛盾沖突。EZM作為焦慮動物模型進行藥理學評價時，常受實驗環(huán)境、實驗操作及實驗動物種屬、品系、性別等諸多因素影響而導(dǎo)致結(jié)果不盡一致［1－3］;本研究采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數(shù)( kappa agreement index，κ)［4］，初步探討EZM作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型的重測信度，篩選出穩(wěn)定參數(shù)，并進行行為模式分析。

1　材料與方法

1．1實驗動物昆明小鼠，♂/♀，由山東大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK(魯) 20130001;室溫( 20±2)℃，光照12 h( 18: 00～6: 00)和黑暗12 h( 6: 00～18: 00)環(huán)境，自由進水飲食飼養(yǎng);預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量( 20±2) g小鼠進入正式實驗(所有實驗均于6: 00～18: 00進行)。

1．2實驗裝置木質(zhì)〇迷宮( 65 cm×5 cm)，包括2部分:兩相對開臂區(qū)( 30 cm×5 cm)，兩相對閉臂區(qū)，附有立墻( 30 cm×5 cm×30 cm) ;〇迷宮離地面50 cm，實驗由25 W紅燈泡離圓心40 cm高處照明［5］。

1．3實驗操作操作者將小鼠放入高架〇迷宮任一開臂區(qū)中間，頭面對圓心，用攝像系統(tǒng)記錄動物5 min的行為變化，包括兩臂區(qū)進入時間及進入次數(shù);其中，小鼠4只爪子由一臂區(qū)均進入另一臂區(qū)方可開始記錄實驗參數(shù)。每只動物實驗結(jié)束后清除糞便，用70%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布抹干，以免前一只動物的殘留氣味造成對本次實驗的影響;全部實驗結(jié)束后由不熟悉實驗設(shè)計人員進行數(shù)據(jù)提取錄入。EZM納入實驗參數(shù)有:開臂區(qū)進入時間百分率( Otime%)、開臂區(qū)進入時間( Otime)、閉臂區(qū)進入時間( Ctime)、開臂區(qū)進入次數(shù)百分率( Oentries%)、開臂區(qū)進入次數(shù)( Oentries)、閉臂區(qū)進入次數(shù)( Centries)及兩臂區(qū)進入總次數(shù)( Entries) ;其中實驗參數(shù)Otime%、Entries數(shù)據(jù)又進行分割細化處理，按照5個重復(fù)測量片段( 1 min)來進行提取。

1．4統(tǒng)計學分析采用SPSS 13．0 for Windows軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 6．0軟件進行統(tǒng)計作圖。重測信度采用ICC和κ統(tǒng)計參數(shù)來評價，其中ICC參數(shù)主要適用于連續(xù)變量或等級變量，由Analyze→Scale→Reliability Analysis程序完成;κ參數(shù)主要適用于分類變量，由Analyze→Descriptive statistics→Crosstabs程序完成，分析前首先根據(jù)1st分位數(shù)、3rd分位數(shù)進行低( Low≤1st分位數(shù))、中( 1st分位數(shù)＜Medium＜3rd分位數(shù))、高( High≥3rd分位數(shù))狀態(tài)分類; ICC/κ: ＞0. 75認為一致性很好，0. 50～0. 75認為一致性一般，＜0．50則認為一致性較差。此外，EZM實驗參數(shù)Otime%、Entries所有數(shù)據(jù)先進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗，而后依據(jù)其結(jié)果，總體數(shù)據(jù)進行t檢驗，而重復(fù)測量數(shù)據(jù)則進行Wilcoxon檢驗和Friedman檢驗［4，6－9］。

Tab 1 Intraclass correlation coefficient ( ICC) between Test and Retest of elevated zero maze

Tab 2 Kappa agreement index (κ) between Test and Retest of elevated zero maze

2　結(jié)果

Fig 1 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Otime%”parameter

Fig 2 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter

2．1EZM重測信度檢驗ICC參數(shù)提示，Otime% (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC =0. 719，P＜0. 01;♀ICC =0. 494，P＜0. 05; ♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC =0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC =0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測重測信度較好，且有統(tǒng)計學意義。見Tab 1，F(xiàn)ig 1、2。κ參數(shù)提示，Otime% (♂κ=0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ= 0. 469，P＜0. 01)有統(tǒng)計學意義，但初測重測信度相對較差。見Tab 2、3、4。

2．2EZM行為模式分析Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，Otime%、Entries總體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，而重復(fù)測量數(shù)據(jù)則僅部分符合正態(tài)分布( P＞0. 05)。t檢驗結(jié)果提示，與初測相比，重測EZM實驗參數(shù)Otime% (♂t(yī) = 0. 447，♀t = 1. 626，♂+♀t = 1. 612，P＞0. 05)、Entries(♂t(yī) =－0. 441，♀t =0. 949，♂+♀t =0. 551，P＞0. 05)差異無統(tǒng)計學意義。Wilcoxon檢驗結(jié)果提示( Fig 3)，與初測相比，重測EZM實驗參數(shù)Otime%在第2ndmin(♀z =－3. 37，P＜0. 01;♂+♀z=－2. 70，P＜0. 01)均降低且差異有統(tǒng)計學意義，而Entries亦在第2ndmin(♀z =－2. 74，P＜0. 01)降低且差異有統(tǒng)計學意義。Friedman檢驗結(jié)果提示，初測EZM實驗參數(shù)Otime%(♂χ2=16. 63，P＜0. 01;♀χ2=11. 22，P＜0. 05;♂+♀χ2=26. 88，P＜0. 01)、Entries(♀χ2=22. 29，P＜0. 01; ♂+♀χ2=21. 77，P＜0. 05)及重測EZM實驗參數(shù)Otime% (♂χ2=13. 58，P＜0. 01;♀χ2=31. 38，P＜0. 01;♂+♀χ2=41. 91，P＜0. 01)、Entries(♂χ2= 13. 52，P＜0. 01;♂+♀χ2=16. 53，P＜0. 01)重復(fù)測量片段間差異均有統(tǒng)計學意義。

Tab 3 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the “Otime%”parameter categories ( low，medium and high)

Tab 4 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter categories ( low，medium and high)

3　討論

EZM是Shepherd等［10］于1992年最先提出，其原理亦是基于實驗動物探索習性與危險環(huán)境之間矛盾沖突，是一種相當于EPM變型的新型焦慮動物模型;但是EZM又不同于EPM［10－11］:①沒有中央?yún)^(qū)，不存在中央“死時間”;②實驗動物探索行為是連續(xù)的，不受到兩臂區(qū)末端影響;③兩臂區(qū)之間可以直接轉(zhuǎn)換，不需要經(jīng)過中央?yún)^(qū)過渡，而EZM同時也存在這樣一個問題:即兩臂區(qū)進入次數(shù)通常相等或者僅差1，導(dǎo)致兩臂區(qū)進入次數(shù)百分率實驗參數(shù)失去評價意義。

Shepherd等［12］研究發(fā)現(xiàn)，抗焦慮藥物可明顯增加SD大鼠EZM開臂區(qū)進入時間百分率和開臂區(qū)低頭探索頻次，減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次，而致焦慮藥物則產(chǎn)生相反效應(yīng);同時一定劑量范圍抗抑郁藥物5-HT1A受體激動劑( 0. 001～0. 1 mg·kg－18-OH-DPAT)可減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次，5-HT3A受體拮抗劑( 0. 0001～1. 0 mg·kg－1昂丹司瓊)可增加開臂區(qū)進入時間百分率，減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次。Cook等［13］研究比較了3個不同遠交品系和2個不同雜交品系小鼠對EZM重復(fù)測量效應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)不同品系是通過不同感官(視覺、嗅覺等)來收集EZM初始位置，以避免進入EZM開臂區(qū)危險域。Milner等［14］研究比較了15個不同近交品系小鼠焦慮動物模型行為模式，發(fā)現(xiàn)EZM及曠場實驗、明暗箱實驗中反映焦慮情緒相關(guān)行為參數(shù)與反映運動探索相關(guān)行為參數(shù)無法區(qū)分，而與反映緊張情緒糞便粒數(shù)參數(shù)可以加以區(qū)分。Kulkarni等［15］研究不同類別抗焦慮藥物，包括安定類、巴比妥類、乙醇、印防己毒素(通道阻滯劑)、戊四唑、氟馬西尼( BDZRs拮抗劑)等，發(fā)現(xiàn)EZM對以苯二氮卓類受體( BDZRs) -γ-氨基丁酸A受體( GABAAR) -氯離子通道復(fù)合物為作用靶點的工具藥物均有效。

Fig 3 Behavioral pattern of elevated zero maze for the“Otime%”( ABC)＆“Entries”( DEF) parameters during a 5-minute observation period

本研究ICC和κ結(jié)果均提示，EZM實驗參數(shù)重測信度受性別影響較大，♂昆明小鼠EZM重測信度相對較好(尤其是Otime%和Entries)，而♀昆明小鼠EZM重測信度相對較差; Wilcoxon檢驗結(jié)果也顯示僅♀昆明小鼠EZM實驗參數(shù)Otime%、Entries在初測重測第2ndmin均有顯著性差異。此外，盡管Friedman檢驗結(jié)果顯示♂/♀昆明小鼠EZM實驗參數(shù)Otime%、Entries在5個重復(fù)實驗片段中具有波動性，但是t檢驗結(jié)果仍然證實，♂/♀昆明小鼠EZM實驗參數(shù)Otime%、Entries受重復(fù)測量效應(yīng)影響相對較小。因此，EZM作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型進行評價時，推薦采用Otime%、Entries實驗參數(shù)，推薦采用♂實驗動物，而間隔1周重復(fù)測量效應(yīng)可以忽略。動物模型是研究疾病發(fā)生機制和評價藥物效應(yīng)的有力工具;動物模型行為具有多維性，是結(jié)構(gòu)和功能共同相互作用的結(jié)果;有關(guān)EZM狀態(tài)焦慮動物模型相關(guān)研究將在后續(xù)研究陸續(xù)報道。

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Elevated zero maze as an animal model of state anxiety in Kunming mice: test-retest reliability

SUN Shi-guang1，2，3
( 1．Dept of Pharmacy，Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine Jinan 250001，China; 2. Dept of Pharmacy，Shandong Provincial Hospital of Integrated Medicine，Jinan 250001，China; 3．College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Abstract:AimTo explore the test-retest reliability of elevated zero maze ( EZM)，as an animal model of state anxiety in Kunming mice．Methods The behavior of adult，male and female，Kunming mice in EZM was recorded twice，for five minutes，with a one-week inter-trial interval．The following parameters were evaluated: percentage of time on EZMopen arms ( Otime%)，time on EZM open arms ( Otime)，time on EZM closed arms ( Ctime)，percentage of entries into EZM open arms ( Oentries%)，entries into EZM open arms ( Oentries)，entries into EZM closed arms ( Centries)，total entries into EZM open and closed arms ( Entries)．Subsequently，the intraclass correlation coefficient ( ICC) and the kappa agreement index (κ) were calculated for these parameters．Results ICC for Otime%(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，Otime (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)，Ctime (♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，and Oentries (♂ICC =0. 719，P＜0. 01; ♀ICC =0. 494，P＜0. 05;♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)， Centries (♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)，Entries (♂ICC = 0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 05) showed a good and fair test-retest reliability，respectively．Only κ for Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)，Ctime (♂κ=0. 393，P＜0. 05)，Oentries (♂κ= 0. 308，P ＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)，Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ=0. 238，P＜0. 05)，Entries (♂κ=0. 469，P＜0. 01) displayed a significant but poor reliability between the test-retest trials．ConclusionsThe parameters Otime% and Entries for Kunming mice in EZM are stable over time，and indicate an acceptable reliability with a one-week inter-trial interval．Meanwhile，more attention should be paid not to repeated measure effect，but to the sex effect ( Male animals recommended to EZM，especially)．

Key words:elevated zero maze; state anxiety; animal model; test-retest reliability; sex; repeated measurement; Kunming mice

作者簡介:孫世光( 1983－)，男，博士生，主管中藥師，通訊作者，研究方向:方劑配伍規(guī)律與證候動物模型構(gòu)建及其評價，Tel: 0531-82436123/82436487，E-mail: s．g．sun@ hotmail．com

基金項目:國家自然科學基金青年基金項目( No 81302887) ;山東省科技發(fā)展計劃項目( No 2014GSF119034) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目( No 2015-131) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目( No 2013-103) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目( No 2011-107)

收稿日期:2015－10－04，修回日期: 2015－11－03

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0133－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．028