EGCG對(duì)順鉑損傷HEK293細(xì)胞及殺傷A549細(xì)胞的影響

連燕娜，郭淑琴，周綺云，高兆蘭，王　 海，高麗萍*（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　 100083）

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EGCG對(duì)順鉑損傷HEK293細(xì)胞及殺傷A549細(xì)胞的影響

連燕娜，郭淑琴，周綺云，高兆蘭，王 海，高麗萍*
（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

【摘要】目的： 探討表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)順鉑(DDP)致人胚腎HEK293細(xì)胞損傷及對(duì)DDP殺傷人肺癌A549細(xì)胞的影響。方法：體外培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞，分為對(duì)照組、DDP組和DDP+EGCG組，DDP組和DDP+EGCG組同時(shí)建立DDP損傷模型，MTT法檢測(cè)EGCG和/或DDP對(duì)HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果：EGCG對(duì)HEK293細(xì)胞的IC50值為61.6 mg/L。當(dāng)EGCG濃度<40 mg/L時(shí)，對(duì)DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷沒(méi)有顯著性影響，EGCG濃度≥40 mg/L時(shí)，可顯著性增強(qiáng)DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的損傷作用。EGCG對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為33.6 mg/L。當(dāng)EGCG濃度≥32 mg/L時(shí)，可顯著增強(qiáng)DDP對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)論：EGCG對(duì)DDP所致HEK293細(xì)胞損傷無(wú)保護(hù)作用，但EGCG對(duì)癌細(xì)胞毒性作用大于其對(duì)正常細(xì)胞的毒性，且當(dāng)EGCG與DDP同時(shí)使用時(shí)可以加重A549細(xì)胞損傷。

【關(guān)鍵詞】表兒茶素沒(méi)食子酸酯；順鉑；腎毒性；抗腫瘤

作者信息： 連燕娜，E-mail：lianyanna2009@sina.com。*通信作者，高麗萍，E-mail：gaolip62@163.com

Effects of epigallocatechin gallate on cisplatin-induced cytotoxicity in HEK293 and A549 cell lines

LIAN Yanna，GUO Shuqin，ZHOU Qiyun，GAO Zhaolan，WANG Hai，GAO Liping*
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biologically Active Substances and Functional Food, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the effects of epigallocatechin gallate (EGCG) on cisplatin (DDP)-induced cytotoxicity in human embryo kidney (HEK) 293 cells and A549 cells. METHODS：HEK293 cells and A549 cells were cultured in vitro，and effects of DDP and EGCG on HEK293 cells and A549 cells were observed by MTT. The cells were divided into control group，DDP group and DDP+EGCG group. Then，the rates of HEK293 and A549 cell death were investigated by MTT. RESULTS：The IC50of EGCG on HEK293 cells was 61.6 mg/L. At lower than 40 mg/L，EGCG had no significantly effects on DDP-induced HEK239 cell death. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced HEK239 cell death. The IC50of EGCG on A549 cells was 33.6 mg/L. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced A549 cell death. CONCLUSION：EGCG had no significant protective effects on DDP-induced HEK239 cell death，but EGCG induced more cytotoxicity on cancer cells than on normal cells. When co-treated with DDP，A549 cell s ustained m ore damage than H EK239 c ells.

【KEY WORDS】epigallocatechin gallate；cisplatin；nephrotoxicity；anticancer

順鉑[cis-dichlorodiamineplatinum(II)，DDP]是一種廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，臨床上應(yīng)用于多種癌癥的治療，如肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胸腺癌等[1-4]。DDP在體內(nèi)主要經(jīng)腎臟排泄，在腎臟內(nèi)聚集濃度最高，腎毒性也是限制DDP臨床大量應(yīng)用的主要因素之一。近年來(lái)，在DDP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，合成了大量的DDP類似物，進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，最終有30個(gè)左右化合物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，但在抗癌活性和副作用的綜合評(píng)價(jià)上均未超過(guò)DDP，更不能取代[5]。因此，增強(qiáng)DDP抗癌效果，降低DDP毒副作用就成為目前藥理學(xué)、毒理學(xué)和腫瘤臨床治療關(guān)注的熱點(diǎn)。兒茶素類物質(zhì)又稱茶單寧，是茶葉茶多酚中的重要活性成分之一，主要包括兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)等，其中EGCG是茶多酚中含量最高、活性最強(qiáng)的單體[6]。研究顯示兒茶素類物質(zhì)具有抗菌、抗炎、防癌抗癌、抗氧化、保肝等多種生物活性[7-9]，現(xiàn)已引起國(guó)內(nèi)外研究者的普遍重視。但兒茶素類物質(zhì)對(duì)DDP所致腎毒性是否有保護(hù)作用，對(duì)DDP抗癌效果是否有影響均尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法探討了EGCG對(duì)DDP致人胚腎HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及對(duì)DDP體外殺傷人肺癌A549細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚腎細(xì)胞(HEK293)和人肺腺癌細(xì)胞(A549)均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。DDP(批號(hào)406022CF)，注射用凍干粉劑，購(gòu)自齊魯制藥有限公司；EGCG，純度大于98%(高效液相色譜法檢測(cè))，購(gòu)自北京金寶在線科技有限公司；0.25%胰酶和DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Genview公司；胎牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；四甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為70%~80%時(shí)傳代并接種于新培養(yǎng)瓶中，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)DDP對(duì)HEK293和A549細(xì)胞的毒性作用 將處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同終濃度DDP的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，HEK293細(xì)胞DDP濃度分別為0、2、4、8、16、32、40、60 mg/mL，A549細(xì)胞DDP濃度分別為0、5、7.5、10、15、20、25、30 mg/mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率。

1.2.3 MTT法檢測(cè)EGCG對(duì)HEK293和A549細(xì)胞存活率的影響 將處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同終質(zhì)量濃度的EGCG(0、2、4、8、16、32、40、50、60 mg/mL)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.4 MTT法檢測(cè)EGCG對(duì)DDP致HEK293和A549細(xì)胞損傷的影響 將處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，加藥處理。試驗(yàn)分3組：對(duì)照組，未加入DDP和EGCG；DDP組，HEK293細(xì)胞采用濃度為20 mg/L的DDP處理24 h， A549細(xì)胞采用濃度為10 mg/L的DDP處理24 h； DDP+EGCG組，在加DDP前4 h加入不同濃度EGCG孵育細(xì)胞，HEK293細(xì)胞EGCG濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/mL，A549細(xì)胞EGCG濃度分別為2、4、8、16、32、40、50、60 mg/mL。不加藥的組在加藥時(shí)加入相應(yīng)量的溶劑作為對(duì)照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.5 MTT法測(cè)定HEK293和A549細(xì)胞存活率 細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，向培養(yǎng)基中加入 MTT，使終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清并加入DMSO(每孔100 μL)，混勻10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)(測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)630 nm)吸光度值D(570)。細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組D(570)值/對(duì)照組D(570)值。細(xì)胞抑制率=(1-細(xì)胞存活率)× 100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方-法

結(jié)果以x±s標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照組、DDP組和DDP+EGCG組細(xì)胞存活率間差異的分析采用單因素方差分析和S-NK法，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，用EXCEL軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對(duì)HEK293細(xì)胞的作用

2.1.1 DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性 如圖1所示，隨著DDP濃度增高，對(duì)HEK293細(xì)胞的抑制率逐漸升高。當(dāng)DDP濃度為60 mg/L，所測(cè)細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，即抑制率為85%±3%。通過(guò)SPSS軟件得出DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的IC50值為18.78 mg/L，選用整數(shù)20 mg/L作為建立HEK293細(xì)胞DDP損傷模型的濃度。

2.1.2 EGCG對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響 如圖2所示，EGCG濃度低于40 mg/L時(shí)，對(duì)HEK293細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著性影響，而隨EGCG濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)EGCG濃度高于50 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。通過(guò)SPSS軟件得出EGCG對(duì)HEK293細(xì)胞的IC50值為61.6 mg/L。

2.1.3 EGCG對(duì)DDP致HEK293細(xì)胞損傷的影響 如圖3所示，當(dāng)EGCG濃度較低，即低于20 mg/L時(shí)，EGCG對(duì)DDP所致的HEK293細(xì)胞損傷無(wú)明顯的保護(hù)作用。當(dāng)EGCG濃度≥40 mg/L時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率顯著低于DDP損傷組(P<0.05)，可能是因?yàn)镋GCG高于一定濃度后，其本身就對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以更加重了DDP對(duì)細(xì)胞的損傷。

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖1 DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用(n=5)

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖2 不同濃度EGCG對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響(n=5)

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DDP模型組比較，#P<0.05.圖3 不同濃度EGCG對(duì)DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的影響(n=5)

2.2 EGCG對(duì)A549細(xì)胞的作用

2.2.1 DDP對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用 如圖4所示，隨著DDP濃度增高，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率逐漸升高。當(dāng)DDP濃度為30 mg/L，所測(cè)細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，即抑制率為85%±4%。DDP對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為10.68 mg/L，因此選用10 mg/L作為建立A549細(xì)胞DDP損傷模型的濃度。

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖4 DDP對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用(n=5)

2.2.2 EGCG對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響 如圖5所示，EGCG可以顯著抑制A549細(xì)胞的增殖(P<0.05)， 且隨著EGCG濃度的增大，A549細(xì)胞存活率逐漸降低。說(shuō)明細(xì)胞增殖抑制率與EGCG的濃度存在濃度效應(yīng)關(guān)系。EGCG對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為33.65 mg/L，提示EGCG可能具有很好的抗癌效果。

與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖5 EGCG對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響(n=5)

2.2.3 EGCG對(duì)DDP殺傷A549細(xì)胞的影響 如圖6所示，用終濃度為10 mg/L的DDP建立A549細(xì)胞損傷模型，當(dāng)EGCG濃度為2~16 mg/L時(shí)，與DDP處理組比較，A549細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異(P>0.05)，當(dāng)EGCG濃度≥32 mg/L時(shí)，A549細(xì)胞存活率顯著低于DDP損傷組(P<0.05)，且隨EGCG濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸降低，說(shuō)明EGCG高于一定濃度后可以加重DDP對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DDP模型組比較，#P<0.05.圖6 EGCG對(duì)DDP殺傷A549細(xì)胞的影響(n=5)

3 討 論

DDP是臨床上廣泛應(yīng)用的一種抗腫瘤藥物，由于DDP進(jìn)入機(jī)體后主要通過(guò)腎臟排泄，所以其腎毒性最為明顯。DDP在腎臟組織中高濃度分布和長(zhǎng)時(shí)間蓄積是其腎毒性的作用基礎(chǔ)。DDP中的重金屬離子Pt2+，易于和蛋白質(zhì)、酶等生物分子中的巰基(-SH)結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)和酶失活，使人體組織或細(xì)胞受到損傷[10]。另外DDP進(jìn)入細(xì)胞后，氯離子會(huì)很快被水分子取代，DDP被水化后形成親電子的活化形式，可以產(chǎn)生大量自由基和活性氧簇(ROS)，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷線粒體。前期研究表明，氧化應(yīng)激和線粒體損傷是DDP所致腎損傷的主要因素之一[11]。并且細(xì)胞中大量的自由基和ROS可以激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。由此可見(jiàn)，DDP在腎組織中引起的損傷可能是多靶位，多方向的。

EGCG是綠茶中茶多酚的主要活性物質(zhì)，大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥作用[13]，并且EGCG通過(guò)其抗炎、抗氧化的效應(yīng)對(duì)改善腎臟炎癥、組織損傷和腎功能方面有著一定的作用[14]。本研究結(jié)果顯示EGCG對(duì)DDP所致HEK293細(xì)胞損傷沒(méi)有顯著性的保護(hù)作用，可能是因?yàn)镈DP引起的細(xì)胞損傷是多靶位的，而EGCG的抗氧化作用不足以保護(hù)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

近年來(lái)，隨著研究的深入，DDP抗腫瘤作用的機(jī)制越來(lái)越清楚。持續(xù)性分裂是癌細(xì)胞的主要特征之一。DDP進(jìn)入細(xì)胞后，氯離子會(huì)很快被水分子取代，DDP被水化后形成親電子的活化形式?；罨腄DP可與核酸分子上的巰基或嘌呤堿基的N7供氮活性中心反應(yīng)，形成鏈內(nèi)或鏈間加合產(chǎn)物，從而造成癌細(xì)胞的DNA損傷，阻止細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[15]。另外，DDP可以改變癌細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、AKT信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路以及Caspase信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路的改變都將最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。

研究證實(shí)，EGCG對(duì)肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤均有抗腫瘤作用[17]。EGCG可以通過(guò)提高凋亡相關(guān)蛋白的活性抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果表明，EGCG有一定的細(xì)胞毒性作用，因此，EGCG的抗腫瘤作用可作進(jìn)一步研究，尤其是與化療藥物的協(xié)同作用。另外，一定濃度的EGCG與DDP共同作用可以增強(qiáng)A549細(xì)胞的損傷，此結(jié)果與Zhang等[19]的研究結(jié)果是一致的，其結(jié)果顯示EGCG可以通過(guò)改變基因的甲基化狀態(tài)來(lái)增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。也有研究表明，EGCG與其他抗癌藥物聯(lián)合使用可以增強(qiáng)MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[10]。因此，EGCG增強(qiáng)DDP抗癌效果的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：北京聯(lián)合大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(Zk70201502)

收稿日期：2015-07-07；

修訂日期：2015-12-21

中圖分類號(hào)：Q946.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0014-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.003