棉花GbCBF2基因的克隆、互補表達載體的構建及遺傳轉化

孔麗穎,李　翔,李才運,劉曉東,李　月

(新疆農業(yè)大學 農學院,農業(yè)生物技術重點實驗室,新疆 烏魯木齊　830052)

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棉花GbCBF2基因的克隆、互補表達載體的構建及遺傳轉化

孔麗穎,李翔,李才運,劉曉東,李月

(新疆農業(yè)大學 農學院,農業(yè)生物技術重點實驗室,新疆 烏魯木齊830052)

摘要：為研究棉花CBF2基因在植物抗逆中的作用,構建了pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T植物互補表達載體,并對擬南芥cbf2突變體進行遺傳轉化。以新海16 cDNA為材料,采用PCR的方法克隆4個棉花CBF2基因,同時克隆擬南芥CBF2基因啟動子AtCBF2P和終止子AtCBF2T,并將這些基因與pBluescript SK載體連接,構建pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T中間過渡載體,用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切中間載體,獲得AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T核心片段,將此片段插入到pCAMBIA1300表達載體中,構建pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T植物互補表達載體。以擬南芥cbf2突變體為材料,采用農桿菌介導的方法進行遺傳轉化,獲得轉棉花CBF2基因群體。獲得轉基因株系后,將為篩選出棉花的CBF2抗凍負調控基因及棉花抗逆分子育種奠定基礎。

關鍵詞：棉花;CBF2基因;互補表達載體;遺傳轉化

棉花是我國重要的經濟作物和紡織品工業(yè)原料,棉花生產對我國經濟和農業(yè)的發(fā)展起到重要的作用。新疆由于獨特的光熱條件,已成為我國最主要的產棉區(qū)。然而由于新疆地域遼闊,區(qū)域氣候變化劇烈,經常因春、秋季氣溫不穩(wěn)定,導致棉花苗期和吐絮期遭遇低溫冷害,嚴重影響棉花產量,使棉花減產20%~60%[1]。為避免低溫冷害,北疆播種早中熟棉花品種,播種期會進行一定時間的推遲,打頂時間也會適當提前,然而產量就會受到限制。因此,若能培育出耐寒棉花品種,延長生長周期,可有效提高新疆棉花的單產和總產,這對于保障我國棉花這一戰(zhàn)略物資的安全和促進新疆經濟發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。

常規(guī)抗逆育種工作效率低,費時費力,因此，轉基因育種已成為最經濟有效的抗逆育種方法。通過超表達抗逆正調控基因培育抗逆新品種是目前世界范圍內普遍采用的思路和方法[2-3]。然而由于共抑制現象,常常導致基因沉默,相關性狀不能長期穩(wěn)定遺傳,嚴重影響了轉基因新品種的推廣應用[4]。前人研究表明,在植物體內有許多調控抗逆性的基因,除目前普遍使用的正調控基因外,還存在一些負調控基因,這些基因突變,功能喪失后,植物的抗逆性明顯增強,如ERA1[5]、ABH1[6]、SAD1[7]、GGB[8]、DST[9]和DREB1C/CBF2[10]。其中擬南芥突變體cbf2(SALK_009689)抗凍性明顯增強,抗旱耐鹽性也有所提高,而且其生長發(fā)育與野生型相比并沒有明顯區(qū)別,相關性狀也可以穩(wěn)定遺傳[10-11]。因此,抗凍負調控基因CBF2是作物分子育種的一個非常理想的候選靶基因。本研究從棉花中克隆了4個與擬南芥CBF2高度同源的CBF基因,構建功能互補表達載體并轉化擬南芥cbf2突變體,以期為篩選出棉花的抗凍負調控基因,進行棉花抗凍育種奠定前期基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料海島棉品種新海16由新疆農業(yè)大學農學院作物遺傳育種室提供,擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型 Col-0以及cbf2突變體SALK_009689購自美國擬南芥種質資源中心。

1.1.2菌株和載體大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α、pEASY-Blunt Cloning Kit購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司,根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、pCAMBIA1300載體、pBluescript SK載體由新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室保存。

1.1.3試劑與工具酶凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、連接酶、高保真聚合酶TransStar KD Plus、TaqDNA聚合酶、DNA 標準分子量均購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司,限制性內切酶購自美國Thermo公司,M-MLV反轉錄試劑盒購自Promega(公司),RNase-Free DNaseⅠ試劑盒購自TaKaRa(公司),SilwetL-77、蔗糖、潮霉素(Hyg)、MS購自Sigma公司,其他試劑均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1材料培養(yǎng)將海島棉新海16種子播種在裝滿蛭石的盆缽中,于(25±2)℃培養(yǎng)間生長,取15 d苗齡的棉花葉片,提取植物總RNA,用于基因克隆分析。

將擬南芥野生型Col-0和cbf2突變體SALK_009689種子均勻點播在1/2 MS培養(yǎng)基中,4 ℃春化處理3 d,于23 ℃培養(yǎng)間生長7 d,移栽在蛭石∶黑土∶珍珠巖(6∶3∶1)的混勻營養(yǎng)土中,擬南芥野生型Col-0于苗期取葉片提取基因組DNA,cbf2突變體SALK_009689于花期用于遺傳轉化。

1.2.2擬南芥基因組DNA、棉花總RNA的提取和cDNA的制備按照全式金公司基因組DNA提取試劑盒的操作說明,提取擬南芥野生型Col-0葉片基因組DNA;采用改良的CTAB法,參照胡根海等[12]的方法提取棉花葉片總RNA;按照TaKaRa(公司)RNase-Free DNaseⅠ試劑盒方法消化基因組DNA污染;按照Promega(公司)M-MLV反轉錄試劑盒操作說明合成單鏈cDNA,于-20 ℃保存。

1.2.3棉花GbCBF基因、擬南芥CBF2啟動子和終止子的克隆從擬南芥TAIR網站(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)下載AtCBF2基因(AT4G25470.1)的序列,作為BlastP查詢序列,在棉花EST數據庫(http://www.leonxie.com)、植物轉錄因子數據庫(PTFD,http://planttfdb.cbi.edu.cn)、美國國家生物技術信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索AP2/ERF亞家族基因與AtCBF2序列保守的EST序列,以這些EST序列在已公布的棉花基因組數據庫(http://www.phytozome.net/)中比對,獲得了4個包含全長ORF(Open reading frame)的基因序列,然后根據基因組中最大開放閱讀框序列設計克隆引物,同時根據擬南芥AtCBF2基因組序列信息,設計克隆AtCBF2啟動子和終止子的正反向引物,并在每條引物上引入不同的酶切位點,用于構建功能互補表達載體。具體引物序列和酶切位點參照表1。

采用常規(guī)PCR方法克隆棉花GbCBF2、擬南芥AtCBF2基因啟動子和終止子DNA片段,以棉花cDNA和擬南芥基因組DNA為模板,以高保真聚合酶TransStar KD Plus(TransGen)進行PCR擴增,高保真TransStar KD Plus(TransGen)擴增反應體系:5×TransStar KD Plus Buffer 10 μL;2 mmol/L dNTP 5 μL;TransStar KD Plus DNA Polymerase 1 μL;模板 1 μL;正反向引物各1 μL,補充水到50 μL。反應條件為94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,35個循環(huán);68 ℃ 10 min。將擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的片段連接至Peasy-Blunt Zero克隆載體上,然后測序驗證。對測序正確的陽性克隆提取質粒,命名為Peasy-Blunt-GbCBF2A-2D、Peasy-Blunt-AtCBF2P、Peasy-Blunt-AtCBF2T。

表1　PCR擴增引物序列

注：下劃線堿基為PCR擴增時引物中引入的酶切位點。

Note:Bases underlined are restriction sites added to primers using in PCR amplification.

1.2.4四個棉花GbCBF2基因互補表達載體的構建AtCBF2P、GbCBF2、AtCBF2T與中間載體pBluescript SK的連接:用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切Peasy-Blunt-AtCBF2P、XhoⅠ和ClaⅠ或XhoⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切Peasy-Blunt-GbCBF2A-2D、ClaⅠ和BamH Ⅰ或EcoR Ⅰ和HamH Ⅰ雙酶切Peasy-Blunt-AtCBF2T質粒,SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pBluescript SK載體,將酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的大小片段,獲得AtCBF2P、GbCBF2A-2D、AtCBF2T片段和pBluescript SK載體片段。為了節(jié)省構建多片段重組互補表達載體的時間,將AtCBF2P、GbCBF2、AtCBF2T3個線性片段和酶切消化的pBluescript SK載體片段分子,按3∶3∶3∶1摩爾比混合,16 ℃連接過夜。并轉化大腸桿菌DH5α,涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落,用M13F和M13R進行菌落PCR鑒定,出現預期條帶的候選陽性克隆,提質粒,用SacⅠ、XhoⅠ、ClaⅠ或EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ四酶切進一步鑒定,最終獲得pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T陽性克隆。

pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體和pCAMBIA1300載體連接:用SacⅠ/BamH Ⅰ酶切pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體和pCAMBIA1300載體,回收目的片段AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2和pCAMBIA1300。將回收的目的片段用T4連接酶4 ℃連接過夜,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜,各單克隆質粒用SacⅠ、XhoⅠ、ClaⅠ或EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切鑒定、最終得到棉花CBF2基因功能互補表達載體pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T。

1.2.5浸花法轉化擬南芥突變體將構建正確的重組質粒pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T熱擊轉化到GV3101農桿菌菌株,28 ℃培養(yǎng)2 d。將陽性克隆接種于含卡那霉素(50 μg/mL)和利福平霉素(50 μg/mL)的2 mL LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)20 h左右,然后按體積1∶100比例接種至50 mL含卡那霉素和利福平霉素的LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)至OD值=1.2~1.6,4 000 r/min離心10 min,用轉化液(蔗糖5%,1/2 MS培養(yǎng)基,0.02% SilwetL-77)重懸沉淀混勻至OD值=0.6~0.8,然后進行擬南芥突變體的轉化。

1.2.6轉基因陽性植株的篩選鑒定將收取的擬南芥轉基因種子消毒滅菌后均勻播種于含40 μg/mL潮霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基上,于4 ℃低溫春化4 d后,轉入20 ℃溫室培養(yǎng)14 d后,挑選植株嫩綠能長出真葉和根的陽性苗進行土壤移栽。

2結果與分析

2.1棉花GbCBF2基因、擬南芥啟動子、終止子的克隆

以擬南芥AtCBF2序列在已公布的棉花基因組數據庫(http://www.phytozome.net/)中比對分析,設計引物,從海島棉中克隆4個具有完整ORF的基因,大小分別為615,633,759,765 bp,分別命名為GbCBF2A、GbCBF2B、GbCBF2C和GbCBF2D。根據擬南芥AtCBF2序列,截取AtCBF2 起始密碼子ATG上游1 179 bp的序列,克隆擬南芥啟動子,命名為AtCBF2P,截取AtCBF2 終止密碼子下游439 bp的序列,克隆擬南芥終止子,命名為AtCBF2T(圖1)。因為構建4個GbCBF2基因互補表達載體的需要,克隆了2種帶有不同酶切位點的AtCBF2的終止子。如圖1所示,克隆出的擬南芥啟動子、終止子和棉花GbCBF2基因的目標條帶大小與實際條帶大小一致。并通過克隆測序驗證。

A.擬南芥CBF2基因啟動子、終止子電泳分析;M.Trans2K DNA Marker;1.AtCBF2P;3和4.AtCBF2T;B.棉花GbCBF2基因PCR產物的電泳分析;M.Trans1K DNA Marker;1.GbCBF2A;2.GbCBF2B;3.GbCBF2C;4.GbCBF2D。

A.Electrophoretic analysis ofArabidopsisCBF2 promoter and terminator;M.Trans2K DNA Marker;1.AtCBF2P;3 and 4.AtCBF2T;B.Electrophoretic analysis of PCR product of cottonGbCBF2 genes;M.Trans1K DNA Marker;1.GbCBF2A;2.GbCBF2B;3.GbCBF2C;4.GbCBF2D.

圖1PCR擴增結果

Fig.1Result of PCR amplification

2.2棉花GbCBF2互補表達載體的構建

在基因表達的過程中,啟動子、終止子將會影響功能基因的表達,為了排除這一因素,構建如圖2-A所示由擬南芥的啟動子AtCBF2P驅動GbCBF2基因,擬南芥終止子AtCBF2T終止表達的pCAM-BIA1300表達載體。

2.2.1AtCBF2P、GbCBF2、AtCBF2T基因與中間載體pBluescript SK的連接AtCBF2P、GbCBF2、AtCBF2T基因和中間載體pBluescript SK片段的獲得:將AtCBF2P、GbCBF2A-2D和AtCBF2T分別用SacⅠ和XhoⅠ、XhoⅠ和ClaⅠ或XhoⅠ和EcoR Ⅰ、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ或ClaⅠ和BamH Ⅰ從克隆載體上進行雙酶切,反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,結果表明如圖2-B所示,通過酶切,獲得預期目的基因片段。

pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體的構建與鑒定:將以上酶切獲得的目的條帶進行回收,用T4連接酶將3個線性片段和pBluescript SK載體16 ℃連接過夜并轉化挑取單克隆,用M13F和M13R引物進行菌落PCR鑒定,產物大小約為2 500 bp的即為候選陽性克隆(圖3-A中箭頭所示),對候選陽性克隆提取質粒,進一步用SacⅠ、XhoⅠ、ClaⅠ或EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進行四酶切出現大小為1 179,600~750,439 bp和約為3 000 bp的4個目的片段的即為連接成功的陽性克隆(圖3-B)。

M.Trans1K DNA Marker;1.Peasy-Blunt-GbCBF2D;2.pBluescript SK;4.Peasy-Blunt-AtCBF2T(EcoRⅠ和BamHⅠ);5.Peasy-Blunt-GbCBF2C;6.Peasy-Blunt-GbCBF2B;7.Peasy-Blunt-AtCBF2P;9.Peasy-Blunt-AtCBF2T(ClaⅠ和BamHⅠ);10.Peasy-Blunt-GbCBF2A。

M.Trans1K DNA Marker;1.Peasy-Blunt-GbCBF2D;2.pBluescript SK;4.Peasy-Blunt-AtCBF2T(EcoRⅠ andBamHⅠ);5.Peasy-Blunt-GbCBF2C;6.Peasy-Blunt-GbCBF2B;7.Peasy-Blunt-AtCBF2P;9.Peasy-Blunt-AtCBF2T(ClaⅠ andBamHⅠ);10.Peasy-Blunt-GbCBF2A.

圖2棉花GbCBF2、擬南芥CBF2啟動子和

終止子、pBluescript SK載體的雙酶切

Fig.2Identification by double enzyme digestion of cottonGbCBF2,ArabidopsisCBF2 promoter,terminator and pBluescript SK

2.2.2AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T和pCAMBIA1300載體的連接用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切連接成功的pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T重組子和pCAMBIA1300載體,回收相應的DNA條帶并連接轉化。提取單克隆質粒進行酶切鑒定。用SacⅠ、XhoⅠ、ClaⅠ或EcoRⅠ和BamHⅠ進行四酶切,出現大小為1 179,1 094,600~750,439 bp和約為7 800 bp的5個目的片段的即為連接成功的陽性克隆(圖4),即棉花 pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補表達載體構建成功。

2.3篩選轉基因陽性幼苗

將pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補表達載體,轉化到GV3101農桿菌菌株,通過浸花法轉化擬南芥cbf2突變體SALK_009689。待種子成熟后,收獲種子,將種子播種于40 μg/mL潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上正常生長7 d。只有轉化成功的擬南芥植株才會有潮霉素抗性,生長出正常的真葉與根。挑選生長嫩葉和長出根的幼苗進行移栽。抗性篩選結果見圖5箭頭所示。

A.菌落PCR分析;B.載體的酶切鑒定;M.Trans1K DNA Marker;1、3、4、6、10、11為陽性克隆。

M.Trans1K DNA Marker;1，4，6，8，10為正

圖5　轉基因植株抗性篩選

3討論

CBF/DREB轉錄因子能特異性與脅迫誘導基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE(C-repeat/dehydration-responsive element)順式作用元件結合,激活抗逆功能基因的表達,最終通過基因產物的作用增強植物的抗逆性[13-14]。擬南芥CBF1/DREB1C、CBF2/DREB1B、CBF3/DREB1A,在植物抗凍反應中扮演中心的調控角色;超表達CBF1和CBF3都能顯著提高植物的抗凍性[15-16]。而CBF2基因雖然與CBF1和CBF3基因高度同源,但在植物抗逆中卻扮演重要的負調控角色。該基因負調控CBF1和CBF3的表達,其突變失活后,CBF1和CBF3基因的表達都同時顯著提高,因此擬南芥的抗凍性顯著增強[17-18]。與CBF1和CBF3過量表達植株不同的是,在cbf2突變體中CBF1和CBF3基因的表達并不是持續(xù)地提高,其表達受到了嚴格調控,在冷脅迫后期兩者的表達量又逐漸下降,從而使CBF1和CBF3基因過量表達在生長發(fā)育上所產生的負效應得到了很好的控制。因此,cbf2突變體最突出的表現是,雖然植株的抗凍性明顯增加,但cbf2突變體在生長發(fā)育上與野生型相比并沒有明顯差異[19-20],因此,抗凍負調控基因CBF2是利用基因組編輯技術進行作物分子育種的一個非常理想的候選靶基因。

棉花與擬南芥同屬于雙子葉植物,進化上的親緣關系較近。棉花中是否也存在CBF2類的抗凍負調控基因,為此,筆者從棉花中克隆了4個CBF2的高度同源基因,構建互補表達載體并轉化擬南芥cbf2突變體。除基因自身的功能外,基因的啟動子和終止子都會對基因的功能表現產生重要影響。因此，為了嚴謹地驗證4個棉花類CBF2基因的功能,筆者構建的互補表達載體采用擬南芥CBF2基因自身的啟動子和終止子,以真實地模擬擬南芥CBF2的時空表達特性以及表達量,以消除不同時空表達以及表達量所帶來的功能表現上的差異。

本試驗構建載體方法采用酶切連接法。首先將AtCBF2P、GbCBF2、AtCBF2T基因從克隆載體上用相應的酶切下,再將目的基因與互補表達載體相連,由于互補表達載體pCAMBIA1300片段長度過大(9 000 bp),將以上3個目的基因片段與其直接相連難度較大。為了提高連接效率,故選取pBluescript SK載體(3 000 bp)為中間過渡載體,同時采用3個目的基因片段與pBluescript SK載體同時混合連接,最后將這3個片段作為一個大片段連接到pCAMBIA1300表達載體上,成功構建了4個棉花GbCBF2基因的互補表達載體,并轉化到擬南芥突變體中,獲得了轉基因植株。為篩選出棉花的CBF2抗凍負調控基因,應用于棉花抗逆分子育種奠定基礎。

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Cloning,Complementary Expression Vector Construction and Transformation ofGbCBF2 Gene from Cotton

KONG Liying,LI Xiang,LI Caiyun,LIU Xiaodong,LI Yue

(College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Key Laboratory of Agricultural Biological Technology,Urumqi830052,China)

Abstract：In order to study the function of cotton CBF2 gene in plant resistance,the complementary expression vector pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T was constructed,and transformed to Arabidopsis cbf2 mutant by genetic engineering.The four CBF2 genes were cloned from cDNA of the cotton Xinhai 16 and Arabidopsis CBF2 gene promoter AtCBF2P and termination AtCBF2T were also cloned by PCR method.Firstly,these genes were connected with pBluescript SK,and obtained the intermediate transition vector pBluescript SK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T,then the AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T fragment was obtained by cutting the intermediate transition vector with SacⅠ and BamHⅠ,after the fragment inserted into pCAMBIA1300,the complementary expression vector pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T was constructed.The cotton CBF2 gene was transformated into Arabidopsis cbf2 mutant by Agrobacterium mediated method and regenerative seedlings were obtained.These results will lay the foundation for screening cotton negative regulator CBF2 gene and stress-resistance molecular breeding.

Key words:Cotton;CBF2 gene;Complementary expression vector;Transformation

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.007

中圖分類號：Q78;S562.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0040-06

通訊作者：李月(1984-),女,河南許昌人,講師,博士,主要從事棉花分子生物學研究。

作者簡介：孔麗穎(1993-),女,新疆呼圖壁人,主要從事生物技術研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(31470289);新疆農業(yè)大學校前期課題(XJAU201311);新疆農業(yè)大學大學生創(chuàng)新項目

收稿日期：2015-12-01