GhWRKY44基因在煙草中遺傳轉化及功能分析

趙曾強,韓澤剛,李會會,李瀟玲,張　析,張　薇

(1.石河子大學 農學院,新疆 石河子　832000;2.新疆農墾科學院 生物技術研究所,新疆 石河子　832000)

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GhWRKY44基因在煙草中遺傳轉化及功能分析

趙曾強1,2,韓澤剛1,李會會1,李瀟玲1,張析1,張薇1

(1.石河子大學 農學院,新疆 石河子832000;2.新疆農墾科學院 生物技術研究所,新疆 石河子832000)

摘要：為了進一步驗證GhWRKY44(登錄號:KJ801807)基因在煙草異位表達后的功能,構建了CaMV35S啟動子調控、Nos為終止子的棉花抗枯萎病相關基因(GhWRKY44)的過表達載體;電擊法將其導入農桿菌GV3101,菌液PCR篩選鑒定陽性菌株,采用農桿菌介導法轉化煙草;T0轉化植株經卡那霉素篩選、PCR檢測后,隨機從轉基因T0中選取5株進行RT-PCR檢測,均為陽性株,說明GhWRKY44基因不僅整合到煙草基因組中而且還能正常轉錄。對過表達GhWRKY44基因的轉基因煙草T1株系進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。結果表明,在正常生長情況下,PR5和NPR1的表達量在轉GhWRKY44株系中明顯增加,枯萎病菌侵染后,在轉GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表達量迅速增加,明顯高于野生型株系,而PR5的表達量則低于野生型株系,說明該目的基因能在煙草中異位表達并能激活病程相關蛋白基因的表達,但其功能仍需進一步研究。

關鍵詞：煙草;GhWRKY44;遺傳轉化;病程相關蛋白基因

轉錄因子(Transcription factor,TF)是一類能與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結合,從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子,植物種屬中的轉錄因子基因通常以家族的形式存在[1]。在植物的抗病性中,與防衛(wèi)反應相關的轉錄因子有多種,如bZIP型轉錄因子中的TGA家族、鋅指蛋白中的WRKY家族、MYB轉錄因子、AP2/EREBP型轉錄因子、NAC轉錄因子等。WRKY轉錄因子家族是近年所發(fā)現的一類存在于高等植物中的鋅指蛋白,已從多種植物中分離出來,擬南芥中已發(fā)現74個WRKY成員,水稻中發(fā)現100多個,由于WRKY蛋白可以和許多植物防衛(wèi)反應基因啟動子中的高度保守的功能元件(W盒(T)TGAC(C/T))結合,其中大多數參與植物對病原體的防衛(wèi)反應,因此備受關注[2-6]。

在擬南芥中,Li等[7-8]以過表達AtWRKY70株系和被敲除AtWRKY70基因的突變體為材料,利用病原菌(白菜黑斑病毒和煙草白粉病毒)侵染植物材料。結果表明,過表達的AtWRKY70的轉化植株提高了SA介導的煙草白粉病毒的抗性,同時降低了JA介導的白菜黑斑病毒抗性;與此相反,缺失AtWRKY70 基因的突變株降低了植物對SA介導的煙草白粉病毒抗性。因此,AtWRKY70可能是平衡植物水楊酸、茉莉酸防衛(wèi)信號途徑的一個重要因子;Yu等[9]對棉花GhWRKY15進行表達特異性分析表明,分別用立枯絲核菌和枯萎病菌處理棉苗后,GhWRKY15表達量呈現先增加后降低趨勢,但枯萎病菌處理后在3 d表達量最高,立枯絲核菌處理后在5 d表達量最高,且過表達GhWRKY15轉基因煙草植株可以增強對真菌的抗性。Shi等[10]研究發(fā)現,培養(yǎng)7 d的棉花幼苗分別用外源激素SA和MeJA處理,其表達量分別在6,12 h達到最高,過表達GhWRKY39-1轉基因煙草植株可以增強對細菌和真菌的抗性。Zhang等[11]克隆了GbWRKY1,研究表明,作為病原菌誘導型轉錄因子GbWRKY1在植物防御反應中起著重要的作用。Guo等[12]克隆出長度為1 705 bp的GhWRKY3,序列編碼氨基酸507個,有2個典型的WRKY結構域和2個鋅指結構,亞細胞定位分析表明,GhWRKY3定位于細胞核,半定量RT-PCR分析表明,GhWRKY3受多種植物激素的誘導,包括水楊酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(氣)和乙烯(ET)。

目前,在WRKY基因的研究中,有關棉花抗病相關的轉錄因子基因報道不多,與抗枯萎病相關的轉錄因子基因報道甚少。本研究構建GhWRKY44基因的植物過表達載體,利用農桿菌介導法轉化煙草,初步研究基因的功能,對培育棉花抗枯萎病新品種具有一定的科研價值。

1材料和方法

1.1試驗材料

遺傳轉化所用煙草為SR1(Nicotianatabacumpv.,SR1),根癌農桿菌為GV3101,植物基礎表達載體pPZP35S,以上材料均由作物遺傳育種實驗室提供。

1.2煙草遺傳轉化培養(yǎng)基

無菌苗培養(yǎng)基:8 g/L瓊脂粉+15 g/L蔗糖+1/2MS(pH值5.8~6.0)。共培養(yǎng)基:8 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖+MS(pH值5.8~6.0)。選擇培養(yǎng)基:MS+2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA(吲哚-3-乙酸)+500 mg/L Cef(頭孢霉素)+80 mg/L Kan(卡那霉素)+30 g/L蔗糖+2.5 g/L Phytagel(pH值5.8~6.0)。生根培養(yǎng)基:1/2MS+0.3 mg/L IAA+400 mg/L Cef+50 mg/L Kan+15 g/L蔗糖+2.5 g/L Phytagel。T0煙草種子篩選培養(yǎng)基：1/2MS+50 mg/L Kan+15 g/L蔗糖+2.5 g/L Phytagel。以上培養(yǎng)基pH值5.8~6.0。

1.3試驗方法

1.3.1農桿菌介導的煙草遺傳轉化根據GhWRKY44基因開放閱讀框序列設計5′端分別含有XbaⅠ與SacⅠ酶切位點引物F1、R1(表1)。將已構建好的植物基礎表達載體pPZP35S-GhWRKY44,通過電擊法轉入根癌農桿菌GV3101,菌液PCR篩選鑒定陽性菌株。煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片切成約1 cm×1 cm的葉盤,浸于農桿菌菌株GV3101(含有pPZP35S-GhWRKY44重組表達載體)菌液中15 min左右;取出葉盤用無菌濾紙吸干殘余的菌液,將葉盤轉入上面鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基上;28 ℃暗培養(yǎng)2~3 d后再將葉盤轉入到選擇培養(yǎng)基中;繼代2~3次,待抗性芽長至約2 cm時,用剪刀將其剪下插入生根培養(yǎng)基中誘導生根;待抗性苗長至6~8 cm時馴化移栽。

1.3.2轉基因陽性植株的PCR及RT-PCR鑒定對T0轉基因植株進行PCR鑒定,依據CaMV35S啟動子序列設計上游引F2,下游引物R1。采用CTAB法[13]提取轉基因煙草與野生型煙草基因組DNA,以基因組DNA為模板進行PCR擴增,轉GhWRKY44基因植株的擴增片段預計1 700 bp左右,PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨機選取初步為陽性的T0轉基因植株利用CTAB法[14]提取轉基因煙草和野生型煙草葉片的總RNA,反轉錄獲得cDNA,以cDNA為模板進行RT-PCR擴增,擴增片段預計約1 200 bp,引物為F1和R1,PCR擴增體系:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將獲得的T0煙草種子表面消毒后平鋪于含有50 mg/L卡那霉素的固體1/2MS培養(yǎng)基上進行篩選,轉基因株正常生長,葉片為綠色,非轉基因株發(fā)芽后即停止生長，葉片白色,將篩選出來的陽性植株移栽到培養(yǎng)土中,保濕培養(yǎng)3~5 d后常規(guī)管理條件下培養(yǎng)。

CTAB法[13]提取T1轉基因煙草和野生型煙草葉片總RNA,反轉錄獲得cDNA,以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。引物與PCR擴增體系同T0RT-PCR擴增。

1.3.3T1轉基因煙草和野生型煙草枯萎病菌處理將保存于甘油中的枯萎病菌接種到已滅菌的查氏培養(yǎng)液中,28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d,配制成濃度為7×106/mL的孢子懸浮液。待煙草幼苗長至5片葉子時,選取生長一致的煙草浸泡于孢子懸浮液中45 min后轉入霍格蘭營養(yǎng)液中,在侵染后的0,1,3,6,12,24 h分別采集野生型株系和轉基因型株系的根部組織,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.4T1轉基因煙草和野生型煙草中抗性基因的表達特性分析CTAB法[14]提取枯萎病菌處理下轉基因煙草和野生型煙草根部總RNA,反轉錄獲得cDNA,利用qRT-PCR技術,以NtActin為內參基因分析NtPR1a(X12485)、NtPR2(M60460)、NtPR5(AF154636)、NtNPR1(DQ837218)在正常生長情況下和病原菌處理下的表達模式。內參引物(F3、R2),NtPR1a(F4、R3)、NtPR2(F5、R4)、NtPR5(F6、R5)、NtNPR1(F7、R6),以上引物見表1。

表1　引物序列

qRT-PCR反應體系及程序參見TaKaRa公司SYBR?PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)說明書,試驗設3個重復,采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

2結果與分析

2.1植物表達載體的農桿菌轉化及鑒定

采用電擊法將重組表達載體pPZP35S-GhWRKY44導入農桿菌GV3101,對轉入重組表達載體的菌液進行PCR篩選與驗證,pPZP35S-GhWRKY44可擴增出約1 200 bp的目的條帶GV3101(圖1)。

M.DL2000;1.陰性對照;2.GhWRKY44基因農桿菌菌液PCR產物。

2.2煙草遺傳轉化與陽性植株檢測

煙草遺傳轉化大致經過5個過程:煙草葉盤-愈傷誘導-抗性芽分化-誘導生根-再生植株移栽(圖2)。轉GhWRKY44的煙草經卡那霉素篩選后共得抗性苗22株,訓化、移栽后成活14株;提取轉GhWRKY44煙草抗性苗的基因組DNA,以野生型煙草為陰性對照進行PCR鑒定。檢測結果表明,轉GhWRKY44基因的煙草中有10株擴增出預期大小的目的條帶約1 700 bp,初步證明GhWRKY44基因已整合到煙草基因組中(圖3)。 從初步篩選得到的陽性株中隨機選出5株提取RNA,反轉錄獲得cDNA后,利用RT-PCR進一步檢測,5株轉GhWRKY44基因的煙草均擴增出預期大小目的條帶約1 200 bp(圖4),說明GhWRKY44基因不僅整合到煙草基因組中而且還能正常轉錄。

A.共培養(yǎng)(煙草葉盤);B、C.選擇培養(yǎng)(B.愈傷誘導,

M.DL2000;1.質粒對照;2.野生型對照;

M.DL2000;6.野生型對照；L1、L3、

2.3抗病相關基因的表達分析

轉基因煙草T1目的基因的表達檢測:選取L6株系的T0種子進行卡那霉素篩選,獲得T1抗性植株,提取T1轉GhWRKY44煙草葉片的總RNA反轉錄cDNA進行RT-PCR分析(圖5),轉GhWRKY44株系獲得15株陽性株。

轉GhWRKY44煙草中抗病相關基因的表達:選取T1轉GhWRKY44的轉基因株系OE1,以野生型為對照,進行qRT-PCR分析,由圖6可以看出,在正常生長情況下(枯萎菌未處理),過量表達GhWRKY44可以增加PR5和NPR1的表達量,其中NPR1的表達量在轉基因株系中增加約8倍。由圖7可以看出，枯萎病菌侵染野生型和轉基因株系后，轉基因株系中PR1a表達量均高于野生型,處理后24 h表達量達到最高,轉基因株系5個處理時間點的平均相對表達量約為野生型的60倍;PR2(圖8)表達量在病原菌處理后呈逐漸增加的趨勢,處理后12~24 h,其表達量達到最大,約為處理前的6倍;而PR5(圖9)的表達量在處理后均低于處理前,且在多個處理時間點轉基因株系明顯低于野生型株系。NPR1(圖10)的表達量隨病原菌處理時間的推移,呈先降低再增加再降低的變化趨勢,處理后6 h表達量最高。

M.DL2000;1.野生型對照；L1~L15.轉基因植株RT-PCR擴增結果。

WT.野生型株系;OE1.轉GhWRKY44株系。圖7-10同。

圖7　枯萎病菌處理后PR1a在

圖8　枯萎病菌處理后PR2在野生型株系與

圖9　枯萎病菌處理后PR5在野生型株系與

圖10　枯萎病菌處理后NPR1在野生型株系

3討論

為了探究GhWRKY44在枯萎菌抗性反應中的作用,本研究通過農桿菌介導法獲得轉GhWRKY44的煙草,利用qRT-PCR技術進行抗病相關基因表達模式分析。結果表明,在正常生長情況下PR5和NPR1的表達量在轉GhWRKY44株系中明顯增加;在模式植物擬南芥中對WRKY轉錄因子研究表明,該類基因以正調控或負調控的作用參與復雜的抗病信號途徑[15];在過表達AtWRKY41的擬南芥株系中發(fā)現,植株對假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性增加,但對軟腐病菌(Erwiniacarotovora)的抵抗力下降[16],AtWRKY33可正調控番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抗性[17]。研究表明,WRKY類轉錄因子可以特異性地識別和結合W-box,而PR基因的啟動子區(qū)域含有保守的W-box順式作用元件,能被WRKY轉錄因子誘導表達[9,18-19],Shi等[10]研究發(fā)現,在正常生長條件下,過表達GhWRKY39-1煙草株系中,NPR1、PR1c、PR2、PR4的表達量均低于野生型株系。正常生長條件下,過表達GhWRKY40煙草株系中,PR1a、PR4在野生型株系和轉基因型株系中表達量很低,PR2在轉基因型株系中表達量高于野生型株系[20];對于不同株系的野生型煙草PR1a和PR2的表達量在一個很低的水平,而對于轉SlWRKY2的煙草中的表達量明顯高于野生型[21]。上述研究結果與本研究結果并不完全一致,也進一步說明不同的WRKY轉錄因子基因對不同PR基因調控作用不同。

為了進一步探究GhWRKY44的功能,利用qRT-PCR分析枯萎病菌處理后野生型株系和轉GhWRKY44株系中抗病相關基因的表達模式。結果發(fā)現,枯萎病菌侵染后,過表達GhWRKY44的轉基因煙草中PR1a、PR2和NPR1的表達量明顯高于野生型株系,而PR5的表達量在轉基因型株系中,多個處理時間點均低于野生型株系。前人研究表明,對轉GhWRKY15或GhWRKY39或GhWRKY40基因的煙草分別用TMV病毒或煙草炭疽病菌或青枯病菌或棉立枯病菌處理后,轉基因植株均能提高對病原菌的抗性,通過qRT-PCR分析表明,在轉GhWRKY15 株系中,TMV病毒處理后,過表達的轉基因煙草中PR1、PR2(β-1,3-葡聚糖)、PR4和PR5(逆滲透蛋白)與野生型煙草相比表達量升高,煙草炭疽病菌處理后,過表達的轉基因煙草中PR1、PR2(β-1,3-葡聚糖)和PR4與野生型煙草相比表達量升高,但PR5(逆滲透蛋白)的表達量低于野生型;轉GhWRKY39煙草中,當青枯病菌處理后PR1a、PR1c、PR2的表達量高于野生型,PR4表達量低于野生型,NPR1變化不明顯。當棉立枯病菌處理后,PR1a、PR1c、PR2和PR4表達量高于野生型,NPR1表達量低于野生型;青枯病菌處理轉GhWRKY40煙草株系后,PR1a、PR2和PR4表達量低于野生型[9-10,19]。結合本研究結果表明,WRKY轉錄因子通過調控PR基因參與了植物對病原菌的抵抗,但其作用機制有待進一步研究。

參考文獻：

[1]丁長歡,孫昭華,李小娟,等.小麥轉錄因子基因TaWRKY46的克隆與表達分析[J].華北農學報,2012,27(5):65-71.

[2]Eulgem T,Rushton P J,Robatzek S,et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].Trends in Plant Science,2000,5(5):199-206.

[3]Wu K L,Guo Z J,Wang H H,et al.The WRKY family of transcription factors in rice andArabidopsisand their origins[J].DNA Research,2005,12(1):9-26.

[4]Rushton P J,Torres J T,Parniske M,et al.Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsleyPR1 genes[J].The EMBO Journal,1996,15(20):5690-5700.

[5]李光雷.棉花GhWRKY11基因的克隆及功能驗證[D].北京:中國農業(yè)科學院,2012.

[6]李富欣,許芳芳，李素敏,等.煙草轉錄因子基因NtGRAS-R1的克隆與功能分析[J].河南農業(yè)科學,2015,44(5):58-62.

[7]Li J,Brader G,Palva E T.The WRKY70 transcription factor:A node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense[J].Plant Cell,2004,16(2):319-331.

[8]Li Jing,Brader G,Kariola T,et al.WRKY70 modulates the selection of signaling pathways in plant defense[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,2006,46(3):477-491.

[9]Yu Feifei,Huaxia Yifeng,Lu Wenjing,et al.GhWRKY15,a member of the WRKY transcription factor family identified from cotton (GossypiumhirsutumL.),is involved in disease resistance and plant development[J].BMC Plant Biology,2012,12(1):144.

[10]Shi Weina,Hao Lili,Li Jing,et al.The gossypium hirsutum WRKY geneGhWRKY39-1 promotes pathogen infection defense responses and mediates salt stress tolerance in transgenicNicotianabenthamiana[J].Plant Cell Reports,2014,33(3):483-498.

[11]Zhang Shuling,Wang Xingfen,Zhang Yan,et al.GbWRKY1,a novel cotton (Gossypiumbarbadense)WRKYgene isolated from a bacteriophage full-length cDNA library,is induced by infection withVerticilliumdahliae[J].Indian Journal of Biochemistry & Biophysics,2012,49(6):405-413.

[12]Guo Ruoyu,Yu Feifei,Gao Zheng,et al.GhWRKY3,a novel cotton (GossypiumhirsutumL.)WRKYgene,is involved in diverse stress responses[J].Molecular Biology Reports,2011,38(1):49-58.

[13]陳昆松,李方,徐昌杰,等.改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J].遺傳,2004,26(4):529-531.

[14]胡根海,喻樹迅.利用改良的CTAB法提取棉花葉片總RNA[J].棉花學報,2007,19(1):69-70.

[15]Eulgem T,Somssich I E.Networks of WRKY transcription factors in defense signaling[J].Current Opinion in Plant Biology,2007,10(4):366-371.

[16]Pandey S P,Somssich I E.The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J].Plant Physiology,2009,150(4):1648-1655.

[17]Zheng Zuyu,Qamar S A,Chen Zhixiang,etal.ArabidopsisWRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,2006,48(4):592-605.

[18]Agarwal P,Reddy M P,Structure C W,et al.Role in stress tolerance and development of plants[J].Molecular Biology Reports,2011,38(6):3883-3896.

[19]伍林清,杜才富,張敏琴,等.WRKY轉錄因子的結構及其在植物抗逆境脅迫中的功能[J].分子植物育種,2013(4):634-638.

[20]Wang Xiuling,Yan Yan,Li Yuzhen,et al.GhWRKY40,a multiple stress-responsive cottonWRKYgene,plays an important role in the wounding response and enhances susceptibility to ralstonia solanacearum infection in transgenicNicotianabenthamiana[J].PLoS One,2014,9(4):e93577.

[21]金慧.水楊酸誘導番茄WRKY轉錄因子的克隆及功能分析[D].大連:大連理工大學,2011.

Genetic Transformation and Functional Analysis ofGhWRKY44 Gene in Tobacco

ZHAO Zengqiang1,2,HAN Zegang1,LI Huihui1,LI Xiaoling1,ZHANG Xi1,ZHANG Wei1

(1.Agricultural College of Shihezi University,Shihezi832000,China;2.Biotechnology Research Institue,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi832000,China)

Abstract：By CaMV35S promoter and Nos as the terminator,the overexpression vector of GhWRKY44 gene and verified the function of GhWRKY44 (Accession number:KJ801807) gene in tobacco ectopic expression were constucted.Overexpression vector was introduced into Agrobacterium GV3101 by electroporation method,positive bacteria strain was identified by screening PCR and positive colony was transferred into tobacco by Agrobacterium-mediated.After T0of transformed plants are detected by kanamycin,PCR detection,5 strains were detected by RT-PCR technique randomly selected from T0of transformed plants and 5 strains were positive.The results showed that not only GhWRKY44 gene was transferred into the tobacco genome but also the normal transcripted.T1lines of transgenic tobacco were analysed by using Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) technique.The result showed that the wild type and transgenic GhWRKY44 tobacco were not inoculated with Fusarium oxysporum,the expression of PR5 and NPR1 expression obviously increased in transgenic GhWRKY44 plant.Wild type and transgenic plant after were infected by Fusarium oxysporum,the expression of PR1a,PR2 and NPR1 significantly increased in transgenic lines,but the expression of PR5 was higher in wild type than transgenic lines.The gene could be expressed in the tobacco and could activate parts of PRs′expression.But the function of GhWRKY44 still needs further exploration.

Key words:Tobacco;GhWRKY44;Genetic transformation;Pathogenesis-related gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.019

中圖分類號：S572.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0117-06

通訊作者：張薇(1969-),女,江蘇鎮(zhèn)江人,教授,博士,主要從事棉花分子育種研究。

作者簡介：趙曾強(1985-),男,甘肅靜寧人,助理研究員,碩士,主要從事棉花分子育種研究。

基金項目：國家自然基金項目(31260358);農業(yè)部轉基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08005-005)

收稿日期：2015-11-09