快速檢測聯苯菊酯的膠體金層析試紙條研制

朱 海，許穩(wěn)健，楊星星，付 輝，李細清，李遠兵，嚴義勇，畢思遠，汪鳳林*

(1.深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳 518101；2.深圳市博英菲生物科技有限公司，廣東深圳 518102)

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快速檢測聯苯菊酯的膠體金層析試紙條研制

朱 海1，許穩(wěn)健1，楊星星1，付 輝1，李細清1，李遠兵1，嚴義勇1，畢思遠2，汪鳳林1*

(1.深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳 518101；2.深圳市博英菲生物科技有限公司，廣東深圳 518102)

摘要[目的]采用免疫膠體金技術，建立一種快速檢測聯苯菊酯的試紙條方法。[方法]利用有機合成方法制備了聯苯菊酯半抗原，并與載體蛋白偶聯得到免疫抗原，利用人工免疫的方法獲得其單克隆抗體，通過酶聯免疫法對制備的單克隆抗體的性能進行了驗證。聯苯菊酯膠體金層析試紙條是利用單克隆抗體標記膠體金，并將聯苯菊酯抗原與羊抗鼠IgG分別噴制到硝酸纖維膜上，與樣品墊、吸水墊組裝在PVC襯板上制備而成。[結果] 聯苯菊酯膠體金層析試紙條檢測限為500 ～800 μg/kg，具有速度快、簡單等優(yōu)點。此外，該試紙條與大部分的擬除蟲菊酯沒有明顯的交叉反應，利用該試紙條可實現對莧菜中聯苯菊酯添加試驗的準確判定。[結論] 膠體金試紙條方法具有前處理簡單、檢測速度快、可以肉眼判斷結果等優(yōu)點，該試紙條有望實現對果蔬中聯苯菊酯殘留的快速篩查。

關鍵詞聯苯菊酯；單克隆抗體；膠體金；快速檢測；免疫層析

聯苯菊酯(Bifenthrin，BF)是一種人工合成的擬除蟲菊酯類農藥，具有殺蟲譜廣，擊倒作用快，持效期長，強大的胃毒和觸殺作用等特點[1-2]。聯苯菊酯已被廣泛用于棉花、茶樹、果樹、蔬菜等農業(yè)害蟲及白蟻、螨蟲等衛(wèi)生害蟲的防治[1]。聯苯菊酯化學性質穩(wěn)定，進入環(huán)境后不易被分解，其廣泛使用容易導致較大殘留。雖然聯苯菊酯在人體內代謝快，不具有積累的危險，但研究表明，它具有神經毒害作用，通過影響動物的神經系統(tǒng)和離子通道活性，干擾神經系統(tǒng)的正常功能[3-5]。因而，長期低劑量飲食含有聯苯菊酯殘留的初級農產品會對人類健康造成嚴重危害。世界衛(wèi)生組織已將聯苯菊酯歸類為中等毒性/中度危害的類別。世界上多個國家包括中國、美國、加拿大等先后對農產品中聯苯菊酯殘留做了限量規(guī)定，其中，歐盟規(guī)定食品中聯苯菊酯限量為5.0 mg/kg，而我國規(guī)定了果蔬中聯苯菊酯的殘留限量為5.0～10.0 mg/kg。聯苯菊酯殘留是我國農產品順利出口的瓶頸，因而，發(fā)展快速檢測聯苯菊酯殘留的方法對保證食品安全，確保我國農產品順利出口具有重要意義。

目前對聯苯菊酯的殘留分析主要采用氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用-負化學離子源法、高效液相色譜法、高效薄層色譜法等[6-11]。儀器檢測方法具有結果可靠準確、檢測限低等優(yōu)點，然而，儀器檢測的方法，樣品前處理繁瑣、時間長，對于一些脂溶性含量較高的樣品，提取之后，為了盡量減少其他雜質的干擾，一般需要經過固相萃取柱凈化。王麗婷等利用超高效液相色譜及氣相色譜-質譜聯用測定茶葉中的聯苯菊酯殘留時，提取液先后經過了2種不同的氨基固相萃取柱的凈化[10]。另外，儀器檢測的方法需要經過專業(yè)培訓、有豐富經驗的人員操作，儀器昂貴龐大，檢測費用高，不適合批量樣品的快速檢測與現場檢測。與儀器檢測相比，酶聯免疫分析方法是近年來發(fā)展起來的一種快速定量檢測方法，它具有檢測成本低，可同時實現對多個樣品檢測的優(yōu)點。李波等利用間接競爭酶聯免疫吸附的方法建立了定量測定方法用于快速測定[9]。然而，酶聯免疫方法依然需要有一定經驗的專業(yè)人員操作，試驗結果受外界因素(溫度、離子強度等)及樣品基質影響較大。與酶聯免疫吸附的方法相比，膠體金免疫層析方法是一種更為簡便、快速的檢測方法[12]。膠體金試紙條方法具有前處理簡單、檢測速度快、可以肉眼判斷結果等優(yōu)點。筆者利用膠體金層析的方法，通過抗原抗體的競爭反應，研制了一種快速檢測果蔬中聯苯菊酯殘留的方法。

1材料與方法

1.1材料主要儀器：IKA RV8 旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA；加熱攪拌器，河南愛博特科技發(fā)展公司；LC-MSQDESI液質聯用儀，Applied Biosystems。主要試劑：功夫酸、聯苯硝基醇、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)等，安耐吉公司；牛血清蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司；吡啶、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯化亞砜(SOCl2)等有機試劑，購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2聯苯菊酯半抗原及抗原的合成半抗原的合成路線如圖1所示。稱取1.2 g功夫酸(反應物1)，加入8 mL SOCl280 ℃回流3.0 h，反應結束后將溶劑旋轉蒸干，得到中間產物1。在冰浴下，將溶有中間產物1的二氯甲烷溶液緩慢滴加至20 mL含有1.0 g反應物2(聯苯硝基化合物)的氯仿-吡啶(20∶1，V/V)混合溶液中，室溫反應4 h，將溶劑蒸干，以正己烷-乙酸乙酯(6∶1，V/V)為展開劑，過硅膠柱純化，得到中間產物2。

稱取1.2 g中間產物2，溶于無水乙醇中，加入0.5 g 氯化亞錫，75 ℃回流1.5 h后，將蒸干溶劑用稀NaOH溶液將體系調成微堿性后用乙酸乙酯萃取，之后將有機相蒸干，以正己烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)為展開劑，通過硅膠柱過柱純化，得到中間產物3。

將上述純化好的中間產物3用無水吡啶溶解后，加入1.0 g丁二酸酐，室溫攪拌4.0 h，溶劑蒸干，萃取、過柱純化后得到聯苯菊酯的半抗原。

稱取20 mg聯苯菊酯半抗原用2.5 mL DMF溶解加入到溶有100 mg BSA的5 mL碳酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 9.0)，之后加入50 mg EDC，攪拌過夜后，將反應液在0.01 mol/L PBS(pH 7.4)中4 ℃透析24 h，去除未偶聯的小分子化合物，得到聯苯菊酯人工抗原，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3單克隆抗體的制備及酶聯免疫(ELISA)表征利用人工抗原免疫方法，免疫6～8周的健康雌性BALB/c小鼠[13]。簡單介紹如下：首次免疫時，將50 μg人工抗原用弗氏完全佐劑乳化，第2次、3次及第4次免疫時用不完全佐劑乳化。每次間隔為2～3周。最后一次免疫3 d后，在無菌的條件下取出小鼠脾細胞，將其與骨髓瘤細胞SP2/0以5∶1的數量比用聚乙二醇介導方法融合。將融合的細胞培養(yǎng)后利用有限稀釋法通過間接競爭ELISA 法選擇單克隆抗體細胞株，并利用獲得的細胞誘導小鼠產生腹水，通過飽和硫酸銨沉淀法純化制得抗聯苯菊酯的單克隆抗體。將純化的單克隆抗體包被在酶聯免疫底板上，利用酶聯免疫的方法測定單克隆抗體的性能。

1.4膠體金的制備膠體金是利用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備而成[14]。具體條件如下：在冷凝回流裝置中的圓底燒瓶中加入100 mL超純水和1 mL 1%的氯金酸溶液，加熱至沸騰后加入1 mL 1%濃度的檸檬酸三鈉溶液，煮沸15 min后，室溫冷卻即可。

1.5膠體金標記抗體分別向4個離心管里加入0.9 mL上述膠體金溶液，然后，分別加入0.1 mL pH為7.5、8.0、8.4與9.0的Tris緩沖溶液(1 mol/L)，混勻后，加入5 μL 0.1 mg/mL聯苯菊酯單克隆抗體。振蕩均勻后，靜置10 min，觀察膠體金是否團聚，選擇標記抗體的最佳pH。在最佳pH下，另向4個含有1 mL膠體金緩沖溶液的離心管中分別加入3、6、9與12 μL聯苯菊酯單克隆抗體，考察檢測限處的最佳抗體標記量。然后，進行放大標記。取50 mL膠體金，在合適的pH緩沖溶液里，加入合適體積的聯苯菊酯單克隆抗體，混勻后，靜置30 min，然后加入1%BSA溶液，封閉4.0 h，離心，復溶后得到膠體金標記聯苯菊酯單克隆抗體，將其分裝至反應杯里，凍干干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6聯苯菊酯膠體金試紙條的制備將聯苯菊酯抗原用0.01 mol/L PBS稀釋成1.5 mg/mL。將羊抗鼠IgG用0.01 mol/L PBS稀釋成1 mg/mL。用Biodot噴膜機將二者以1 μL/cm的速度噴于硝酸纖維膜上，分別形成檢測線(T)和控制線(C)，將噴制好的硝酸纖維膜置37 ℃烤箱中干燥16 h。然后，分別將干燥好的硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊依次粘貼在PVC襯板上，然后將其切割成4 mm等寬的試紙條備用。

1.7試紙條檢測限、交叉反應及實際樣品的加標試驗試紙條檢測限測試過程大致如下：首先用0.1 mol/L Tris(pH 9.0)緩沖液配制0、500、800、1 000 μg/kg標準品聯苯菊酯溶液。取3批試紙條進行測試，每個濃度重復測定5次，以驗證該試紙條的檢測限。往反應杯中加入200 μL不同溶度的標準品溶液，混勻，室溫孵育6 min后，插入試紙條，繼續(xù)孵育3 min，將試紙條移出微孔，除去下端樣品墊，根據T線、C線顏色強度差異判斷試驗結果。

對于交叉試驗，分別考察常見類似農藥順-氯菊酯、胺菊酯、反-氯菊酯、氟氯氰菊酯、醚菊酯、溴氰菊酯、S-氰戊菊酯、氰戊菊酯，配制5 mg/kg上述相關溶液，加入反應杯，按照檢測限測試相關步驟，考察試紙條與上述8種不同的農藥的交叉反應情況，每種農藥重復測定5次，判斷試紙條的特異性。

對于實際樣品的標準品加標試驗，以莧菜為例進行測試。首先，稱取2份2.0 g新鮮莧菜，用食物攪拌器粉碎，分別加入100 μL 0 mg/kg聯苯菊酯標準溶液或8 mg/kg聯苯菊酯標準溶液，混勻，加入9.9 mL 0.1 mol/L Tris(pH 9.0)與10%甲醇溶液，高速勻質2 min提取，靜置5 min后，取200 μL上清至反應杯，混勻，按上述檢測限試驗進行測定與判斷，對照試驗與加標試驗分別重復20次。

2結果與分析

2.1半抗原及抗原的合成聯苯菊酯的合成路線如圖1所示，反應物1與氯化亞砜反應得到其酰氯中間產物1，通過與聯苯醇硝基化合物(反應物2)反應獲得淡黃色結晶化合物，中間產物2，將其硝基還原后獲得氨基化合物中間產物3，然后通過與丁二酸酐反應獲得聯苯菊酯半抗原。圖2為聯苯菊酯半抗原的質譜圖，質荷比522處的母離子峰可判斷所制備的產物為聯苯菊酯的衍生物(半抗原)。半抗原與載體蛋白BSA的偶聯是利用碳二亞胺法[15-16]。

2.2聯苯菊酯抗體的ELISA驗證為了驗證純化后抗體與聯苯菊酯結合的能力，利用酶聯免疫的方法進行了驗證。圖3是獲得的聯苯菊酯ELISA標準曲線圖，從圖3中可以得出，聯苯菊酯抗體對聯苯菊酯從10～810 μg/kg具有良好的線性范圍。試驗結果表明，通過該方法制備的聯苯菊酯單克隆抗體對聯苯菊酯具有高靈敏性，因而，利用該單克隆抗體制備的快速檢測試紙條，有望實現對聯苯菊酯的快速高靈敏檢測。

2.3膠體金標記聯苯菊酯單克隆抗體膠體金是利用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備而成[14，17]。此方法制備的膠體金為酒紅色溶液，粒徑約為40 nm，最大吸收峰在526 nm處。對于標記的最優(yōu)pH的確定，按照“1.5”中介紹的方法，獲得標記的最優(yōu)條件為pH 9.0 Tris緩沖溶液(0.1 mol/L)，抗體與膠體金的最佳比例為6 μg抗體/mL膠體金。在此條件下，相同量的抗體所獲得的膠體金聯苯菊酯單克隆抗體復合物最穩(wěn)定，沒有出現團聚現象。因而，該試驗采用pH 9.0 Tris緩沖溶液(0.1 mol/L)，6 μg抗體/mL膠體金進行標記。

2.4聯苯菊酯試紙條的檢測限圖4是利用制備的聯苯菊酯試紙條，對不同濃度的聯苯菊酯重復5次檢測的一組代表性結果。從圖4中可以看出，當聯苯菊酯的濃度分別為0、500、800以及1 000 μg/kg時，試紙條中T線的顏色逐漸變弱，而C線的顏色逐漸增加。當聯苯菊酯的濃度為0 μg/kg時，T線強度明顯強于C線強度，檢測結果為陰性；當聯苯菊酯的濃度為500 μg/kg時，T線強度與C線強度相當，結果為弱陽性；當聯苯菊酯的濃度為800 μg/kg時，T線強度比C線強度弱，結果為陽性；當聯苯菊酯的濃度為1 000 μg/kg時，T線基本消失，結果為強陽性。該結果表明，試驗研制的試紙條對聯苯菊酯的檢測限為500～800 μg/kg，試驗結果重復性好。

2.5交叉反應表1是試紙條分別對5 mg/kg的8種農藥重復5次測試的結果。從表1中可以看出，試紙條對8種農藥重復5次試驗的結果均為陰性。該結果表明，試紙條對8種不同的農藥(5 mg/kg)沒有交叉反應。這8種農藥的結構與聯苯菊酯非常類似，因而證明該試紙條具有良好的特異性。

2.6實際樣品的加標試驗表2為將新鮮莧菜粉碎后，加入聯苯菊酯標準品，利用提取液提取后，直接用試紙條進行重復20次檢測的試驗結果。從表2中可以得出，沒有加入聯苯菊酯的對照試驗中，20次的檢測結果均為陰性，而當提取液中濃度為800 μg/kg的聯苯菊酯時，20次檢測的結果均為陽性。該結果表明，該試紙條能夠對濃度為800 μg/kg的聯苯菊酯進行準確報陽，檢測結果可靠，重現性好。因而，該試紙條有望對果蔬中的農藥殘留進行快速篩查。

表2莧菜加標試驗結果

Table 2Detection results of standard addition of bifenthrin into edible amaranth

3結論

該研究利用有機合成的方法制備了聯苯菊酯的半抗原，通過人工免疫小鼠的方法制備了對聯苯菊酯具有高特異性識別能力的單克隆抗體。試驗將制備的單克隆抗體標記到膠體金表面，分裝至微孔反應杯凍干。將聯苯菊酯抗原與羊抗鼠二抗噴涂在硝酸纖維素膜后，將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次黏附在PVC地板制備了聯苯菊酯快速檢測試紙條。該試紙條的檢測限為500～800 μg/kg，能滿足歐盟及我國對聯苯菊酯限量的規(guī)定。該方法快速，操作簡單，無需復雜前處理過程，有望對果蔬中聯苯菊酯殘留進行現場快速篩查。

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Development of Colloidal Gold Immunochromatograhic Strip for Rapid Detection of Bifenthrin

ZHU Hai, XU Wen-jian, YANG Xing-xing, WANG Feng-lin*et al

(Shenzhen Yirui Biological Technology Co. Ltd., Shenzhen, Guangdong 518101)

Key wordsBifenthrin; Monoclonal antibody; Colloidal gold; Rapid detection; Immunochromatography

Abstract[Objective] A rapid strip detection method for bifenthrinis was established based on immune colloidal gold technology. [Method] The hapten of bifenthrin was prepared via organic synthesis method, and was conjugated with the carrier protein to obtain the antigen. Monoclonal antibody was obtained with the artificial immune method and its affinity was verified with the enzyme immunoassay. The colloidal gold immunochromatographic strip was prepared with monoclonal antibody conjugated gold colloid which is stored in microwells, and a PVC liner which is assembled with nitrocellulose membrane sprayed with bifenthrin antigen and goat anti-mouse IgG, sample pad and absorbent pad.[Result] The strip had a detection limit in the range of 500-800 μg/kg with the advantages of fastness, easiness, etc. In addition, the strip did not cross-react with most of the pyrethroid pesticides. With the strip, the detection of bifenthrin in edible amaranth was accurately reported. [Conclusion] The colloidal gold strip method has advantages of simple pre-treatment, rapid detection and has potential of fast screening bifenthrin residues in fruits and vegetables.

基金項目廣東省科學技術廳項目“食品安全快速檢測技術工程中心”(GCZX20140509163151273)；深圳市科技創(chuàng)新委員會項目“食源性致病菌磁性熒光納米材料快速檢測試劑盒和現場便攜式手持檢測儀研發(fā)”(2013B040402001)。

作者簡介朱海(1973- )，男，廣東深圳人，副研究員，博士，從事食品安全快速檢測研究。*通訊作者，博士，從事農藥殘留快速檢測研究。

收稿日期2015-12-03

中圖分類號TS 207.5+3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-059-04