無(wú)創(chuàng)性游離DNA產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的現(xiàn)狀

王倩，楊蔚

無(wú)創(chuàng)性游離DNA產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的現(xiàn)狀

王倩，楊蔚△

唐氏綜合征（DS）是導(dǎo)致兒童智力先天殘疾的重要原因。常規(guī)的產(chǎn)前診斷操作如羊膜穿刺術(shù)、絨毛活檢等方法存在風(fēng)險(xiǎn)較高等不足。產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)性游離DNA（cfDNA）診斷可避免對(duì)胎兒的侵入性操作，通過(guò)孕婦外周血循環(huán)中胎兒cfDNA對(duì)唐氏綜合征及其他遺傳性疾病進(jìn)行無(wú)創(chuàng)早期診斷，受到臨床的廣泛關(guān)注，成為產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。盡管近年來(lái)cfDNA診斷技術(shù)具有較大發(fā)展，但此技術(shù)在廣泛應(yīng)用于臨床前，還面臨著技術(shù)、經(jīng)濟(jì)、法律以及倫理學(xué)等諸多問(wèn)題尚待解決。綜述無(wú)創(chuàng)性cfDNA產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的現(xiàn)狀。

產(chǎn)前診斷；唐氏綜合征；普查；DNA；知情同意；倫理學(xué)，醫(yī)學(xué)

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：490-492）

唐氏綜合征（Down syndrome,DS）是兒童智力殘疾的最常見(jiàn)原因之一，在活產(chǎn)中的發(fā)病率約為1/ 800。非整倍體的產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis,PD）通常通過(guò)游離DNA（cell free DNA,cfDNA）對(duì)胎兒染色體非整倍體進(jìn)行診斷，避免了羊膜穿刺術(shù)（chorionic villus sampling,CVS）或絨毛取樣等侵入性操作對(duì)產(chǎn)婦和胎兒造成的危險(xiǎn)。在許多西方國(guó)家，通常通過(guò)采集母親的血清進(jìn)行cfDNA診斷，再根據(jù)超聲標(biāo)記來(lái)建立數(shù)學(xué)模型，然后為每位婦女?dāng)y帶胎兒DS的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，最后才為評(píng)分處于高風(fēng)險(xiǎn)的婦女提供侵入性產(chǎn)前診斷。

1　cfDNA診斷簡(jiǎn)介

羊膜穿刺術(shù)、絨毛活檢或胎兒臍靜脈取血等胎兒染色體檢測(cè)方法價(jià)格昂貴，且有導(dǎo)致胎兒創(chuàng)傷、胎兒畸形、流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)，在妊娠15周后才能進(jìn)行，且要等待3周才能得到結(jié)果，可導(dǎo)致0.3%～1%的胎兒流產(chǎn)。研究表明，羊膜穿刺術(shù)或絨毛活檢等侵入性診斷可導(dǎo)致約1/200的流產(chǎn)率，為限制產(chǎn)前診斷的侵入性操作的數(shù)量，目前篩查DS普遍結(jié)合非侵入性、無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的篩查方法[1]。而通過(guò)cfDNA診斷技術(shù)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒染色體非整倍體診斷，可在妊娠早期提供結(jié)果，并大幅度減少侵入性操作次數(shù)，是一種新興的產(chǎn)前診斷技術(shù)。

1.1cfDNA診斷的檢測(cè)方法1997年首次發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在少量的胎兒cfDNA，這一發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)性診斷奠定了基礎(chǔ)。目前無(wú)創(chuàng)性診斷大多采集35歲以下、妊娠12～24周婦女的外周血，低溫保存。孕婦從妊娠第7周開(kāi)始即可檢測(cè)到cfDNA，在最初3個(gè)月內(nèi)cfDNA含量每周增加約21%，在隨后的3個(gè)月進(jìn)入平臺(tái)期，在分娩前又迅速增加，分娩后2 h內(nèi)迅速消失，此外母體清除cfDNA的速度非常快，半衰期通常只有幾分鐘。從母體外周血中提取的cfDNA可以反映當(dāng)時(shí)胎兒的基因狀態(tài)，并且在采樣過(guò)程中不會(huì)對(duì)胎兒造成損傷。由此可見(jiàn)，孕婦外周血漿中的cfDNA是進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)的理想檢材。檢測(cè)是通過(guò)提取外周血血漿中的cfDNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，將每條DNA片段與人類(lèi)基因組圖進(jìn)行比對(duì)，最后根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，評(píng)估胎兒的染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)值[2]。

1.2cfDNA診斷的應(yīng)用范圍目前我國(guó)普遍使用的產(chǎn)前診斷方法是血清學(xué)妊娠中期二聯(lián)（甲胎蛋白和游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位）或三聯(lián)（甲胎蛋白、游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位和游離雌三醇）檢測(cè)，但是敏感度和特異度仍不盡如人意，約5%的假陽(yáng)性率和65%～75%的檢出率使臨床醫(yī)師難以做出準(zhǔn)確的判斷。無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷可準(zhǔn)確、安全、快速地檢測(cè)胎兒染色體非整倍體疾病，因此近年來(lái)在產(chǎn)前診斷運(yùn)用中取得迅速的發(fā)展[3]，在高風(fēng)險(xiǎn)孕婦人群中檢測(cè)DS、18-三體綜合征、13-三體綜合征的高敏感度和高特異度已逐漸被認(rèn)可。研究發(fā)現(xiàn)，由cfDNA篩選DS全染色體核型的分析結(jié)果高危妊娠的假陽(yáng)性率只有0.5%，并可通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行性別鑒定及性染色體連鎖疾病、胎兒Rh系統(tǒng)基因型的檢測(cè)、妊娠相關(guān)疾病、胎兒染色體病、胎兒染色體片段異常、父系單基因遺傳病等多項(xiàng)產(chǎn)前診斷[4]。

2　cfDNA診斷的意義

由于目前DS無(wú)法治愈，因此產(chǎn)前基因診斷對(duì)維護(hù)孕婦生育自主性具有重要意義。孕婦能夠選擇是否接受孩子的病情，并為其出生做準(zhǔn)備或終止妊娠。無(wú)創(chuàng)性基因診斷、妊娠中期超聲診斷和早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估曾經(jīng)頗具爭(zhēng)議，但在2007年出版的實(shí)務(wù)公告中，美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)已建議將cfDNA產(chǎn)前診斷推薦給所有的婦女[5]。

有研究回顧性分析了2005年1月—2009年12月北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心所進(jìn)行的羊水穿刺、絨毛活檢、臍靜脈穿刺及胎兒鏡檢查病例，羊水穿刺的流產(chǎn)率為1.35%，臍帶穿刺部位出血44.9%，臍靜脈穿刺失敗率為8.16%[6]。cfDNA診斷可減少88%的羊膜穿刺術(shù)等侵入性操作，有效降低高?；颊撸?5歲及以上的孕婦）的綜合風(fēng)險(xiǎn)，提高DS檢出率和減少正常胎兒的損失[7]。目前的非侵入性風(fēng)險(xiǎn)診斷可識(shí)別90%妊娠中的三體綜合征，而檢測(cè)陽(yáng)性率占總?cè)藬?shù)的4%～5%。與妊娠早期超聲診斷胎兒頸項(xiàng)透明層厚度的方法相比，cfDNA診斷減少了94%的醫(yī)源性胎兒丟失，因此cfDNA診斷被認(rèn)為是產(chǎn)前檢測(cè)胎兒非整倍體的有效手段[8-10]。

3　cfDNA診斷的局限性

盡管近年來(lái)cfDNA診斷技術(shù)具有較大發(fā)展，但仍有許多技術(shù)局限性因素需要考慮。雖然有研究表明cfDNA診斷可有效檢測(cè)DS、18-三體綜合征和13-三體綜合征，但是某些可由細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢出的其他染色體結(jié)構(gòu)異常卻無(wú)法被檢出，因此目前認(rèn)為cfDNA診斷只對(duì)染色體數(shù)量異常（即非整倍體異常）檢出率較高[11]。因此，學(xué)者們希望隨著cfDNA技術(shù)的發(fā)展，可通過(guò)結(jié)合標(biāo)記胎盤(pán)功能的生化標(biāo)記物等方法，診斷妊娠并發(fā)癥如子癇前期或胎兒生長(zhǎng)受限相關(guān)的臨床染色體異常[12]。同時(shí)，雖然cfDNA診斷能有效診斷高危妊娠婦女的胎兒非整倍體，但cfDNA診斷對(duì)正常妊娠婦女的診斷意義較低。此項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用于臨床前，需要進(jìn)一步驗(yàn)證cfDNA篩查對(duì)正常妊娠婦女也是一種有效的診斷方法[13]。目前cfDNA篩查技術(shù)僅限于單胎妊娠婦女，還無(wú)法診斷出三倍體的假陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)報(bào)道，假陽(yáng)性結(jié)果可由胎盤(pán)嵌合體、消失的雙胞胎或母體腫瘤等因素造成，并需要更多的研究來(lái)評(píng)定cfDNA診斷得出的母體、胎兒、胎盤(pán)的染色體之間不一致現(xiàn)象的原因[14-16]。

4　cfDNA診斷所涉及的倫理學(xué)問(wèn)題

cfDNA診斷技術(shù)的應(yīng)用要遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，其涉及的倫理學(xué)問(wèn)題主要是患者的生育自主權(quán)和知情同意權(quán)[17-18]。世界各國(guó)公認(rèn)在進(jìn)行醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)必須取得患者的知情同意。DS的產(chǎn)前檢查已在臨床開(kāi)展了幾十年，各種新方法、新技術(shù)的不斷推出使DS的檢出率顯著提高。在DS的診斷中，知情同意與知情選擇是醫(yī)患關(guān)系中涉及的一個(gè)最基本的倫理學(xué)問(wèn)題。醫(yī)生需要告知患者DS是個(gè)什么樣的疾病，為什么要進(jìn)行產(chǎn)前診斷，讓患者在完全了解的情況下自愿選擇是否進(jìn)行產(chǎn)前診斷。DS產(chǎn)前診斷涉及的倫理學(xué)問(wèn)題包括：①產(chǎn)前診斷的醫(yī)學(xué)指征；②確診后是否選擇流產(chǎn)；③無(wú)創(chuàng)性診斷技術(shù)。而且cfDNA診斷在妊娠中期獲知診斷結(jié)果，很多地區(qū)認(rèn)為妊娠中期的胎兒比妊娠早期胎兒有更高的道德地位和意義，因此要求cfDNA技術(shù)需不斷完善，能夠更早地獲知診斷結(jié)果，并且產(chǎn)前診斷前需征得患者的知情同意[19-20]。解決重要的倫理、社會(huì)和法律問(wèn)題，需要對(duì)患者和檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行教育以加強(qiáng)保護(hù)生育自主權(quán)和知情同意權(quán)意識(shí)，構(gòu)建完善的監(jiān)管機(jī)制。

5　結(jié)語(yǔ)與展望

cfDNA篩查是產(chǎn)前診斷的一個(gè)重大突破，這項(xiàng)技術(shù)在妊娠早期有可能提供診斷結(jié)果和大幅度減少侵入性操作。通過(guò)母親外周血漿中cfDNA檢測(cè)獲得胎兒信息現(xiàn)已成為產(chǎn)前診斷的研究熱點(diǎn)。然而cfDNA篩查除了檢測(cè)21-和18-三體異常，尚不能檢測(cè)到所有的染色體異常，且其臨床有效性、實(shí)用性以及風(fēng)險(xiǎn)性尚缺乏足夠臨床數(shù)據(jù)支撐。隨著研究地不斷深入，學(xué)者們對(duì)母體血漿中cfDNA的生物學(xué)特性的認(rèn)知更加廣泛。如何消除母體DNA的背景干擾，提高cfDNA濃度，從而提高診斷的準(zhǔn)確率，已成為亟待解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中大多數(shù)cfDNA分子片段長(zhǎng)度小于300 bp，而大多數(shù)母體來(lái)源的DNA分子片段長(zhǎng)度大于300 bp，依據(jù)DNA分子片段長(zhǎng)度的差異，特異性富集片段長(zhǎng)度小于300 bp的DNA分子，從而可以達(dá)到高效富集cfDNA的目的?？梢愿鶕?jù)cfDNA來(lái)源、片段長(zhǎng)度分布及清除機(jī)制以及生物學(xué)標(biāo)記物等多方面特性，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、肽核酸、時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)、定量PCR、數(shù)字化PCR、基因測(cè)序技術(shù)等提高其診斷的準(zhǔn)確性和特異性。

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[本文編輯王昕]

Application of Non-Invasive Fetal Cell-Free DNA Test in Prenatal Diagnosis of Fetus Chromosomal Abnormality:A Review

WANG Qian,YANG Wei.

Department of Obstetrics and Gynecology,Tianjin Shuige Hospital，Tianjin 300090，China

YANG Wei,E-mail:yangwei.1970@163.com

Down syndrome(DS)is one of the important reasons for the intelligence congenital deformity in children.Regular prenatal diagnosis is not satisfied due to the invasive procedures,such as amniocentesis and chorionic villus sampling.Nowadays,the non-invasive cell-free DNA(cfDNA)screening and diagnosis can avoid those invasive procedures.The application of cfDNA test with the peripheral blood of pregnant women in the noninvasive prenatal screening and diagnosis of DS and other genetic diseases has

extensive attention in the field of prenatal diagnosis.Although the cfDNA diagnosis technology has been greatly developed in recent years, there are still many problems to be solved,such as technical,legal and social issues,before its extensive use.In this paper,the non-invasive cfDNA and its application in prenatal diagnosis were reviewed.

Prenatal diagnosis;Down syndrome;DNA;Informed consent;Ethics,medical

300090天津市水閣醫(yī)院婦產(chǎn)科

楊蔚，E-mail：yangwei.1970@163.com

△審校者

（2016-08-02）