乙型肝炎病毒相關性腎炎實驗室檢查方法研究進展

郝小康 綜述，郭瑞林 審校

(陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，陜西咸陽 712000)

·綜述·

乙型肝炎病毒相關性腎炎實驗室檢查方法研究進展

郝小康 綜述，郭瑞林 審校

(陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，陜西咸陽 712000)

關鍵詞:乙型肝炎;腎炎;臨床實驗室檢查

乙型肝炎(下稱乙肝)病毒相關性腎炎(HBV-GN)是HBV誘發(fā)的腎小球腎炎，由于我國HBV感染較高，人群中 HBV 攜帶率高達 10%,由此引起的腎臟損害亦非常常見。史文麗等[1]研究顯示，HBV-GN約占腎活檢0.25%。HBV-GN的發(fā)病機制較為復雜，涉及多種學說：包括免疫復合物介導、HBV直接感染腎臟、HBV誘發(fā)的自身免疫、免疫缺陷、遺傳因素等[2]。目前國內在HBV-GN的診斷上還有待深入研究討論，而國外由于HBV感染的低發(fā)生率，沒有制定相應的標準，現(xiàn)在很多醫(yī)院臨床大夫仍在沿用1989年HBV-GN座談會制定的初步診斷標準[3]。2001年全國腎活檢病理診斷研討會制定了HBV-GN診斷標準[4]：通過免疫組化方法在腎小球內檢測出HBV抗原(HBV-Ag)陽性，方可診斷為HBV-GN。2004年黎磊石院士也提出了關于HBV-GN的診斷標準。由于一些學者在血清HBV標志物陰性兒童的腎臟中檢測到HBV標志物，并且結合臨床表現(xiàn)可以診斷HBV-GN，所以修訂了HBV-GN的標準[5-6]。多數(shù)學者認為，腎組織中HBV抗原陽性的患者，結合腎臟典型病理表現(xiàn)，可以診斷為HBV-GN，而對于血清HBV-Ag陽性，腎組織HBV-Ag陰性的患者則不能診斷HBV-GN。所以腎組織HBV標志物的檢測對于HBV-GN的診斷意義重大。HBV標志物在腎臟中的檢測一直存在問題，實驗室關于腎組織HBV標志物的檢測，目前主要包括免疫熒光法、免疫組織化學法(下稱免疫組化法)、核酸分子檢查這3種方法，現(xiàn)將這3種實驗室檢查方法原理及優(yōu)缺點綜述如下。

1免疫熒光法

1961年Dixon開始在腎臟疾病中應用免疫熒光技術，對腎臟病的病理診斷提供了重要幫助。腎組織中HBV-Ag的檢測主要采用間接免疫熒光法，即先用鼠抗人一抗與HBV-Ag反應，形成復合物，然后用熒光素標記的羊抗鼠二抗與復合物反應，發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察。目前實驗室免疫熒光的檢查主要是通過冰凍切片組織和石蠟切片組織來完成。冰凍切片免疫熒光具有操作時間短，步驟簡單，組織抗原保護好等優(yōu)點[7]。但是冰凍間接免疫熒光染色要求實驗人員做到：(1)切割后的新鮮腎組織要迅速放入含有生理鹽水的一次性塑料管中，隨后放至冰凍切片機內，進行包埋切片；(2)免疫熒光檢查的腎組織應避免接觸任何固定液；(3)推薦使用廠家的OCT包埋劑，不要使用普通膠水代替；(4)切出大面后要在顯微鏡下觀察有無腎小球，如果難以確認，可以將切片放入蘇木素中幾秒鐘后觀察，確認切片內有腎小球后重新切片。冰凍切片間接免疫熒光因為使用新鮮腎組織的原因，沒有受到常規(guī)固定液的影響，結果的準確性和靈敏度比較可靠，所以臨床實驗室應多使用此方法。但是冰凍切片機和熒光抗體費用較高，使基層醫(yī)院在使用上有所限制。

石蠟切片免疫熒光應用較少，作為冰凍切片無腎小球時的補救措施。但是由于腎組織在常規(guī)固定中使用的是10%的甲醛，甲醛固定的石蠟切片可以使腎組織內的蛋白質交聯(lián),抗原決定簇被封閉，導致假陰性。所以必要的抗原修復對于石蠟切片免疫熒光的成功具有重要意義。有研究報道，石蠟切片胰酶抗原修復方法與冰凍切片免疫熒光在檢測腎組織HBV-Ag取得相似的效果[8]。彭衛(wèi)華等[9]選擇HBV-GN、 紅斑狼瘡腎炎、 IgA腎病，比較了幾種抗原修復法的異同，結果顯示胃蛋白酶修復效果好。張嵐等[10]比較了石蠟切片與冷凍切片的免疫熒光染色的異同，得出經(jīng)過胃蛋白酶修復過的石蠟切片在關于疾病診斷判讀上沒有區(qū)別，只是顯色強度上稍微弱于冰凍切片。有學者提出，高溫高壓修復也可以用于腎組織HBV-Ag的檢查，但是要注意高壓鍋加熱修復可能導致組織破碎，尤其像腎活檢這樣的小組織[11]。這些相關性研究或許可以在HBV-Ag的檢測時提供幫助，但是鑒于石蠟切片免疫熒光所做的研究較少，具體效果還有待證實。

2免疫組化法

免疫組化法作為實驗室檢測HBV-Ag的另一種重要方法，檢測HBV-Ag主要是應用免疫酶染色法，即用酶標記特異性的抗體，待酶標抗體與抗原反應形成免疫復合物后，加入底物顯色，進行鏡檢。目前實驗室多采用Dako公司推出的二步法免疫組化技術-EnVision法，相對于SP、ABC等方法，要敏感很多，定位比較好、比較省時[12]。隨著免疫組化的自動化，許多實驗室目前都配有全自動免疫組化機，但是由于全自動免疫組化機所使用的抗原修復大多為EDTA和檸檬酸，這在石蠟切片HBV-Ag檢測應用還沒有大量試驗進行驗證，所以應該持懷疑態(tài)度。免疫組化染色涉及不同抗原的修復方法選擇、不同廠家抗體效價、人為因素等缺點,使免疫組化技術的不確定性增多。伴隨著試驗儀器的發(fā)展和試驗人員知識提高，一些改良的免疫組化方法取得了較好的效果。石成鋼等[13]研究了冰凍切片免疫熒光和石蠟切片免疫組化的比較,HBV-Ag陽性率相近，改良組化為67.5%，熒光法為72.5%。

3核酸分子檢測方法

HBV感染人體后，致病和傳播主要在HBV-DNA。HBsAg和HBV-DNA作為HBV的外殼和核酸，檢出HBsAg說明HBV感染了人體，但是不代表有傳染性。HBV-DNA陽性則說明HBV在人體復制和有傳染性。共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)代表HBV-DNA正在復制，是復制過程中RNA的直接模板,它的檢出相比HBV-DNA更能說明病毒復制。已知細胞內持續(xù) HBV 感染以核內cccDNA的存在為特征,HBV cccDNA的檢測對研究HBV-GN致病機制和評價抗病毒藥物的療效等方面具有重要意義。1983年，Hogan等[14]發(fā)現(xiàn)，HBV cccDNA和HBsAg存在于鴨的腎組織中，證明HBV能在腎組織復制和翻譯。Toplu等[15]研究抗病毒藥物對血液HBV DNA和組織細胞內的HBV cccDNA的效果，得出拉米夫定對清除HBV cccDNA作用不大，所以檢測HBV cccDNA在臨床監(jiān)測HBV疾病發(fā)展和用藥效果方面是非常有必要的。目前HBV核酸分子的檢測主要包括聚合酶鏈反應(PCR)、原位雜交技術、Southern-blot等方法檢測。

3.1PCR腎組織HBV的核酸PCR檢測技術是在新鮮腎組織或石蠟包埋腎組織中提取到目的DNA后,直接用PCR儀擴增后檢測。PCR已比較成熟,目前實驗室多采用熒光定量PCR檢測,標準化操作流程見參考文獻[16]。當然也要注意實時熒光定量PCR也有不可忽視的缺點，在檢測步驟方面對于目的模板的制備，使用不同方法對于DNA的提取，擴增時反應條件的掌握及對PCR儀器的熟知等，這些方面都對檢測提出了較高的要求。姜國濤等[17]報道用巣式PCR檢測HBV-DNA陽性率為53．8%,免疫組化檢測HBsAg陽性率為48.1%。證實了腎組織中核酸標志物的陽性率高于抗原標志物的陽性率。Mccourt等[18]應用PCR技術檢測HBV-GN患者中腎活檢抽提物PCR檢查HBV-DNA陽性率為76.5%。然而在行直接PCR檢測新鮮或石蠟包埋的腎組織時,不能排除血液中 HBV污染[19]。王祝娟等[20]采用實時熒光定量PCR對患者肝組織內的cccDNA進行了檢測,然而在判讀結果中因該考慮到酶處理對象時導致HBV cccDNA減少這一因素。

3.2原位雜交原位分子雜交法是檢測腎組織中HBV DNA或RNA的另一方法。將經(jīng)過適當處理的腎組織切片，與放射性物質或生物素標記的HBV DNA探針進行核酸雜交，載玻片光乳劑中雜交HBV-DNA或RNA，在放射核素顯像圖中呈黑色顆粒，可發(fā)現(xiàn)HBV感染的腎細胞。具體步驟可見參考文獻[21]。原位雜交的優(yōu)點是既可檢測少量DNA,又可判斷腎組織中HBV感染細胞的分布狀況。在 HBV-GN 患者的腎組織中檢測到 HBV 核酸分子,說明HBV 在腎組織中存在并且復制。然而用原位雜交檢測 HBV DNA,國內以往均獲陰性結果。原位雜交方法也有內在的缺點，例如不能夠精確定量核酸分子，在探針選擇、標記、濃度和雜交的時間和溫度上都有嚴格的要求，組織內源性酶的影響等這些因素使它在臨床應用受到了考驗[22]。

3.3Southern印跡雜交Southern印跡分子雜交法適合用于區(qū)分整合于腎組織細胞的HBV-DNA和未整合的游離HBV-DNA，并可顯示病毒復制中的中間產(chǎn)物序列，原理是腎細胞中DNA被一定的限制核酸酶切割，降解為一些小片段，后者通過瓊脂凝膠電泳按相對分子質量大小分離開，將其移至硝化纖維素膜或尼龍膜上，變性后再與放射性物質標記的HBV-DNA探針一起孵育，二者結合后的含HBV-DNA片段在放射核素顯像圖上呈黑帶。應用 Southern印跡雜交在腎組織中見到整合型 HBV DNA,但無法提示HBV DNA在細胞內的定位。

隨著實驗室技術的不斷發(fā)展，有很多學者也運用其他方法檢測HBV核酸分子，取得了不錯的效果。張愛平報道直接原位 PCR檢測 HBV DNA陽性信號較原位雜交更為清晰。張靜等[23]報道應用原位雜交結合PCR檢測40例HBV-GN患者的腎組織石蠟標本，HBV mRNA檢測陽性率達到80%以上,腎小管陽性率高于腎小球。應用原位雜交結合PCR檢測HBV-GN患者的腎組織石蠟標本HBV mRNA檢測陽性率達到95%。原位PCR始于1990年，是對細胞內目的基因片段擴增再結合原位雜交進行檢測的方法，具有擴增高效性與精確定位的優(yōu)點。腎組織 HBV cccDNA的檢測應采用原位雜交技術和 PCR 技術。Zhong等[24]在檢測肝組織中的HBV cccDNA時，針對DNA少的情況，將實時熒光PCR技術和PSAD消化、滾環(huán)擴增及跨缺口聯(lián)合，檢測到一般PCR所不能檢測到的范圍。周益等[25]應用激光微分離技術結合PCR檢測腎組織HBV DNA,檢出率為54.5%,通過激光微分離腎小球和腎小管，從而清除了來自腎血管和間質中HBV DNA對結果的影響，對HBV分布在腎小球還是腎小管作出了解釋。以上幾種方法或許會在檢測腎組織中檢測HBV DNA和HBV mRNA、HBV cccDNA提供有效的檢測標準。

綜上所述,目前臨床上冰凍免疫熒光方法檢測腎組織中HBV-Ag作為診斷HBV-GN最常用的方法。腎組織HBV標志物的檢測方法中,冰凍免疫熒光方法在臨床實驗室應用最為普遍，在腎組織HBV標志物的檢測方法中,冰凍免疫熒光技術因為采用新鮮標本的原因，熒光抗體的靈敏度尚可，避免了很多影響因素,所以受到臨床實驗室的認可。缺點是需要腎組織新鮮,實驗室配備有冰凍切片機、熒光顯微鏡等設備，不適合做回顧性研究;免疫組化技術由于使用的是石蠟組織，檢出敏感度較低，還有技術人員熟練程度影響大,限制了它的應用。經(jīng)過改良的免疫組化技術還需要更多的研究及探索才能明確其對診斷的效果。PCR、原位雜交技術、 Southern印跡雜交因為各自方法的缺點很難實現(xiàn)獨自在檢測腎組織中HBV核酸分子的可靠性與真實性。原位PCR結合了PCR和原位雜交技術的優(yōu)點，對檢測到有HBV的核酸分子真實性有保證,可以為臨床檢測服務。激光微分離技術反映病毒在腎組織的分布中具有獨特優(yōu)勢,在提取特定腎組織部位核酸分子上可以為其他檢測方法所采用。希望以上研究進展為臨床HBV-GN的診斷提供一個新的有效的途徑。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.029

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1522-04

(收稿日期：2016-01-20修回日期：2016-03-19)