液體培養(yǎng)條件對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

樊金華，薛皎亮，張虎芳，謝映平

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；

3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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液體培養(yǎng)條件對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

樊金華1，薛皎亮2，張虎芳3，謝映平2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；

3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：白僵菌代謝產(chǎn)物可以大大提高靶標(biāo)害蟲的殺蟲效果，揭示菌株培養(yǎng)條件與代謝物產(chǎn)量之間的關(guān)系對于代謝物的大量提取具有重要意義。本研究采用正交試驗對白僵菌2382菌株的培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速4個培養(yǎng)條件與代謝物產(chǎn)量之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:各因子對白僵菌液體培養(yǎng)代謝物產(chǎn)量影響的強弱排序為培養(yǎng)基初始pH值>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速，白僵菌液體培養(yǎng)代謝物產(chǎn)量最佳的培養(yǎng)條件為：初始pH值5.0、培養(yǎng)時間10 d、培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速140 r·min-1。該研究為大批量提取白僵菌代謝產(chǎn)物及其在害蟲生物防治中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：布氏白僵菌；液體培養(yǎng)；正交試驗；次生代謝產(chǎn)物

蟲生真菌是指寄生于昆蟲和蜘蛛的真菌，全世界已經(jīng)記載的約有800多種，在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，其中寄生昆蟲的真菌就有215種[1]。已有的研究表明，這些蟲生真菌不僅具有殺蟲的作用，而且其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也具有重要的生物學(xué)活性。例如蟲生真菌代謝產(chǎn)物具有藥用價值[2]、可以對植物的真菌性病害起到抑制作用[3]、促進(jìn)小麥胚芽鞘的伸長生長[4]、具有殺線蟲和殺蟲活性[5,6]。因此，蟲生真菌代謝產(chǎn)物的研究越來越引起人們的關(guān)注。

有研究表明，寄主昆蟲的免疫抵抗作用是蟲生真菌防治效果不穩(wěn)定的一個重要因素。當(dāng)金龜子幼蟲被注入綠僵菌大孢變種(Metarhiziumanisopliaevar. major)后，敏感種白金花金龜子的幼蟲體內(nèi)則形成松散的包囊體，孢子可順利地萌發(fā)和生長；免疫種銅綠麗金龜子(AnomalacorpulentaMotschul)和華北大黑鰓金龜子(Holotrichiaoblita)的幼蟲體內(nèi)形成典型結(jié)構(gòu)的包囊體，其內(nèi)部是黑化的不能萌發(fā)的綠僵菌孢子[7]。蟲生真菌次生代謝產(chǎn)物在抑制宿主的免疫活性方面發(fā)揮著重要的作用。Bandani 報道了霉菌Tolypocladiumcylindrosporum及其代謝產(chǎn)物 efrapeptins 能夠影響大蠟螟GalleriamellonellaL. 幼蟲的免疫系統(tǒng)，感染后的昆蟲血細(xì)胞總數(shù)在前24 h保持恒定，在接下來的24 h明顯下降[8]。

國內(nèi)外有報道表明，蟲生真菌次生代謝產(chǎn)物主要有白僵菌素(Beauverolides)、卵孢霉素(Oosporein)、環(huán)孢素(Cyclosporin)和破壞素(Destruxins)等[9]。但是，這些次生代謝產(chǎn)物主要為多肽或蛋白類，而對次生代謝產(chǎn)物中小分子化合物的研究報道還很少。與多肽或蛋白類物質(zhì)相比，小分子化合物具有更穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)，更有可能成為天然昆蟲免疫抑制劑的潛在來源。因此，蟲生真菌代謝產(chǎn)生的小分子化合物的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。

至今，關(guān)于真菌液體培養(yǎng)條件的研究主要集中在孢子產(chǎn)量、生物量和微菌核[10]的產(chǎn)生方面，而對培養(yǎng)條件與代謝物產(chǎn)量之間的關(guān)系方面的研究還未見報道。2008年，本課題組從布氏白僵菌發(fā)酵液中分離得到了對松毛蟲免疫活性具有抑制作用的菌株小分子代謝產(chǎn)物粗提物，經(jīng)過氣質(zhì)聯(lián)用分析證明了其中的主要組分為2-哌啶酮和2-香豆?jié)M酮[11,12]。為了獲得大量的菌株代謝產(chǎn)物，本研究利用正交試驗對布氏白僵菌液體培養(yǎng)代謝物產(chǎn)量的條件進(jìn)行優(yōu)化。該研究可為昆蟲免疫抑制劑的大量提取，及其在有害昆蟲生物防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株

本項研究采用課題組于2006年3月，在河北承德油松林內(nèi)采集的油松毛蟲幼蟲死亡蟲體上分離并鑒定得到的一株布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)作為菌種[13]，該菌株同時保藏在北京國家菌種保藏中心，編號2382。

1.1.2儀器及試劑

恒溫?fù)u床(Thermo MAX 低溫?fù)u床)；電子天平(島津AY120，日本島津公司)；低速大容量離心機(上海安亭)；真空干燥箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司DZX-3)。蛋白胨、酵母浸出膏(奧博星，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；葡萄糖、乙醇、乙酸乙酯(風(fēng)船，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

1.2　菌株孢子懸液的制備

將布氏白僵菌2382菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，(25±1) ℃，75% RH的條件下培養(yǎng)10 d。將孢子粉懸浮于無菌的0.01%吐溫80水(v/v)中，制成濃度為1×107孢子·L-1的孢子懸液。

1.3　液體培養(yǎng)

培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出膏10 g·L-1，葡萄糖40 g·L-1，蒸餾水定容到1000 mL。

接種和培養(yǎng)：液體培養(yǎng)用500 mL的三角瓶，每瓶裝入液體培養(yǎng)基200 mL，滅菌后接種。接種量為每瓶接種1 mL孢子懸液。然后在恒溫?fù)u床上(25±1) ℃培養(yǎng)。每個試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.4　培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗設(shè)計

根據(jù)白僵菌的生長特點，選擇培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度4個因子，每個因子在3個水平下對白僵菌進(jìn)行液體培養(yǎng)條件正交試驗并作方差分析，因素水平設(shè)計見表1。

表1　正交試驗因素水平表

1.5　菌株代謝產(chǎn)物的測定

采用胡豐林(2006)的方法[14]。發(fā)酵液經(jīng)濃縮、醇沉、萃取、所得有機相濃縮干燥，得到深紅色粉末即為菌株的代謝產(chǎn)物，用電子天平稱量。

1.6　統(tǒng)計分析

運用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1　培養(yǎng)條件對白僵菌代謝產(chǎn)物的影響

試驗結(jié)果顯示，4個因子在白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量中均產(chǎn)生了影響，但各因子的影響程度不同(表2，表3)。根據(jù)F值將各因子對白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量影響強弱排序為B>A>D>C，即初始pH值>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速。

表2　培養(yǎng)條件對白僵菌代謝物產(chǎn)量影響的正交試驗結(jié)果

表3　培養(yǎng)條件對白僵菌代謝物產(chǎn)量影響方差分析

2.2　培養(yǎng)時間對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)時間的長短對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響顯著(表4)，在培養(yǎng)到第10 d時，代謝物產(chǎn)量達(dá)到最大值為(0.123±0.105) g，且與其他時間點的產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)。所以白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)時間為10 d。

表4培養(yǎng)時間對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響差異顯著性比較

Table 4Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from culturing time

水平號Levelnumber培養(yǎng)時間/dCulturingtime代謝產(chǎn)物/gYieldsofmetabolites150.066±0.022a2100.123±0.105b3150.071±0.037a

注：不同字母(a，b)表示水平間差異顯著P<0.05。表5~表7同。

Note：Different letters mean significant difference (P<0.05). The same in table 5~7.

2.3　初始pH值對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始pH值對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響顯著(表5)，在pH值為5.0時，產(chǎn)物量達(dá)到最大值(0.137±0.099) g，且與初始pH值為7.0和9.0的代謝物產(chǎn)量之間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。所以白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)初始pH值為5.0。

表5初始pH值對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響差異顯著性比較

Table 5Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from the initial pH

水平號Levelnumber初始pH值InitialpH代謝產(chǎn)物/gYieldsofmetabolites15.00.137±0.099a27.00.064±0.028b39.00.059±0.017b

2.4　轉(zhuǎn)速對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

白僵菌液體發(fā)酵時轉(zhuǎn)速對代謝物產(chǎn)量有影響(表6)。在轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時，產(chǎn)量達(dá)到(0.113±0.11) g，與轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時的產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)。所以白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為140 r·min-1。

2.5　溫度對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度對白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量有顯著影響(表7)，在30 ℃時，產(chǎn)量達(dá)到最大值為(0.120±0.106) g，且與溫度20 ℃和25 ℃之間差異顯著(P<0.05)。所以白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

表6轉(zhuǎn)速對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響差異顯著性比較

Table 6Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from rotation rate

水平號Levelnumber轉(zhuǎn)速/r·min-1Rotationrate代謝產(chǎn)物/gYieldsofmetabolites1100.00.058±0.016a2140.00.113±0.110b3180.00.089±0.032ab

表7培養(yǎng)溫度對白僵菌代謝物產(chǎn)量的影響差異顯著性比較

Table 7Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from culturing temperature

水平號Levelnumber溫度/℃Culturingtemperature代謝產(chǎn)物/gYieldsofmetabolites120.00.070±0.019a225.00.070±0.040a330.00.120±0.106b

3結(jié)論與討論

本文以布氏白僵菌2382菌株為研究對象，采用正交試驗對該菌株液體培養(yǎng)條件對代謝產(chǎn)物的影響進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，各因子對白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量影響強弱排序為B>A>D>C，即初始pH值>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速。白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量最佳培養(yǎng)條件為A2B1C2D3，在該條件下最大代謝產(chǎn)物量為(0.27±0.12) g。由此可知，在各因子中初始pH值對白僵菌液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的影響較大。研究表明，真菌的最適產(chǎn)生孢子的生長溫度一般為25 ℃。我們用單因素篩選方案對該菌株的產(chǎn)孢量的液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)溫度為25 ℃條件下，菌株的孢子產(chǎn)量最大[15]。但是本研究表明該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最佳溫度為30 ℃，這說明菌株產(chǎn)生代謝產(chǎn)物和孢子的最佳培養(yǎng)溫度存在差異。

正交試驗設(shè)計與普通的多因素試驗設(shè)計相比可以用較少的、有代表性的處理組合提供充分有用的信息。它在分析主效應(yīng)與交互作用的同時大大減少了樣本量及試驗次數(shù)，是一種高效、靈活的多因素試驗設(shè)計方法，因此被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中[16]。本研究采用正交試驗得到了白僵菌液體擴大培養(yǎng)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最佳條件，大大方便了實驗結(jié)果處理，使實驗更加科學(xué)。鄭衛(wèi)星等[17]也運用SPSS軟件設(shè)計L9(34)正交表并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出中性蛋白酶水解提取林蛙油多糖的工藝。

總之，采用正交試驗設(shè)計研究了白僵菌液體培養(yǎng)條件對菌株代謝產(chǎn)物的影響，證明了初始pH值對菌株液體發(fā)酵代謝物產(chǎn)量的影響較大并獲得了最佳的發(fā)酵條件。該研究首次對液體培養(yǎng)條件對真菌代謝產(chǎn)物的影響進(jìn)行了探討，對優(yōu)化蟲生真菌代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝，以及菌株代謝產(chǎn)物在生物防治中的大規(guī)模應(yīng)用具有重要的意義。

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(編輯：梁文俊)

Effect of liquid fermentation conditions to the metabolite yield ofBeauveriaBrongniartii

Fan Jinhua1, Xue Jiaoliang2, Zhang Hufang3, Xie Yingping2

(1.CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.CollegeofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China; 3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:Metabolites ofBeauveriacan greatly improve the insecticidal effect of pests, and study the relationship between culture conditions and metabolite production was very important for the massive extraction of metabolites. In this study, ,the relationships of the initial pH in culture media, culture times, culture temperature, and rotatory speed with the production ofBeauveriabrongniartii2382 metabolites were investigated by using orthogonal test. The results showed that the factors in liquid culture related to the secondary metabolite yield of the strain were the initial pH in culture media > culture times > culture temperature > rotatory speed. The optimum culture condition for secondary metabolite yield of the strain in liquid culture was: initial pH in culture media 5.0, cultured for 10 days, 30 ℃, and 140 r·min-1. The study provided a scientific basis for large batch extraction ofBeauveriabrongniartiimetabolites and the application of the biological control of pests.

Key words:BeauveriaBrongniartii; Liquid culture; Orthogonal test; Secondary metabolite

中圖分類號：S476.12

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)01-0026-05

基金項目：山西省基礎(chǔ)研究計劃(青年科技研究基金)(2015021155);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動項目(2014YJ06)

作者簡介：樊金華(1979-)，女(漢)，河北唐山人，講師，博士，研究方向：害蟲生物防治

收稿日期：2015-10-31修回日期：2015-11-30