水合有機(jī)溶液體系中類胡蘿卜素聚集體的探究

趙英源，賈慧慧，李紫薇，梁 晉，李瑞芳，陳 迪，王 靜

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.名古屋大學(xué)大學(xué)院生命農(nóng)學(xué)研究科，愛知 名古屋 4648601；3.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類重要天然色素的總稱，廣泛存在于動(dòng)物、高等植物、藻類和微生物中[1]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可將其分為兩大類[2]：一類不含氧元素，如β-胡蘿卜素；另一類則可形成含氧官能團(tuán)，如蝦青素和葉黃素[3]，三種類胡蘿卜素的分子結(jié)構(gòu)見圖1。類胡蘿卜素具有眾多生理功效，在抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]以及預(yù)防心血管疾病[8]等方面效果顯著，在食品、醫(yī)藥、生物和化工等領(lǐng)域中均發(fā)揮著重要作用[9-11]。但是，類胡蘿卜素的水分散性差和不穩(wěn)定等特點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用[12]，并且在一定的水合有機(jī)體系中，類胡蘿卜素分子可發(fā)生自聚集，形成不同于單體的聚集體（H 聚集體或J 聚集體），直接關(guān)系到其功能的發(fā)揮。

圖1 三種類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of three carotenoids

Judith 等[13]的研究表明類胡蘿卜素分子在水合有機(jī)體系中可形成不同類型的聚集體，區(qū)分不同聚集體最直觀的表現(xiàn)在于顏色，如H 聚集體-蝦青素乙醇溶液為淺黃色、J 聚集體-蝦青素乙醇溶液為粉紫色等[14-15]。此外，在紫外可見光譜中，相對(duì)于單體而言，光譜藍(lán)移則為H 聚集體，光譜紅移則為J 聚集體[16-17]。不同類胡蘿卜素由于分子結(jié)構(gòu)的不同可形成的聚集體類型和難易程度不同，如蝦青素和β-胡蘿卜素可形成H 聚集體和J 聚集體，葉黃素僅能形成H 聚集體。而分子間的范德華力、靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵力等相互作用是形成聚集體的原因[18-19]。在影響聚集類型的因素中，水合有機(jī)體系中含水量的多少對(duì)聚集體的形成至關(guān)重要，含水量多易形成H 聚集體[20]。

食品、藥品、化妝品和生物體中含有一定量的水，其影響著聚集體的類型，而聚集體的理化性質(zhì)和光學(xué)特性不同于單體分子[18]，且H 聚集體的層狀特征和J 聚集體的纖維狀結(jié)構(gòu)的形成可改善類胡蘿卜素的水分散性[21-22]，有利于類胡蘿卜素更好地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝等領(lǐng)域。脂溶性類胡蘿卜素具有多種有益的生理活性，但其在加工或存儲(chǔ)過程中分子單體和聚集體間的變化規(guī)律目前還未有深入的研究報(bào)道。因此，研究類胡蘿卜素聚集體的形成和穩(wěn)定性，單一可控制備類胡蘿卜素聚集體（H 聚集體、J 聚集體或M 單體）具有重要意義。

本文選擇蝦青素、葉黃素和β-胡蘿卜素作為類胡蘿卜素典型代表，探究水合有機(jī)溶劑不同比例和不同加樣順序?qū)︻惡}卜素聚集體的形成類型、形成條件和穩(wěn)定性的影響。本實(shí)驗(yàn)用乙醇或丙酮溶劑溶解類胡蘿卜素，通過改變含水量，在兩種不同加樣順序下基于紫外可見光譜法探究水合有機(jī)體系中類胡蘿卜素的存在狀態(tài)（H 聚集體、J 聚集體和M 單體）、形成條件和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦青素 純度99%，購(gòu)于上海阿拉?。ˋladdin）生化科技股份有限公司；葉黃素 純度90%，購(gòu)于北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司；β-胡蘿卜素 純度99%，購(gòu)于北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司；丙酮、無(wú)水乙醇 采用國(guó)產(chǎn)分析純度試劑。

UV-3100 紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；AMM-6T 多位點(diǎn)加熱磁力攪拌器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；MJ-78A 高壓滅菌鍋施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；DHG9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 類胡蘿卜素溶液的配制 精密稱取2.5 mg 蝦青素、β-胡蘿卜素粉末分別溶于50 mL 丙酮中；精密稱取2.5 mg 葉黃素粉末溶于50 mL 乙醇中，在室溫避光條件下，轉(zhuǎn)速200 r/min，磁力攪拌至少1 h，分別得到濃度為0.05 mg/mL 的各類胡蘿卜素溶液，存放于4 ℃冰箱，以備使用。

1.2.2 類胡蘿卜素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將1.2.1 中制備的類胡蘿卜素溶液按梯度分別稀釋至0.001～0.01 mg/mL，根據(jù)朗伯-比爾定律的使用條件，吸光度在0.2～0.8 之間[23]。根據(jù)定律，溶液濃度不同時(shí)，光吸收曲線的形狀相同，λmax不變，只是吸光度與濃度成正比關(guān)系變化。在489 nm 處測(cè)定不同濃度蝦青素丙酮溶液的吸光度，建立的回歸方程為y=321.88x-0.0253，R2=0.99。在452 nm 下測(cè)定不同濃度葉黃素乙醇溶液的吸光度，建立的回歸方程為y=166.73x-0.0118，R2=0.9977。在454 nm 處測(cè)定不同濃度β-胡蘿卜素丙酮溶液的吸光度，建立的回歸方程為y=188.75x-0.0018，R2=0.9976。以上三種溶液在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度高。

1.2.3 類胡蘿卜素有機(jī)-水混合溶液的制備 參考Giovannetti 等[17]、Subramanian 等[21]和Zajac 等[24]的實(shí)驗(yàn)方法，將制備好的1.2.1 中蝦青素、葉黃素、β-胡蘿卜素溶液分別稀釋，按照有機(jī)溶液占總體積比為10%，20%……90%，將水滴入不同濃度的類胡蘿卜素有機(jī)溶液中，保證每份溶液中類胡蘿卜素含量均為4 mg，并控制每種類胡蘿卜素最終樣品的體積一致，確定每個(gè)樣品中類胡蘿卜素的最終濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度在朗伯-比爾定律規(guī)定的最適范圍內(nèi)。用相同的方法，再將不同濃度的類胡蘿卜素有機(jī)溶液滴入水中。

1.2.4 類胡蘿卜素混合溶液的紫外可見吸收光譜測(cè)量 取制備好的類胡蘿卜素混合溶液利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其在紫外可見光區(qū)進(jìn)行300～800 nm的全波長(zhǎng)掃描。打開紫外可見分光光度計(jì)預(yù)熱15 min，取1.2.2 和1.2.3 的樣品加入樣品皿，以蒸餾水為參比，設(shè)置波長(zhǎng)間隔為1.0 nm，光程為1 cm，進(jìn)行光譜掃描，觀察0 h 不同樣品的光譜特征。

1.2.5 類胡蘿卜素混合溶液的穩(wěn)定性研究 取1.2.4 測(cè)量后的樣品，在室溫（25 ℃）條件下放置24、48 h，按照1.2.4 相同的方法對(duì)樣品進(jìn)行光譜掃描，觀察不同樣品的光譜特征。通過樣品在0、24、48 h 的紫外可見吸收光譜圖，對(duì)比分析其吸收峰的峰形、峰值變化和穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用三次平行實(shí)驗(yàn)取平均值，采用Excel 或者Origin 等畫圖軟件繪制紫外可見吸收光譜圖，并將同種類胡蘿卜素溶液0、24 和48 h 的紫外可見吸收光譜圖繪制組合，觀察其吸收峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素溶液狀態(tài)

依照1.2.3 中方法制備出的三種類胡蘿卜素溶液樣品圖如圖2 所示。通過改變水與有機(jī)相的比例和加樣順序制得的樣品均澄清透明、無(wú)絮凝、無(wú)沉淀。且在不同比例下形成不同的聚集類型且外觀顏色不同。

圖2 三種類胡蘿卜素與不同比例的水與有機(jī)相混合的樣品圖Fig.2 Samples of three carotenoids mixed with different proportions of water and organic solutions

通過分子間相互作用的激發(fā)，類胡蘿卜素分子可在有機(jī)溶劑-水體系中自聚集形成有序的不同類型的聚集體[25-26]。類胡蘿卜素具有強(qiáng)疏水性，水體積分?jǐn)?shù)增大，則形成更多的氫鍵，有利于類胡蘿卜素形成卡包結(jié)構(gòu)的H 聚集體。相反，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)增大，有利于形成頭尾結(jié)構(gòu)的J 聚集體[27]。同一種類胡蘿卜素樣品中溶質(zhì)含量相同，故顏色變化可歸結(jié)于分子的堆積狀態(tài)。以水入有機(jī)方式加樣時(shí)，蝦青素單體顏色呈橘黃色，H 聚集體呈淺黃色，J 聚集體粉色；葉黃素的單體呈橙黃色，H 聚集體呈黃色；β-胡蘿卜素單體和H 聚集體均呈黃色，J 聚集體呈淡粉色。并且薛長(zhǎng)湖等[14]發(fā)現(xiàn)蝦青素H 聚集體呈黃色、J 聚集體呈粉色；Zsila 等[19]發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素的H 聚集體粒子呈黃色，J 聚集體粒子呈鮮紅色，樣品顏色由兩種粒子的濃度比例決定。與本實(shí)驗(yàn)聚集體顏色表現(xiàn)一致，說明有機(jī)相的比例可以影響聚集體的形式。以有機(jī)入水的方式加樣時(shí)，顏色表現(xiàn)與水入有機(jī)方式加樣極其相似，故不贅述。

2.2 類胡蘿卜素溶液紫外可見吸收

2.2.1 蝦青素聚集體紫外可見光譜分析 圖3 為蝦青素溶液在不同有機(jī)溶劑占總體積比、不同時(shí)刻下的紫外可見吸收光譜圖，由圖3（A）的紫外可見光譜可知，在水入有機(jī)的加樣順序下，制備的蝦青素樣品中有機(jī)溶劑占總體積比為60%～90%的樣品在478 nm 處有吸收峰，有機(jī)溶劑占總體積比為10%的樣品吸收峰藍(lán)移至389 nm 處，占比為20%的樣品吸收峰藍(lán)移至390 nm 處，占比為30%的樣品紅移，在517 和560 nm 處有并肩峰。Giovannetti 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，將水加入到蝦青素甲醇溶液中，隨著含水量的增加，水溶液的紫外可見光譜由476 藍(lán)移至388 nm，是因?yàn)榭òY(jié)構(gòu)的H 聚集體的形成，而光譜紅移至525 和565 nm 形成并肩峰是因?yàn)轭^尾結(jié)構(gòu)的J 聚集體的形成[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)中，有機(jī)溶劑占總體積比為60%～90%的樣品為M 單體，而占比為10%～20%的樣品為H 聚集體，占比為30%的樣品為J 聚集體。

隨著時(shí)間的變化，48 h 后（圖3C），形成H 聚集體的10%樣品最大吸收波長(zhǎng)僅從389 紅移至390 nm，吸收度稍有降低，但是峰型不變，說明在48 h 內(nèi)，室溫下，10%有機(jī)占比條件下形成的蝦青素H 聚集體可穩(wěn)定存在。而20%的有機(jī)占比條件下形成的H 聚集體在經(jīng)過24 h 后（圖3B），最大吸收波長(zhǎng)從390 移動(dòng)至478 nm，說明該條件下形成的H 聚集體不能穩(wěn)定存在。而有機(jī)占比為30%條件下形成的J 聚集體峰型不變，可在48 h 內(nèi)穩(wěn)定存在。

圖3 不同有機(jī)占比條件下蝦青素溶液的紫外可見光譜圖及48 h 內(nèi)的光譜變化Fig.3 UV-vis spectra of astaxanthin solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

由圖3（D）的紫外可見光譜可知，在有機(jī)入水的加樣順序下，制備的蝦青素樣品中，有機(jī)溶劑占總體積比為70%～90%的樣品在478 nm 處有吸收峰，而10%和20%的樣品吸收峰分別藍(lán)移至388 和408 nm處，有機(jī)溶劑占總體積比為30%樣品在513 和557 nm處有并肩峰，占比為40%的樣品在522 和567 nm處有并肩峰。薛長(zhǎng)湖等[14]按照1:5～1:10 的有機(jī)相和水相體積比將任意濃度的蝦青素乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，轉(zhuǎn)速200～500 r/min 下攪拌30 min 以上得到黃色的蝦青素H 聚集體，在波長(zhǎng)380～390 nm范圍內(nèi)有最大光吸收。將有機(jī)相水相體積比改為1:2～1:5，轉(zhuǎn)速調(diào)為200～500 r/min，攪拌15～30 min得到粉紫色的J 聚集體，在525 和565 nm 處有并肩峰。因此，有機(jī)溶劑占總體積比為70%～90%的樣品為單體，占比為10%～20%的樣品為H 聚集體，占比為30%～40%的樣品為J 聚集體。

隨著樣品的放置，在有機(jī)占比為10%條件下形成的蝦青素H 聚集體在380 nm 左右的峰值明顯減弱，且24 h（圖3E）和48 h（圖3F）后，吸收峰分別右移至393 和401 nm。20%條件下的H 聚集體最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移至439 nm，且有形成并肩峰的趨勢(shì)。而30%和40%條件下形成的J 聚集體吸收峰基本不變，說明有機(jī)入水的加樣順序下蝦青素H 聚集體不穩(wěn)定，而J 聚集體可在48 h 內(nèi)穩(wěn)定存在。蝦青素在一些條件下會(huì)由H 聚集體轉(zhuǎn)化為J 聚集體，除了通過改變水含量實(shí)現(xiàn)聚集體間的轉(zhuǎn)化外，在蝦青素水溶液中加入一定濃度的表面活性劑，蝦青素聚集體類型也會(huì)改變，表面活性劑的濃度越大，越容易形成H 聚集體。

2.2.2 葉黃素聚集體紫外可見光譜分析 葉黃素乙醇溶液的紫外吸收光譜圖見圖4，葉黃素乙醇有機(jī)溶劑占總體積比為10%～50%的樣品吸收峰位于370～381 nm，且只有一個(gè)特征吸收峰，有機(jī)溶劑占總體積比為60%～90%的樣品在428、450 和478 nm 處有特征吸收峰。根據(jù)Mantovani 等[28]的報(bào)道，葉黃素分子兩端的游離羥基通過分子間氫鍵的形成促進(jìn)了強(qiáng)耦合H 聚集體的形成，其在純乙醇中的溶解狀態(tài)在421、446 和474 nm 處出現(xiàn)吸收峰。盧禮萍等[29]的研究也表明在1:1 體積的乙醇-水溶液中，葉黃素分子以平行的方式緊密排列，形成了H 聚集體，在聚集體形式下葉黃素吸收光譜從單體最大吸收447藍(lán)移至370 nm，產(chǎn)生了77 nm 的藍(lán)移，峰形變窄。根據(jù)上述文獻(xiàn)[29]對(duì)比參照，葉黃素乙醇有機(jī)溶劑占總體積比為10%～50%的樣品形成葉黃素H 聚集體，有機(jī)溶劑占總比為60%～90%的樣品為葉黃素單體，從紫外可見光譜圖可見葉黃素并沒有形成J 聚集體。對(duì)比圖4 中水入有機(jī)和有機(jī)入水兩種加樣方式的兩種紫外可見吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰的峰形和峰值并無(wú)明顯差異。

圖4 不同有機(jī)占比條件下葉黃素溶液的紫外可見光譜圖及48 h 內(nèi)的光譜變化Fig.4 UV-vis spectra of lutein solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

葉黃素乙醇溶液經(jīng)過24 和48 h 的室溫避光條件下放置，由圖4 可見，紫外可見光譜圖中吸收峰的峰形沒有變化，峰值略有降低。說明葉黃素有機(jī)溶劑-水體系中形成的聚集體能穩(wěn)定存在。根據(jù)魏良淑等[22]對(duì)葉黃素聚集體的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水的比例增到乙醇的2 倍后，溶液中的葉黃素全部聚集成H 聚集結(jié)構(gòu)，溶液中水分子數(shù)目大大增加，氫鍵有所增加，并且隨著時(shí)間的推移，聚集體吸收光譜峰位和吸收強(qiáng)度沒有變化。所以通過含水量變化可以改變?nèi)~黃素聚集狀態(tài)，而僅通過含水量變化和長(zhǎng)時(shí)間的放置，并不能實(shí)現(xiàn)葉黃素J 聚集體的形成和轉(zhuǎn)化。

2.2.3β-胡蘿卜素聚集體紫外可見光譜分析 圖5（A）中，在水入有機(jī)的方式滴加的條件下，有機(jī)溶劑占總體積80%和90%時(shí)，在430、456 和484 nm 處出現(xiàn)吸收峰，曲方[18]曾提到β-胡蘿卜素的單體光譜在427、453 和483 nm 處形成光吸收峰，由于溶劑會(huì)對(duì)聚集產(chǎn)生一定的影響，故可推斷占比為80%和90%時(shí)，β-胡蘿卜素形成了M 單體。有機(jī)溶劑占總體積為10%在439、471 和507 nm 處有吸收峰；有機(jī)溶劑占總體積為20%～40%在438、463 和499 nm 處有吸收峰；有機(jī)溶劑占總體積為50%在549 nm 處有一小吸收峰，相較于M 單體，各峰均出現(xiàn)一定程度的紅移。且占比為50%時(shí)，紅移程度最明顯，可認(rèn)為其形成了J 聚集體，與曲方研究所得結(jié)果一致。當(dāng)改變?nèi)軇┍葧r(shí)，吸收的藍(lán)移部分應(yīng)歸因于H 聚集體[18]。故認(rèn)為有機(jī)占總體積比為10%～40%內(nèi)時(shí)，β-胡蘿卜素存在H 聚集體。

圖5 不同有機(jī)占比條件下β-胡蘿卜素溶液的紫外可見光譜圖及48 h 內(nèi)的光譜變化Fig.5 UV-vis spectra of β-carotene solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

以有機(jī)入水的方式滴加時(shí)，β-胡蘿卜素樣品中H 聚集體形成于有機(jī)溶劑占總體積為10%～40%內(nèi)，10%在414 nm 處形成特征峰，20%～40%的特征峰位于435～444、468～472 和509～511 nm 范圍處，且聚集體的各個(gè)特征吸收峰隨有機(jī)占比的增加而右移。J 聚集體形成于有機(jī)溶劑占總體積為50%～70%內(nèi)，特征峰位于453、481 和519 nm 左右，且特征吸收峰處的吸光度隨有機(jī)占比的增加而減小，與此占比下水入有機(jī)滴加方式的吸光度相比略高，可認(rèn)為其聚集現(xiàn)象更明顯。

β-胡蘿卜素經(jīng)過24 和48 h 室溫避光條件下的放置，僅有機(jī)占比為10%形成的H 聚集體類型不變，峰值略有降低，較為穩(wěn)定存在。有機(jī)占比為20%～40%的H 聚集體的特征峰明顯減弱，并且出現(xiàn)J 聚集體的特征吸收峰。即H 聚集體逐漸轉(zhuǎn)化為J 聚集體。有機(jī)占比為50%～70%的吸收峰在24 h 時(shí)衰減，并在48 h 時(shí)消失。有機(jī)占比為80%和90%的吸收峰略有降低。由光譜變化可知，β-胡蘿卜素H 聚集體不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化會(huì)實(shí)現(xiàn)從H 聚集體向J 聚集體的轉(zhuǎn)化。

在有機(jī)入水的加樣順序下，有機(jī)占比為10%～20%的β-胡蘿卜素H 聚集體和有機(jī)占比為50%的β-胡蘿卜素J 聚集體的吸收峰降低，但聚集類型不變，較為穩(wěn)定存在。有機(jī)占比為30%～40%的β-胡蘿卜素最大吸收波長(zhǎng)隨時(shí)間變化發(fā)生紅移，有變?yōu)镴 聚集體的趨勢(shì)。而有機(jī)占比為60%～70%的β-胡蘿卜素失去特征峰。有機(jī)占比為80%和90%的吸收峰略有降低但仍保持其單體狀態(tài)。

3 結(jié)論

本文選擇3 種典型的活性小分子蝦青素、葉黃素和β-胡蘿卜素作為類胡蘿卜素代表，主要以水相和有機(jī)相的比例、加樣順序、樣品初始濃度為關(guān)鍵因素，探究類胡蘿卜素的聚集體形成及其變化規(guī)律。結(jié)果表明三種類胡蘿卜素在水合有機(jī)體系中均可自發(fā)形成H 聚集體或J 聚集體，蝦青素、葉黃素、β-胡蘿卜素3 種類胡蘿卜素溶液形成H 聚集體的有機(jī)溶劑占總體積比分別為10%～20%、10%～50%和10%～40%，此外，蝦青素在30%形成J 聚集體，β-胡蘿卜素在50%～70%形成J 聚集體，葉黃素在60%～90%時(shí)為葉黃素單體。且在有機(jī)入水的加樣順序下，樣品的聚集比水入有機(jī)的加樣順序更顯著且更加穩(wěn)定。探究聚集體的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，樣品在室溫（25 ℃）條件下放置24 和48 h 后，葉黃素的H 聚集類型不變，蝦青素、β-胡蘿卜素的H 聚集體逐漸轉(zhuǎn)化為J 聚集體；蝦青素與β-胡蘿卜素的J 聚體則穩(wěn)定存在。本研究通過分析紫外可見光譜探究3 種類胡蘿卜素聚集體形成的類型和條件，確定了聚集體形成的水合有機(jī)溶劑體積比例，并探究了聚集體之間的轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定性，有望為類胡蘿卜素及其聚集體的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。