新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分·抗氧化及細胞毒活性

陳小強，李佳娜，郭依萍，張 瑩*

(1.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室(黑龍江)，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040)

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新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分·抗氧化及細胞毒活性

陳小強1，2，李佳娜3，郭依萍3，張 瑩1，2*

(1.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室(黑龍江)，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040)

紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)為豆科(Leguminosae)紫穗槐屬(Amorpha)植物，該屬植物約有25種，主產(chǎn)于北美至墨西哥，我國引種紫穗槐1種，作為常用綠肥、蜜源及綠化樹種在我國大部分省區(qū)均有種植[1]。紫穗槐枝條可用于編織，根、莖、葉可藥用，其葉微苦、涼，具有祛濕消腫功效，其花可清熱、涼血、止血，紫穗槐果實揮發(fā)油具有驅蚊止癢功效，是一種理想的天然香料[2]。此外，紫穗槐果實提取物具有抑菌作用和保肝作用，紫穗槐單方亦可應用于治燒燙傷、癰瘡和濕疹[3]。植物揮發(fā)油多具有抗腫瘤、抗氧化和抑菌等生物活性[4-7]。目前有關紫穗槐的研究工作多集中在生理和生態(tài)方面的研究，化學方面的研究較為缺乏，其揮發(fā)油的化學成分雖有所報道[8-9]，但對新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分及其抗氧化和抗腫瘤活性研究鮮見開展。筆者利用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后，采用GC-MS法檢測其成分組成；采用DPPH和β-胡蘿卜素法檢測揮發(fā)油的抗氧化活性，采用SRB法檢測揮發(fā)油對BGC-823、A-549和HeLa等3種腫瘤細胞株的細胞毒活性，研究新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分、抗氧化和細胞毒活性，以期為紫穗槐的進一步研究和開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材紫穗槐果實于2013年8月采自東北林業(yè)大學哈爾濱試驗林場，標本經(jīng)東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室張瑩副研究員鑒定為豆科紫穗槐屬植物紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)的果實。

1.2試劑DPPH(2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)、BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)、BHA(丁基羥基茴香醚)、β-胡蘿卜素、亞油酸、磺酰羅丹明B(SRB)和紫杉醇(Taxol)均購自Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3儀器Agilent 氣相色譜儀6890，檢測器為Agilent 5973 氫火焰離子化檢測器(FID)；紫外-可見光分光光度計(UV-2550，Shimadzu，Japan)，酶標儀(Spectra 190，Molecular Device，USA)。

1.4試驗方法

1.4.1揮發(fā)油提取。將100 g 新鮮紫穗槐果實粉碎，加蒸餾水1 000 mL，水蒸汽蒸餾裝置進行蒸餾。收集揮發(fā)油和水混合液，離心(5 000 r/min)后用移液器將揮發(fā)油取出移至試管中，揮發(fā)油得率為4.25%，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2GC-MS檢測條件。色譜柱為DB-17MS毛細管柱，柱長為30 m，內徑為0.25 μm，液膜厚度為0.25 μm。采用程序升溫，柱溫40 ℃保持1 min，以5 ℃/min 速度升溫至100 ℃，保持2 min；再以5 ℃/min 升溫至220 ℃，保持2 min；最后以60 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速1 mL/min，進樣口溫度220 ℃，進樣量1 μL，GC和MS接口溫度290 ℃。質譜條件為電子轟擊能量70 ev，離子源溫度230 ℃，掃描質量范圍(m/z)40 ～600 amu，采用NIST02 標準譜庫進行檢索。

1.4.3抗氧化活性。

1.4.3.1DPPH法。參考文獻[10]方法，0.2 mL不同濃度的揮發(fā)油甲醇溶液加入1.8 mL DPPH甲醇液(25 mg/mL)中，混合液劇烈震蕩后在黑暗處放置30 min，然后在517 nm處測定吸光值，計為A樣品，以相同體積的甲醇代替樣品測定的吸光值為A對照，清除DPPH自由基能力用SC表示，SC=(1-A樣/A對照)×100%，其中A對照為不加樣品的溶液在t=0時的吸光值，所有吸光值均測定3次，擬合非線性回歸曲線，得出IC50值。BHT和BHA為陽性對照。

1.4.3.2β-胡蘿卜素-亞油酸法。參考文獻[10]方法，20 mg亞油酸和200 mg吐溫40混入1 mL的0.5 mg/mL的β-胡蘿卜素-氯仿溶液，45 ℃減壓濃縮除去氯仿，然后邊攪拌邊緩慢加入50 mL含氧的蒸餾水，最終形成乳液，0.2 mL的5 mg/mL樣品加入5 mL的乳液后立即在470 nm處讀取吸光值，用不含有β-胡蘿卜素的乳液調零，同時用0.2 mL的甲醇代替樣品加入5 mL含β-胡蘿卜素的乳液作為陰性對照在470 nm處讀取吸光值，然后再將試管放入50 ℃水浴中，每隔15 min測定一次吸光值，直到180 min，通過以下公式計算：抑制率=[1-(A0-At)/(A0′-At′)] ×100%，式中，A0和A0′分別代表樣品和對照在0 min時的吸光值，At和At′分別代表樣品和對照在180 min時的吸光值。

1.4.4細胞毒活性。采用SRB法進行紫穗槐揮發(fā)油對HeLa、A549和BGC-823 3種腫瘤細胞株的細胞毒活性研究，紫杉醇作為陽性對照。腫瘤細胞于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中24 h 后，分別加入不同濃度的紫穗槐揮發(fā)油，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，依據(jù)文獻[11]方法，進行細胞毒活性篩選及分析。

2結果與分析

2.1揮發(fā)油的化學成分經(jīng)GC-MS 分析，從紫穗槐果實揮發(fā)油中共分離出50種成分，經(jīng)標準質譜庫檢索，鑒定出40個組分(表1)，占揮發(fā)油總量的88.65%，主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-畢澄茄烯(10.24%)、表圓線藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等，紫穗槐果實揮發(fā)油的大量成分與已有文獻研究結果有所不同[8-9]，推測原因為樣品采集的時間、地點以及處理方法等不同所致。揮發(fā)油的大量成分中杜松烯不僅是常用的香料源，還具有殺菌作用；畢澄茄烯是目前香料工業(yè)的重要原料[12]；這些研究結果也為紫穗槐的新應用提供了有益的參考。

表1　紫穗槐果實揮發(fā)油成分分析

接下表

2.2紫穗槐果實揮發(fā)油的抗氧化活性每一種檢測方法都不足以單獨評價植物揮發(fā)油的抗氧化活性，因此抗氧化活性需要通過多種方法進行綜合評價。DPPH自由基清除能力是一種最常見的衡量化合物或提取物抗氧化活性指標，廣泛應用于多種抗氧化能力測試[13-14]。試驗結果顯示，市售強抗氧化劑BHT和BHA的DPPH自由基清除能力很強，IC50值分別為0.48和0.19 mg/mL，而紫穗槐果實揮發(fā)油對DPPH自由基清除率的IC50值為18.25 mg/mL。紫穗槐果實揮發(fā)油的DPPH自由基清除能力比對照的強抗氧化劑弱約100倍，但也具有一定的抗氧化活性，推測電子轉移作用機制不是其抗氧化作用的主要機制。

β-胡蘿卜素-亞油酸法主要是評價抗氧化劑在乳化脂質體系中抑制脂質氫過氧化前期的能力[15]。β-胡蘿卜素-亞油酸法測定的紫穗槐果實揮發(fā)油抗氧化活性(圖1)顯示，紫穗槐果實揮發(fā)油具有較弱的抗氧化活性，其中1.8 mg/mL紫穗槐果實揮發(fā)油的抑制率為25.08%，而BHT和BHA的抑制率分別為94.19%和98.47%。與2種強抗氧化劑比較發(fā)現(xiàn)，紫穗槐果實揮發(fā)油的抑制率與強抗氧化劑之間的差距較DPPH自由基清除試驗結果有所縮小，說明紫穗槐果實揮發(fā)油可在脂質體系中表現(xiàn)出稍強的抗氧化活性。

圖1　紫穗槐果實揮發(fā)油在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抑制率Table 1　β-carotene-linoleate inhibition of the volatile oil from Amorpha fruticosa fruits

2.3紫穗槐果實揮發(fā)油的細胞毒活性由表2可見，紫穗槐果實揮發(fā)油對人宮頸癌細胞HeLa、人肺癌細胞A-549和人胃癌細胞BGC-823均具有較強的細胞毒活性，其IC50值分別為48.656、46.733和37.597 μg/mL，陽性對照Taxol的IC50值分別為0.375、0.020、0.012 μg/mL，表明紫穗槐果實揮發(fā)油對腫瘤細胞具有較強的細胞毒作用。因此，紫穗槐果實揮發(fā)油對其他腫瘤細胞的細胞毒活性如何、主要活性成分以及相關作用機制值得進一步深入研究。

表2紫穗槐揮發(fā)油的細胞毒活性

Table 2Cytotoxicity activity of the volatile oil fromAmorphafruticosa

μg/mL

3結論

該試驗對新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分、抗氧化和細胞毒活性進行了研究，結果表明，新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的大量成分主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-畢澄茄烯(10.24%)、表圓線藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等；DPPH法和β-胡蘿卜素-亞油酸法測得的揮發(fā)油抗氧化能力均較弱；紫穗槐果實揮發(fā)油對人宮頸癌細胞HeLa、人肺癌細胞A-549和人胃癌細胞BGC-823均有較強的細胞毒活性，具有進一步研究的價值。該研究結果為紫穗槐進一步的研究開發(fā)與利用提供了有益的參考。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第41卷[M].北京：科學出版社，1995：346.

[2] 余江琴，陳朋.紫穗槐果實揮發(fā)油提取工藝的動力學模型研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(1)：53-55.

[3] 周美，李閃閃，李瑞，等.紫穗槐藥學研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41(19)：8141-8142，8176.

[4] 張璐敏，呂學維，邵鄰相，等.野艾蒿揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡與壞死[J].中藥材，2013，36(12)：1988-1992.

[5] ALIAKBARLU J，SADAGHIANI S K，MOHAMMADI S.Comparative evaluation of antioxidant and anti food-borne bacterial activities of volatile oils from some spices commonly consumed in Iran[J].Food Sci Biotechnol，2013，22(6)：1487-1493.

[6] 劉志雄，劉祝祥，田啟建.七葉一枝花揮發(fā)油成分及其抑菌活性分析[J].中藥材，2014，37(4)：62-66.

[7] SEOW Y X，YEO C R，CHUNG H L，et al.Plant volatile oils as active antimicrobial agents[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2014，54(5)：625-644.

[8] 劉暢，姜泓，張建逵，等.GC-MS法測定紫穗槐果實揮發(fā)油中的化學成分[J].中華中醫(yī)藥學刊，2008，26(1)：213-214.

[9] 余江琴，陳朋.紫穗槐果實揮發(fā)油提取工藝的動力學模型研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(1)：53-55.

[10] CHEN X，ZHANG Y，ZU Y，et al.Composition and biological activities of the volatile oil fromSchisandrachinensisobtained by solvent-free microwave extraction[J].LWT-Food Sci Technol，2011，44(10)：2047-2052.

[11] KUANG B，HAN J，ZENG G Z，et al.Three new triterpenoids fromRubiaschumanniana[J].Nat Prod Bioprospect，2012，2：166-169.

[12] 周妮，齊錦秋，王燕高，等.楨楠現(xiàn)代木和陰沉木揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析[J].西北農(nóng)林科技大學學報，2015，43(6)：1-6.

[13] WANG D C，SUN S H，SHI L N，et al.Chemical composition，antibacterial and antioxidant activity of the volatile oils ofMetaplexisjaponicaand their antibacterial components[J].Int J Food Sci Technol，2015，50：449-457.

[14] RAUT J S，KARUPPAYIL S M.A status review on the medicinal properties of volatile oils[J].Ind Crop Prod，2014，62：250-264.

[15] 章斌，侯小楨，秦軼，等.檸檬果皮揮發(fā)油的化學組成、抗氧化及抑菌活性研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36(5)：126-131.

摘要[目的]研究新鮮紫穗槐果實揮發(fā)油的化學成分及其抗氧化和細胞毒活性。[方法]水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后，采用GC-MS法檢測其成分組成；采用DPPH和β-胡蘿卜素法檢測揮發(fā)油的抗氧化活性，采用SRB法檢測揮發(fā)油對BGC-823、A-549和HeLa等3種腫瘤細胞株的細胞毒活性。[結果]從揮發(fā)油中共鑒定出40個成分，占揮發(fā)油總量的88.65%，主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-畢澄茄烯(10.24%)、表圓線藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等；紫穗槐果實揮發(fā)油對DPPH自由基清除率的IC50值為18.25 mg/mL，β-胡蘿卜素-亞油酸法檢測1.8 mg/mL紫穗槐果實揮發(fā)油的抑制率為25.08%；對BGC-823、A-549和HeLa等3種腫瘤細胞的細胞毒IC50值分別為37.597、46.733和48.656 μg/mL。[結論]紫穗槐果實揮發(fā)油的抗氧化活性較弱，但具有較好的腫瘤細胞毒活性。

關鍵詞紫穗槐果實；揮發(fā)油；化學成分；抗氧化活性；細胞毒活性

Chemical Composition, Antioxidant and Cytotoxic Activity of the Volatile Oil from FreshAmorphafruticosaFruits

CHEN Xiao-qiang1, 2, LI Jia-na3, GUO Yi-ping3, ZHANG Ying1, 2*(1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. State Engineering Laboratory for Bioresource Eco-Utilization, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 3. College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract[Objective] To study the chemical composition, antioxidant and cytotoxic activity of the volatile oil from freshAmorphafruticosafruits. [Method] The volatile oil was isolated by distillation extraction, the chemical compositions were identified by GC-MS method; the antioxidant activity of the volatile oil was assayed by DPPH radical scavenging method and β-carotene-linoleate inhibition method; cytotoxic activity to three tumor cell lines (BGC-823, A-549 and HeLa) was determined by SRB method. [Result] Forty components were identified from the volatile oil, amounted to 88.65% of the oil, γ-cadinene (19.43%), α-cubebene (10.24%), epizonarene (8.99%) and α-pinene (7.22%) were the main components. TheIC50value of DPPH radical scavenging was 18.25 mg/mL; inhibition ratio of the volatile oil (1.8 mg/mL) was 25.08% in β-carotene-linoleate inhibition method. The cytotoxic activity of the volatile oil to BGC-823, A-549 and HeLa cell lines withIC50value of 37.597, 46.733 and 48.656 μg/mL, respectively. [Conclusion] The volatile oil ofAmorphafruticosafruits has less antioxidant activity, however, it has excellent cytotoxic activity to HeLa cell lines.

Key wordsAmorphafruticosafruits; Volatile oil; Chemical composition; Antioxidant activity; Cytotoxic activity

收稿日期2015-12-10

作者簡介陳小強(1974- )，男，四川鄰水人，副教授，博士，從事天然藥物化學成分及活性研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事資源植物活性成分研究。

基金項目東北林業(yè)大學大學生科研訓練項目“不同采收時間對林生茜草提取物活性的影響”；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(2572015CB18，2572015CB17)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q15009)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(20140470102)。

中圖分類號S 567；R 284.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-159-03