間充質(zhì)干細(xì)胞與白細(xì)胞介素10對(duì)四氯化碳誘發(fā)的肝纖維化大鼠的治療作用①

張英杰　禹　麗　郝曉娜　郝艷梅　李玉云

(蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室， 蚌埠233030)

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間充質(zhì)干細(xì)胞與白細(xì)胞介素10對(duì)四氯化碳誘發(fā)的肝纖維化大鼠的治療作用①

張英杰禹麗郝曉娜郝艷梅李玉云

(蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室， 蚌埠233030)

[摘要]目的：探究人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)方法，通過(guò)對(duì)MSCs與IL-10聯(lián)合治療四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的研究，觀察其協(xié)同效應(yīng)，為臨床治療肝纖維化尋找新方法，并闡明其在肝纖維化治療中的部分機(jī)制。方法：自然貼壁法分離、純化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。50只大鼠隨機(jī)選取5只入選正常對(duì)照組(n=5)，其余45只大鼠采用皮下多點(diǎn)注射CCl4方法制備大鼠肝纖維化模型，造模成功后隨機(jī)分為模型損傷組(n=15)、細(xì)胞移植組(n=15)和聯(lián)合用藥組(n=15)。細(xì)胞移植組在模型制備成功后的第1周、第2周、第3周經(jīng)尾靜脈給予1×106臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療；聯(lián)合治療組在給予細(xì)胞移植組相同的細(xì)胞治療基礎(chǔ)上，給予腹腔內(nèi)注射IL-10(4 μg/kg),每周4次。4周后將大鼠處死，收集各組大鼠血液檢測(cè)肝功能、肝纖維化指標(biāo)；摘取肝臟行蘇木精-伊紅染色，觀察病理變化；RT-PCR法檢測(cè)MMP-2 mRNA表達(dá)情況，Western blot 法檢測(cè)TGF-β蛋白的表達(dá)。結(jié)果：細(xì)胞移植組與聯(lián)合治療組大鼠肝功能、肝纖維化指標(biāo)均明顯改善，與對(duì)照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，且聯(lián)合治療組改善更明顯(P<0.05)；大鼠肝組織蘇木精-伊紅染色提示，細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組肝纖維化程度明顯改善，聯(lián)合治療組肝臟病理更接近于正常；損傷組、細(xì)胞移植組MMP-2 mRNA表達(dá)明顯增高，明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合治療組MMP-2 mRNA表達(dá)增高，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與正常對(duì)照組比較，其他組TGF-β蛋白的表達(dá)都有所增高(P<0.05)，其中損傷組TGF-β蛋白的表達(dá)增高最明顯(P<0.05)，細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組TGF-β蛋白的表達(dá)較損傷組均有不同程度的降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較TGF-β蛋白的表達(dá)也有顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)移植或與IL-10聯(lián)合治療均可以改善肝纖維化大鼠外周血液的生化特性和肝的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，且IL-10聯(lián)合治療效果更佳，這可能是由于間充質(zhì)干細(xì)胞與IL-10可下調(diào)MMP-2 mRNA的表達(dá)，保護(hù)肝小葉結(jié)構(gòu)；抑制TGF-β蛋白的表達(dá)，減少肝星狀細(xì)胞的激活等原因。

肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是由于各種致病因素引起的肝臟損害和炎癥，在組織修復(fù)過(guò)程中導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)代謝失衡，發(fā)生異常增多和過(guò)度沉積的病理過(guò)程[1]，是肝組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，這一階段若得不到有效治療，最終會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至導(dǎo)致患者死亡。目前對(duì)于肝硬化的治療僅限于去除潛在的刺激，用干擾素、病毒唑和拉米呋定等對(duì)病毒性肝炎進(jìn)行抗病毒治療，以及最后的治療手段——肝移植。但是由于移植器官的來(lái)源有限，需要移植的患者數(shù)量眾多，以及由于一些因素的限制并非每個(gè)患者都適于移植，因此迫切需要發(fā)展有效的抗纖維化治療手段。干細(xì)胞移植是目前治療肝功能衰竭的一個(gè)新的研究方向。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能不斷地進(jìn)行自我更新，同時(shí)具有多系橫向分化的潛能，在一定條件下經(jīng)體內(nèi)外生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)可定向分化為肝細(xì)胞，且具備分泌多種可溶性細(xì)胞因子功能，從而刺激內(nèi)源性的實(shí)質(zhì)細(xì)胞增生以支持組織的恢復(fù)[2-5]?？墒?，越來(lái)越多的證據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢到傷肝，但分化為肝細(xì)胞的數(shù)目并不多。這可能是由于已損傷的肝臟微環(huán)境，不利于MSCs生長(zhǎng)，從而影響了其對(duì)受損肝臟的進(jìn)一步修復(fù)功能。近年來(lái)隨著對(duì)肝纖維化形成的分子機(jī)制的深入研究，細(xì)胞因子在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用日益凸顯。IL-10 作為一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，其拮抗肝纖維化的作用已不斷得到證實(shí)。

因此本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地將MSCs和IL-10相結(jié)合，旨在觀察其治療CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的協(xié)同作用，并闡明其在肝纖維化治療中的部分機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性 SD 大鼠50只，3 月齡，體質(zhì)量180~200 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(皖2013-03)，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2臍帶標(biāo)本來(lái)源于蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科足月妊娠分娩胎兒臍帶(臍帶為廢棄物，無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題)。

1.1.3主要試劑DMEM 培養(yǎng)液( Invitrogen 公司)，10%胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(寶泰克生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖液(自制)，四氯化碳液(太原化工廠)，花生油(魯花5S壓榨一級(jí)花生油)，HA和PCIII放射免疫分析試劑盒(上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，Taq酶(MBI Fermentas公司)，TGF-β抗體(Bioworld Technology)。

1.1.4主要儀器超凈工作臺(tái)(SANYO公司)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(YAMATO公司)，相差倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus)等。

1.2方法

1.2.1臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)將在無(wú)菌條件下取得的足月妊娠分娩胎兒臍帶充分洗滌后,剔除臍帶動(dòng)靜脈，刮取Wharton′s Jelly(間質(zhì)組織)層，剪碎成約1 mm3大小的組織塊，用DMEM沖洗，沖洗液接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定細(xì)胞傳至第4代后，用消化液消化細(xì)胞，PBS洗滌2次(1 000 r/min)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34、CD29、CD31的表達(dá)情況)。

1.2.3動(dòng)物模型的制備與分組50只SD 雄性大鼠隨機(jī)選取5只入選正常對(duì)照組，其余45只用于造模，采用40% CCl4花生油溶液(自行配制)腹腔注射法制造慢性肝損傷模型。CCl4花生油溶液的濃度為 40%，劑量為2 ml/kg，每周一和周四腹腔注射40%CCl4花生油溶液，共注射4周，將上述經(jīng) CCl4處理后的大鼠隨機(jī)均分為模型損傷組、細(xì)胞移植組和聯(lián)合用藥組，細(xì)胞移植組(n=15)：造模4周后，分別在第1、8、15天，經(jīng)鼠尾靜脈輸注1×106L-1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1 ml；聯(lián)合治療組(n=15):在給予與細(xì)胞移植組相同的干細(xì)胞治療的情況下，腹腔內(nèi)注射IL-10(4 μg/kg),每周4次。模型對(duì)照組(n=15)：造模4周后，與細(xì)胞移植組在相同時(shí)間等劑量注射生理鹽水。

1.2.4血液標(biāo)本的收集、保存及檢測(cè)正常飲食飼養(yǎng)各組動(dòng)物4周后，4%水合氯醛2 ml腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后，取血行肝功能檢測(cè)：血清白蛋白(ALB)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)；取血行肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)：HA(透明質(zhì)酸酶)和PCⅢ (Ⅲ型前膠原)。

1.2.5肝臟病理學(xué)觀察取動(dòng)物肝臟左葉,體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色鏡檢觀察肝組織病理變化；并按下述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判肝纖維化程度[4]：“-”無(wú)成纖維細(xì)胞增生(0分)；“+”匯管區(qū)擴(kuò)大，有少量成纖維細(xì)胞增生(1分)；“++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生并向小葉內(nèi)延伸，呈較窄較短的纖維素條(2分)；“+++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)明顯延伸，形成纖維隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂(3分)。請(qǐng)病理教研室同一位老師單盲讀片進(jìn)行評(píng)分。

1.2.6MMP-2 mRNA的表達(dá)取-80℃ 冰箱保存的各組肝臟100 mg，置于勻漿器，加入 1.0 ml Trizol液，參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。取3 μl總RNA作為模板,用隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以此cDNA 2 μl為模板,PCR擴(kuò)增,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系終體積為25 μl,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸45 s,36個(gè)循環(huán)后72℃ 平衡7 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Smartview圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.7Western blot法檢測(cè)TGF-β蛋白的表達(dá)分別取各組50 mg肝組織，加入1 ml蛋白裂解液裂解30 min，再經(jīng)4℃、12 000 r/min離心10 min,取上清，BCA法蛋白定量。加入上樣緩沖液，煮沸5 min。每孔加入20 μl總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(8%分離膠,5%濃縮膠)電泳,電壓90 V,待溴酚藍(lán)電泳達(dá)凝膠底部時(shí)將凝膠中的蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上。采用麗春紅s染膜、考馬斯亮藍(lán)染膠,通過(guò)與蛋白Marker比較,確定目的條帶位置。再將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中,室溫下?lián)u床輕搖2 h進(jìn)行封閉。加入大鼠抗TGF-β單抗，4℃孵育過(guò)夜繼以相匹配的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育1 h,TBST充分洗膜。ECL顯色,暗室曝光,凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

表1RT-PCR引物

Tab.1Primer of RT-PCR

PrimernameNucleotidesequencesProductlength(bp)MMP-2GTCCTGACCAAGGATATAGCC465AGACCCAGTACTCATTCCCTGβ-actinTCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT285CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用P表示，用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組樣本間比較采用單因素方差分析方法,組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以α=0.05 水準(zhǔn)，P<0.05 為差異具有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)組織塊貼壁后1周可見(jiàn)散在分布、貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞集落。細(xì)胞多為雙突起的長(zhǎng)梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞；14 d時(shí)細(xì)胞貼滿瓶底，此時(shí)呈魚(yú)群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列(圖1)。傳代后細(xì)胞增殖迅速，一般2~3 d可傳1代。

2.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定選取狀態(tài)較穩(wěn)定的第4代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)整合素黏附分子CD29(97.32±2.77)%，而造血干細(xì)胞的標(biāo)記C34表達(dá)率僅為(1.01±0.56)%，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31僅為(2.47±0.54)%，見(jiàn)圖2。圖2可見(jiàn)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)整合素黏附分子CD29，而造血細(xì)胞的標(biāo)記C34和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31少見(jiàn)表達(dá)，符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)。

圖1　實(shí)驗(yàn)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞Fig.1　Umbilical cord-mesenchymal stem cellsNote: A.Primary cultured Mesenchymal stem cells(×400);B.The fourth generation of cultured Mesenchymal stem cells(×400).

圖2　分離的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型Fig.2　Immunology phenotype of umbilical cord-mesen-chymal stem cells

2.3血清肝功能生化ALT、ALB結(jié)果的比較臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植4周后，將全部大鼠處死，收集血液，檢測(cè)血清ALT、ALB變化，并與正常對(duì)照組大鼠血清ALT、ALB進(jìn)行比較(表2)。結(jié)果顯示，模型損傷、細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組與正常對(duì)照組比較，血清ALT、ALB均有不同程度增高，結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)，提示肝損傷仍然存在；細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組與模型損傷組比較ALT、ALB明顯降低，且有顯著性差異(P<0.05)，提示與模型損傷組比較肝功能有明顯恢復(fù)；聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較ALT、ALB也有顯著降低(P<0.05)，提示聯(lián)合治療組肝功能恢復(fù)更佳。

2.4血清肝纖維化指標(biāo)HA和PCⅢ的檢測(cè)將全部處死大鼠的血清進(jìn)行HA和PCⅢ的檢測(cè)，并與正常對(duì)照組大鼠血清HA、PCⅢ進(jìn)行比較(表3)。

結(jié)果顯示，模型損傷、細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組與正常對(duì)照組比較，血清HA和PCⅢ均有不同程度增高，結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)，提示肝纖維化仍然存在；細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組與模型損傷組比較HA和PCⅢ明顯降低，且有顯著性差異(P<0.05)，提示與模型損傷組比較肝纖維化有明顯恢復(fù)；聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較HA和PCⅢ也有顯著降低(P<0.05)，提示聯(lián)合治療組肝纖維化恢復(fù)更佳。

GroupsALT(U/L)ALB(g/L)Controlgroup28.58±8.2135.25±1.25Modelgroup256.32±16.581)22.77±1.321)MSCstransplantinggroup94.47±10.621)2)27.13±1.111)2)Combinationtherapygroup45.47±9.521)2)3)30.34±1.121)2)3)

Note：Compared with control groups，1)P<0.05;compared with model group，2)P<0.05;compared with MSCs transplanting group，3)P<0.05.

GroupsHA(ng/ml)PCⅢ(μg/L)Controlgroup167.76±31.5622.25±9.38Modelgroup345.32±56.771)54.43±11.421)MSCstransplantinggroup264.46±40.121)2)35.76±10.321)2)Combinationtherapygroup201.47±29.441)2)3)29.32±8.671)2)3)

Note：Compared with control groups,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with MSCs transplanting group,3)P<0.05.

2.5蘇木精-伊紅染色法觀察病理變化模型損傷組肝鎖嚴(yán)重紊亂，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生(圖3B)；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組肝鎖紊亂，成纖維細(xì)胞增生不明顯(圖3C)；聯(lián)合治療組肝小葉肝細(xì)胞排列整齊，小葉結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)(圖3D)。病理結(jié)果提示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組明顯好于模型損傷組，聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較，聯(lián)合治療效果更佳。

2.6臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝纖維化程度的影響請(qǐng)病理教研室同一位老師單盲讀片對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)分(表4)，結(jié)果顯示細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組與模型損傷組大鼠比較損傷程度明顯好轉(zhuǎn)，且聯(lián)合治療組比細(xì)胞移植組恢復(fù)程度更佳，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.7RT-PCR法檢測(cè)MMP-2 mRNA的表達(dá)如表5與圖4所示，正常對(duì)照組MMP-2 mRNA表達(dá)極低，損傷組、細(xì)胞移植組MMP-2 mRNA明顯增高，明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合治療組MMP-2 mRNA表達(dá)增高，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3　蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肝纖維化病理變化(×400)Fig.3　Pathological changes of hepatic fibrosis in rats(HE staining，×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.MSCs transplanting group;D.Combination therapy group.

表4肝纖維化程度評(píng)分

Tab.4Score of liver fibrosis

Modelgroup(n=15)MSCstransplantinggroup(n=15)Combinationtherapygroup(n=15)0point0001point01132point41223point1120Means(Score)2.732.071)1.131)2)

Note：Compared with model group,1)P<0.05;compared with MSCs transplanting group,2)P<0.05.

表5大鼠肝組織MMP-2 mRNA變化

Tab.5Changes of MMP-2 mRNA in liver tissue of rats

GroupsMMP-2(%)Controlgroup(n=5)9.1±1.2Modelgroup(n=15)20.2±2.21)MSCstransplantinggroup(n=15)12.1±1.21)Combinationtherapygroup(n=15)10.4±1.52)

Note：Compared with control groups,1)P<0.05,2)P>0.05.

圖4　大鼠肝組織MMP-2 mRNA變化Fig.4　Changes of MMP-2 mRNA in liver tissue of ratsNote: 1.Control group;2.Combination therapy group;3.MSCs transplanting group;4.Model group.

圖5　大鼠肝組織TGF-β蛋白變化Fig.5　Changes of TGF-β mRNA in liver tissue of ratsNote: 1.Control group;2.Model group;3.MSCs transplanting group;4.Combination therapy group.

2.8Western blot法檢測(cè)TGF-β蛋白的表達(dá)如圖5與表6所示，與正常對(duì)照組比較，損傷組TGF-β蛋白的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組TGF-β蛋白的表達(dá)較損傷組均有不同程度的降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較TGF-β蛋白的表達(dá)也有顯著降低(P<0.05)。

3討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是干細(xì)胞的一種類型，具備干細(xì)胞的重要特征，即很強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能。且人MSCs具有低免疫原性，不表達(dá)MHCⅡ類分子和B7等共刺激分子，具有免疫赦免特性，即可在相同或不同種屬間移植，而不發(fā)生移植排斥反應(yīng)。且臍帶為廢棄物，細(xì)胞來(lái)源不涉及社會(huì)和倫理學(xué)等方面的爭(zhēng)議，這使其在近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究中倍受關(guān)注。近年來(lái)，MSCs對(duì)肝纖維化治療作用的研究不斷深入，國(guó)內(nèi)外研究證明來(lái)自其他組織的干細(xì)胞能夠歸巢到肝臟，并可能參與肝組織的再生[1-5]，且具備分泌多種可溶性細(xì)胞因子功能，從而刺激內(nèi)源性的實(shí)質(zhì)細(xì)胞增生以支持組織的恢復(fù)[6，7]。在MSCs移植治療肝纖維化模型中人們發(fā)現(xiàn)MSCs移植可以減輕肝纖維化并恢復(fù)枯竭的肝功能[8-10]。可是，越來(lái)越多的證據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢到傷肝，但無(wú)法分化成肝細(xì)胞[11，12]，這與我們之前的研究結(jié)果可分化為肝細(xì)胞但數(shù)目并不多相一致。這可能是由于已損傷的肝臟微環(huán)境，不利于MSCs生長(zhǎng)，從而影響了其對(duì)受損肝臟的進(jìn)一步修復(fù)功能。

表6大鼠肝組織TGF-β蛋白變化

Tab.6Changes of TGF-β protein in liver tissue of rats

GroupsTGF-β(%)Controlgroup(n=5)12.4±2.2Modelgroup(n=15)59.1±10.11)MSCstransplantinggroup(n=15)35.8±7.81)2)Combinationtherapygroup(n=15)20.3±4.41)2)3)

Note：Compared with control groups,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with MSCs transplanting group,3)P<0.05.

IL-10 作為一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，其拮抗肝纖維化的作用已不斷得到證實(shí)[13,14]，IL-10可通過(guò)以下幾個(gè)方面起到抗纖維化的作用：首先，抑制肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)的激活，這可能與其可下調(diào)炎癥細(xì)胞免疫反應(yīng)及TGF-β、TNF-α和TIMPs等這些HSCs的刺激因子有關(guān)，從而減輕肝臟纖維化程度[15,16]；其次，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成及促進(jìn)其降解[17，18]，亦顯示出 IL-10 抗肝纖維化的作用。因此本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地將IL-10與MSCs相結(jié)合，觀察其對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型治療的協(xié)同效應(yīng)。研究結(jié)果顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)或與IL-10聯(lián)合均可明顯改善CCl4導(dǎo)致的大鼠肝纖維化，這主要體現(xiàn)在組織病理明顯改善，且與IL-10聯(lián)合治療組大鼠肝臟更接近與正常肝組織；肝功能檢測(cè)、肝纖維化指標(biāo)都有明顯好轉(zhuǎn)，且與IL-10聯(lián)合治療效果更佳。

肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是多種致病因子作用于反細(xì)胞引起肝細(xì)胞變性壞死后的共同病理基礎(chǔ)，是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與分解失衡，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的結(jié)果。眾多的研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞的激活是HF的中心環(huán)節(jié)[19-21]。肝臟細(xì)胞受到各種損傷因子的刺激，Kupffer 細(xì)胞、肝細(xì)胞等釋放 PDGF 及 TGF-β等多種細(xì)胞因子激活 HSC，激活的 HSCs合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)，并抑制膠原降解。

TGF-β是眾多細(xì)胞因子中致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，TGF-β主要通過(guò)自分泌和旁分泌方式參與HSCs的活化，從而造成ECM的沉積，因此肝組織中TGF-β蛋白的表達(dá)可反映慢性肝纖維化中組織炎癥壞死及纖維化程度。因此，本實(shí)驗(yàn)將TGF-β蛋白的表達(dá)作為考量MSCs和IL-10抗纖維化作用的分子指標(biāo)之一。研究結(jié)果顯示，細(xì)胞移植組、聯(lián)合治療組TGF-β蛋白的表達(dá)較損傷組均有不同程度的降低，聯(lián)合治療組與細(xì)胞移植組比較TGF-β蛋白的表達(dá)也有顯著降低。說(shuō)明MSCs和IL-10聯(lián)合治療更能阻礙HSCs的活化，減少ECM的沉積，抗纖維化效果更佳。

MMP-2 是明膠酶類的代表，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性蛋白、纖維連接蛋白。Ⅳ型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成份，MMP-2 合成增多、活性增強(qiáng)，可降解 Disse 間隙的基底膜，破壞肝小葉的正常結(jié)構(gòu)，并且激活竇周細(xì)胞，包括HSC，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。因此本實(shí)驗(yàn)將MMP-2作為考量MSCs和IL-10抗纖維化作用的另一個(gè)分子指標(biāo)。結(jié)果顯示損傷組、細(xì)胞移植組MMP-2 mRNA明顯增高，明顯高于正常對(duì)照組，聯(lián)合治療組MMP-2 mRNA表達(dá)增高，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。提示聯(lián)合治療可通過(guò)下調(diào)MMP-2基因的表達(dá)保護(hù)肝小葉的正常結(jié)構(gòu)。

綜上所述,IL-10聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞移植可在一定程度上修復(fù)受損的肝組織，這為眾多肝纖維化甚至肝硬化患者帶來(lái)了希望。但其逆轉(zhuǎn)肝纖維化的分子機(jī)制很多，一些尚不完全清楚，另外，要獲取間充質(zhì)干細(xì)胞移植的長(zhǎng)期生存率、長(zhǎng)期不良反應(yīng)等信息都有待今后開(kāi)展大規(guī)模臨床雙盲試驗(yàn)。但我們相信隨著這些難題的解決細(xì)胞因子聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞移植有望成為治療肝纖維化的理想方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]牛鐵兵,陳玉丙,張立新.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肝纖維化模型的修復(fù)作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,35(5):874-877.

[2]Kadota Y,Yagi H,Inomata K,etal.Mesenchymal stem cells support hepatocyte function in engineered liver grafts[J].Organogenesis,2014,10(2):268-277.

[3]Nagaishi K,Ataka K,Echizen E,etal.Mesenchymal stem cell therapy ameliorates diabetic hepatocyte damage in mice by inhibiting infiltration of bone marrow-derived cells[J].Hepatology,2014，59(5)：1816-1829.

[4]Esrefoglu M.Role of stem cells in repair of liver injury:experimental and clinical benefit of transferred stem cells on liver failure[J].World J Gastroenterol,2013,19(40):6757-6773.

[5]Salomone F,Barbagallo I,Puzzo L,etal.Efficacy of adipose tissue-mesenchymal stem cell transplantation in rats with aceta minophen liver injury[J].Stem Cell Res,2013,11(3):1037-1044.

[6]Caplan AI,Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators[J].J Cell Biochem,2006,98(5):1076-1084.

[7]Parekkadan B,van Poll D,Suganuma K,etal.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse ful minant hepatic failure[J].PLoS One,2007,2(9):e941.

[8]Sakaida I,Terai S,Yamamoto N,etal.Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice[J].Hepatology,2004,40(6):1304-1311.

[9]Cho KA,Lim GW,Joo SY,etal.Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice[J].Liver int,2011,31(7):932-939.

[10]Fang B,Shi M,Liao L,etal.Systemic infusion of FLK1+ mesenchymal stem cells ameliorates carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice[J].Transplantation,2004,78(1):83-88.

[11]Popp FC,Slowik P,Eggenhofer E,etal.No contribution of multipotent mesenchymal stromal cells to liver regeneration in a rat model of prolonged hepatic injury[J].Stem Cells，2007,25(3):639-645.

[12]Di Bonzo LV,Ferrero I,Cravanzola C,etal.Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine:engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential[J].Gut，2008,57(2):223-231.

[13]涂云忠，張堅(jiān)，劉慧萍，等.白細(xì)胞介素10基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制大鼠肝纖維化形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝臟病雜志，2012,20(12)：908-911.

[14]Chen YX,Huang YH,Zheng WD,etal.Interleukin-10 gene modification attenuates hepatocyte activation of rat hepatic stellate cells in vitro[J].Mol Med Rep,2013,7(2):371-378.

[15]王小眾,張莉娟.IL-10抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及臨床現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志,2007,15(23):2469-2472.

[16]吳玉婧，郭津律.肝星狀細(xì)胞、Toll樣受體4信號(hào)途徑、炎癥及纖維化環(huán)境與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J].臨床肝膽病雜志,2015,31(6)：876-879.

[17]Seki E,Brenner DA.Recent advancement of molecular mechanisms of liver fibrosis[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2015,22(7):512-518.

[18]Zhang LJ,Yu JP,Li D,etal.Effects of cytokines on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrogenesis in rats[J].World J Gastroenterol,2004,10(1):77-81.

[19]Friedman SL,Roll FJ,Boyles J,etal.Hepatic lipocytes;the principal collagen-producing cells of normal rat liver[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82(24):8681-8685.

[20]Weiskirchen R,Tacke F.Cellular and molecular functions of hepatic stellate cells in inflammatory responses and liver immunology[J].Hepatobiliary Surg Nutr，2014,3(6):344-363.

[21]Brandau DF,Ramalhu LN,Ramalho FS,etal. Liver cirrhosis and hepatic stellate cells[J].Acta Cir Bras,2006,21(1):54-57.

[收稿2015-05-25修回2015-07-07]

(編輯倪鵬)

[關(guān)鍵詞]臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞；白細(xì)胞介素10；肝纖維化；細(xì)胞移植

Treatment of experimental hepatic fibrosis in rats by transplanting with mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord and Interleukin-10

ZHANGYing-Jie,YULi，HAOXiao-Na,HAOYan-Mei，LIYu-Yun.LaboratoryDepartmentofBengbuMedicalCollege,Bengbu233030,China

[Abstract]Objective:To observe the conditions of isolation,purification and culture of mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro derived from human umbilical cord,and to observe the repairing effect on experimental hepatic fibrosis in rats by transplantation with MSCs only or MSCs with IL-10.Methods: The MSCs derived from human umbilical cord were isolated,purified and cultivated in vitro.The model of hepatic fibrosis induced by CCl4was established.After the model of hepatic fibrosis was succeeded,the rats were divided into three groups:model group,MSCs transplantation group,MSCs transplantation with IL-10 group.MSCs transplantation group was given 1×106MSCs by the tail vein injection at the first 1 weeks,2 weeks and 3 weeks.MSCs transplantation with IL-10 group not only was given MSCs the same with MSCs transplantation group,but also was injected of IL-10(4 μg/kg)in abdomen,4 times a week.After 4 weeks,the rats were executed,rats blood was collected to observe the changes of liver function and the index of liver fibrosis.The liver HE staining was carried out to observe the changes of liver pathology.Expression of MMP-2 mRNA was detected by RT-PCR method,expression of TGF-β protein was detected by Western blot method.Results: The rat liver function and the index of liver fibrosis improved obviously with a significant difference between model group ,MSCs transplantation group and MSCs transplantation with IL-10 group after transplanting,MSCs with IL-10 was better than MSCs only.Liver tissue of rats with hematoxylin eosin staining suggested,liver fibrosis was obviously improved,and the MSCs transplantation with IL-10 group was best.MMP-2 mRNA expression was significantly higher between normal group and model group,MSCs transplantation group with a significant difference (P<0.05),MMP-2 mRNA expression was higher with a no significant difference between model group and MSCs transplantation with IL-10 group(P>0.05).TGF-β protein expression of other groups was higher than normal group with a significant (P<0.05),and MSCs transplantation with IL-10 group was the largest decrease than normal group.Conclusion: MSCs only or MSCs with IL-10 transplantation can improve the biochemical characteristics of rat peripheral blood and liver histological structure,and with IL-10 wan better than MSCs only.MSCs and IL-10 play a role in the treatment of liver fibrosis through lowering the expression of MMP-2 and the expression of TGF-β protein.

[Key words]Mesenchymal stem cells;IL-10;Hepatic fibrosis;Transplantation

通訊作者及指導(dǎo)教師：李玉云(1964年-)，女，副教授，主要從事間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究。

作者簡(jiǎn)介：張英杰(1979年-)，男，碩士，講師，主要從事間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究。

中圖分類號(hào)R318
①本文受安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.KJ2012A198)基金資助。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0023-06

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.005