P53抑制劑和微管抑制劑對(duì)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

張育華　黃文暉　莫菊彩

(臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院皮膚科，臺(tái)州317502)

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P53抑制劑和微管抑制劑對(duì)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

張育華黃文暉①莫菊彩②

(臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院皮膚科，臺(tái)州317502)

[摘要]目的：探討P53抑制劑和微管抑制劑對(duì)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體(GR)核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。方法：分離和培養(yǎng)銀屑病患者和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，分別與P53抑制劑和微管蛋白抑制劑共培養(yǎng)，加或不加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，間接免疫熒光法檢測(cè)上述因素對(duì)GR核轉(zhuǎn)位的影響。結(jié)果：VEGF可誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生核轉(zhuǎn)位；P53抑制劑抑制了VEGF誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)位。與VEGF共培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)位評(píng)分顯著低于單純角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；微管抑制劑可完全將正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的GR滯留在胞漿中，在加入VEGF后，與單純微管抑制劑組比較，胞漿中GR并沒有明顯增多；而微管抑制劑和P53抑制劑共培養(yǎng)，會(huì)有少量GR進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞的胞核中。結(jié)論：微管介導(dǎo)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞GR的核攝取，P53參與了 GR的核輸出。

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，常常伴有冠心病、高血壓、代謝綜合征等系統(tǒng)性疾病[1]，需積極治療以改善患者的預(yù)后。糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎作用，為治療銀屑病的最常用藥物，雖可有效改善皮損，但停藥后容易反彈[2]，故加強(qiáng)對(duì)糖皮質(zhì)激素治療銀屑病機(jī)制的研究十分重要。糖皮質(zhì)激素發(fā)揮其抗炎作用，需糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)的參與，研究發(fā)現(xiàn)GR能夠在細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間穿梭，但糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎作用則需要GR轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor)可誘導(dǎo)正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的GR從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿中[4]，但是VEGF不能誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞核內(nèi)GR轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中。HaCaT細(xì)胞與正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞最大的不同在于HaCaT細(xì)胞的P53等位基因均發(fā)生了突變[5]，提示P53蛋白可能參與了 GR的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。微管是一種具有極性的細(xì)胞骨架，具有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)穆奋壸饔?，可影響?xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[6]，故推測(cè)微管可能參與了GR的核轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，本研究探討P53抑制劑和微管抑制劑對(duì)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞GR核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為進(jìn)一步了解GR核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響因素，為研制治療銀屑病的新藥物提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑微管抑制劑、P53抑制劑、碘化丙啶、FITC標(biāo)記購至美國Sigma公司，VEGF購至美國Pepro Tech公司。

1.1.2儀器CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)器械購自美國Falcon公司，奧林巴斯熒光顯微鏡購自北京中儀光科科技發(fā)展有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本收集在患者知情同意下，標(biāo)本取自慢性斑塊型銀屑病患者皮損區(qū)皮膚。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①重度斑塊型銀屑?。虎阢y屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)≥10分；③取標(biāo)本前1個(gè)月未曾使用過任何藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：心臟、腦、肝、腎、造血系統(tǒng)異常；②合并腫瘤性疾病。共30例銀屑病患者，其中男9例，女21例；年齡(42.65±14.43)歲。正常對(duì)照組皮膚取自整形外科健康成人，共30例，其中男6例，女24例，年齡(42.43±14.36)歲。銀屑病患者與正常對(duì)照組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所取標(biāo)本分為兩部分，一部分立即置于0.5% dispase分離酶中，4 ℃孵育過夜；另一部分保存在-80℃冰箱中用于免疫熒光檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作臺(tái)內(nèi)分離0.5%分離酶中4 ℃孵育過夜的表皮和真皮，將分離下的表皮置于0.25% 的胰酶中，37℃，10 min。然后用10% 的胎牛血清輕輕吹打表皮,以200目濾網(wǎng)過濾角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，1 000 r/min,離心5 min。然后,棄上清,加入defined KSFM,將細(xì)胞種植于37℃的5% CO2孵育箱中培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)使用第2~3代的細(xì)胞。

1.2.3免疫熒光將經(jīng)冷凍切片機(jī)切好的4 μm切片轉(zhuǎn)移到預(yù)先處理的蓋玻片表面，用4%多聚甲醛室溫固定組織切片20 min，PBS洗3次，加入10 mmol/L枸櫞酸納緩沖液95℃，加熱20 min，PBS洗3次，加入10%胎牛血清室溫封閉1 h，加兔抗人GR抗體(1∶200)4℃過夜。PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶50)避光下室溫孵育2 h。PBS洗3次，碘化丙啶復(fù)染10 min，封片，在熒光顯微鏡下觀察并評(píng)分。

1.2.4核轉(zhuǎn)位評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在熒光顯微鏡下選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行評(píng)分。核內(nèi)熒光顯著弱于胞漿內(nèi)熒光為0分；核內(nèi)熒光弱于胞漿內(nèi)熒光為1 分；核內(nèi)熒光與胞漿內(nèi)熒光相當(dāng)為2 分；核內(nèi)熒光強(qiáng)于胞漿內(nèi)熒光為3 分；核內(nèi)熒光顯著強(qiáng)于胞漿內(nèi)熒光為4 分。最后以5個(gè)視野的平均分作為最后得分。

1.2.5P53和微管蛋白抑制劑對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的影響正常和銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與P53和微管蛋白抑制劑孵育24 h，加或不加VEGF，固定細(xì)胞后用于免疫熒光檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1P53抑制劑對(duì)VEGF誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)位的影響如圖1所示，VEGF誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生核轉(zhuǎn)位(A)；VEGF不能抑制HaCaT細(xì)胞的GR核轉(zhuǎn)位(B)；P53抑制劑抑制了VEGF誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)位(C)。與VEGF共培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)位評(píng)分顯著低于單純角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與VEGF共培養(yǎng)的 HaCaT細(xì)胞和P53抑制劑預(yù)處理的角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)位評(píng)分與單純HaCaT細(xì)胞和P53抑制劑預(yù)處理的角質(zhì)形成細(xì)胞的核轉(zhuǎn)位評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2微管抑制劑對(duì)GR核攝取的影響微管抑制劑可完全將正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的GR滯留在胞漿中，在加入VEGF后，與單純微管抑制劑組比較，胞漿中GR并沒有明顯增多；而微管抑制劑和P53抑制劑共培養(yǎng)，會(huì)有少量GR進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞的胞核中，見圖2。

圖1　P53抑制劑對(duì)VEGF誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)位的影響Fig.1　Effect of P53 inhibitors on nuclear export of glucocorticoid receptor

表1各組別的核轉(zhuǎn)位評(píng)分比較

Tab.1Comparison of nuclear translocation score of each group

GroupsControlVEGFKeratinocytes3.96±0.240.51±0.061)HaCaTcells3.89±0.223.84±0.25Keratinocytes+P53inhibitors3.67±0.193.63±0.17

Note：Compare with the control group,1)P<0.05.

圖2　微管抑制劑對(duì)GR核攝取的影響Fig.2　Effect of microtubule inhibitors on nuclear uptake of glucocorticoid receptor

3討論

近年來，雖然有很多治療銀屑病的新藥問世，但糖皮質(zhì)激素由于其較強(qiáng)的抗炎作用，仍為治療銀屑病的一線用藥。目前研究已經(jīng)認(rèn)識(shí)到糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用必須有GR的參與，GR從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核才能使糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用[3]。因此，研究銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞GR轉(zhuǎn)運(yùn)的影響因素具有重要意義，有利于開發(fā)治療銀屑病的新藥。

本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生核轉(zhuǎn)位，但卻不能抑制HaCaT細(xì)胞的GR核轉(zhuǎn)位，這與既往研究結(jié)果相似[4]。HaCaT細(xì)胞與正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞最大的不同在于HaCaT細(xì)胞的P53等位基因均發(fā)生了突變[5]，提示P53蛋白可能參與了 GR的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。本研究進(jìn)一步對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞與P53抑制劑共培養(yǎng)，提示VEGF卻不能誘導(dǎo)GR的核轉(zhuǎn)位，證明P53影響銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞GR核轉(zhuǎn)運(yùn)。

微管是一種具有極性的細(xì)胞骨架，具有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)穆奋壸饔?，可影響?xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[6]，然而，微管在活化GR核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用尚存在爭(zhēng)議[7]。雖然有研究提示微管在活化GR核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用[8]，胞漿中GR是沿著細(xì)胞骨架通道運(yùn)動(dòng)的,與微管結(jié)合形成異多聚復(fù)合物。但是，在HeLa細(xì)胞和大鼠的胸腺細(xì)胞中,微管或微絲的破壞并不足以誘導(dǎo)未結(jié)合受體的核運(yùn)輸,更不能破壞已結(jié)合配體受體的核運(yùn)輸[9]。本研究結(jié)果顯示，微管功能的破壞足以導(dǎo)致正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的GR滯留在胞漿中。在微管抑制預(yù)處理的角質(zhì)形成細(xì)胞中,GR不能在胞漿和胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭，提示微管抑制劑破壞了正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中GR的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),并抑制了GR的核攝取。微管蛋白與GR的動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)于GR從胞漿中運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞核內(nèi)至關(guān)重要。因此，本研究為從微管角度研究治療銀屑病的藥物提供了理論依據(jù)。然而，本研究尚未探討加入糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞GR核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，仍需進(jìn)一步深入研究。

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[收稿2015-03-20修回2015-06-25]

(編輯倪鵬)

[關(guān)鍵詞]銀屑??；糖皮質(zhì)激素受體；P53抑制劑；微管抑制劑

Effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes

ZHANGYu-Hua,HUANGWen-Hui,MOJu-Cai.DepartmentofDermatology,TumorHospitalofTaizhou,Taizhou317502,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes.Methods: Isolate and culture psoriatic and normal epidermal keratinocytes.The keratinocytes were incubated with P53 inhibitors and microtubule inhibitors with or without vascular endothelial growth factor(VEGF),and then detected the distribution of GR by indirect immunofluorescence.Results: VEGF induced nuclear translocation of GR in normal keratinocytes,and the P53 inhibitor restrained VEGF induced nuclear export of GR in normal keratinocytes.The nuclear translocation score of the keratinocytes cultured with VEGF was significantly lower than that of keratinocytes cultured without VEGF(P<0.05).The microtubule inhibitors could completely detained GR of normal epidermal keratinocytes in the cytoplasm,and there′s no significantly increased of the level of GR in the cytoplasm after putting VEGF into the normal epidermal keratinocytes.While the microtubule inhibitors and P53 inhibitors co-cultured,there will be a small amount of GR into the keratinocyte nuclei.Conclusion: Microtubule mediated uptake of GR,P53 participated nuclear export of GR.

[Key words]Psoriasis;Glucocorticoid receptor;P53 inhibitor;Microtubule inhibitors

作者簡(jiǎn)介：張育華(1978年- )，男，副主任醫(yī)師，主要從事皮膚科臨床工作，E-mail：zhangyuhuaedu@126.com。

中圖分類號(hào)R758.63
①臺(tái)州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，臺(tái)州317500。
②臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院藥劑科，臺(tái)州317502。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0101-03

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.022