清熱化濕法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能影響的研究

黃海蕾，顧　勤

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029)

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清熱化濕法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能影響的研究

黃海蕾，顧勤

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029)

[關(guān)鍵詞]潰瘍性結(jié)腸炎；免疫功能；清熱化濕法

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎性疾病，主要臨床表現(xiàn)是黏液膿血便、腹痛腹瀉或伴里急后重。與中醫(yī)古代文獻(xiàn)中“赤沃”“鶩溏”“腸澼”等相似。本病是一種慢性、反復(fù)性的胃腸道疾病，在歐洲及北美相當(dāng)常見，近來發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，被WHO列為難治病之一，免疫異常被普遍認(rèn)為在UC的發(fā)病過程中具有極其重要的作用,是當(dāng)前關(guān)于發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥對(duì)本病治療有特色，清熱化濕法較為常見。本文擬對(duì)目前清熱化濕法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能影響綜述如下。

1潰瘍性結(jié)腸炎與免疫功能的關(guān)系

UC發(fā)病是多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的結(jié)果，環(huán)境因素、遺傳因素、免疫因素、感染因素、飲食因素及腸道菌群等與本病發(fā)病有關(guān)，其中免疫因素是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。深入研究免疫因素對(duì)UC的診治具有一定的臨床意義。

UC患者血清中可檢測到多種自身抗體，邱潔英等[1]對(duì)46例UC患者進(jìn)行抗體檢測發(fā)現(xiàn)69.6%的UC患者抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)陽性，19.6%的UC患者抗PR3抗體陽性。謝文等[2]對(duì)此也做了相關(guān)研究，他們將實(shí)驗(yàn)人群分為UC組、腸道疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組，分別對(duì)其進(jìn)行了血清核周型抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(P-ANCA)、抗小腸杯狀細(xì)胞抗體(GAB)檢測，結(jié)果示P-ANCA陽性率分別為59.3%，8.3%，0；UC患者GAB陽性率22.3%，其余2組均未檢測到GAB。若兩者聯(lián)合檢測，UC組的陽性率則為64.8%。榮英蕊等[3]用中藥泄?jié)峤舛痉街委烾C大鼠效果顯著，通過實(shí)驗(yàn)觀察，中藥組干預(yù)的大鼠血清免疫球蛋白IgA、IgG與對(duì)照組相比明顯降低，結(jié)合前人的研究，由此推測其治療機(jī)制可能與降低IgA、IgG水平，減少結(jié)腸組織細(xì)胞間ICAM-1表達(dá)相關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)了免疫反應(yīng)，修復(fù)受損的腸黏膜，促使?jié)冇?。親環(huán)素A(CyP A)是一類與免疫抑制劑環(huán)孢素A(CsA)有高親和力的蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性，在細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用。缺少親環(huán)素會(huì)致蛋白質(zhì)再折疊緩慢，若在蛋白折疊的過程中發(fā)生錯(cuò)誤，就可誘發(fā)異常蛋白，可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫疾病[4]。張建武等[5]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期潰瘍患者血漿及淋巴細(xì)胞內(nèi)CyP A水平明顯高于緩解期患者及健康體檢者，提示胞外CyP A可能通過某種機(jī)制參與誘導(dǎo)UC活動(dòng)。與此同時(shí)，活動(dòng)期UC患者抗CyP A抗體陽性率也顯著高于健康體檢者和緩解期UC患者,考慮抗CyP A抗體的產(chǎn)生可能與CyP A水平升高有關(guān)。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者的病灶腸黏膜中可見大量的細(xì)胞浸潤，主要有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞等?；顒?dòng)期UC患者存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫功能紊亂，當(dāng)機(jī)體受到外來抗原刺激后，機(jī)體先天固有的免疫防御系統(tǒng)被激活，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，引起局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),介導(dǎo)組織病理性損傷。據(jù)相關(guān)學(xué)者研究，致使UC發(fā)生的主要促炎癥細(xì)胞因子有IL-1、IL-6、IL-8和TNF等，而IL-4、IL-10等為主要的抗炎因子，正是因?yàn)樗鼈冮g的平衡，才能維持著腸道免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作，反之則可影響UC的發(fā)生與發(fā)展[6]。T細(xì)胞介導(dǎo)著細(xì)胞免疫，根據(jù)其表面標(biāo)志及功能特點(diǎn)，可分為不同的T細(xì)胞類別及其亞群。而CD4和CD8皆屬于T淋巴細(xì)胞，正常情況下,兩者保持一定比例, 維持機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。郁敏敏等[7]實(shí)驗(yàn)觀察活動(dòng)期UC的CD4/CD8比值較正常增高，CD8細(xì)胞數(shù)量下降，考慮CD4細(xì)胞與CD8細(xì)胞比例失衡,誘發(fā)免疫反應(yīng)增強(qiáng)，致細(xì)胞損傷或炎癥反應(yīng)持久存在。CD4+T細(xì)胞又可分為Th1和Th2兩種T細(xì)胞，他們?cè)诿庖叻磻?yīng)中發(fā)揮了重要的效應(yīng)，Th1/Th2比例失衡在UC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[8]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一類不同于Th1和Th2的相對(duì)獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞亞群，是一群具有免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制作用的T細(xì)胞群，對(duì)機(jī)體維持自身免疫耐受、抑制自身免疫性疾病有重要作用。近年來研究亦發(fā)現(xiàn)UC活動(dòng)期患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少，腸黏膜CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加。由此推斷CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在UC的發(fā)病機(jī)制的重要影響[9]。此外，正常的腸黏膜T細(xì)胞在參與免疫反應(yīng)后會(huì)立即凋亡，當(dāng)機(jī)體缺乏免疫耐受時(shí)，T細(xì)胞不能及時(shí)凋亡清除，則會(huì)異常聚集，引起UC慢性腸道黏膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。

2清熱化濕法對(duì)濕熱型潰結(jié)的免疫干預(yù)作用

芍藥湯、白頭翁湯、黃芩湯是治療濕熱型潰結(jié)常用的經(jīng)典方。筆者將重點(diǎn)概述這些經(jīng)典方的相關(guān)研究。

2.1芍藥湯芍藥湯出自《素問·病機(jī)氣宜保命集》,為公認(rèn)的濕熱痢專方，方中芍藥和營緩急止痛；黃芩、黃連清化濕熱；大黃瀉腸中之濕熱，祛積破瘀；當(dāng)歸柔肝和血，合芍藥以治下痢膿血；木香、檳榔消導(dǎo)調(diào)氣；肉桂辛熱，配在苦寒藥中可防止苦寒傷中與冰伏濕熱之邪；甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。本方清熱化濕且氣血并治，以達(dá)“調(diào)氣則后重自除，行血?jiǎng)t便膿自愈”之效。葉天士指出“痢疾一證,古稱滯下,蓋里有滯濁而后下也”，本方用通因通用法，使?jié)駸岱e滯從大便而下；肉桂辛熱，配在苦寒藥中是為反佐，寒熱共投，使寒涼中寓以辛熱，寒而不遏，以防伏。本方為清瀉腸胃濕熱、調(diào)和氣血治痢的經(jīng)典方[10]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),芍藥[11]、黃連[12]、黃芩[13]、大黃[14]均有抗菌抗炎作用，芍藥可恢復(fù)低下狀態(tài)的細(xì)胞免疫功能，可解痙鎮(zhèn)痛；黃連有抗?jié)兛垢篂a作用；黃芩抗菌范圍廣且能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，大黃可改善腸道微循環(huán)，降低膿腫、出血的發(fā)生率。羅敏等[15]研究發(fā)現(xiàn)芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜核因子-κB(NF-κB)相對(duì)活性明顯降低，提示芍藥湯能顯著降低濕熱型潰結(jié)結(jié)腸黏膜NF-κB的相對(duì)活性，進(jìn)而調(diào)控著UC患者中細(xì)胞因子和CAM的釋放，參與UC患者腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。這也可能是其治潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制之一。趙曉霞等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)芍藥湯能顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的ICAM-1、TNF-A水平，可明顯提高IL-10含量,提示芍藥湯療效與SASP相當(dāng),綜上提示芍藥湯的療效可能與其免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

2.2白頭翁湯白頭翁湯亦是治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用方劑，為清熱解毒、涼血止痢之良方，《傷寒論》中有：“熱利下重者，白頭翁湯主之”。本方由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮組成。方中白頭翁為君，清熱解毒，涼血止痢；黃連、黃柏能清熱解毒，燥濕厚腸；秦皮有清熱解毒兼以收澀止痢，諸藥合用對(duì)UC有殺菌抗炎、控制感染，改善潰瘍局部循環(huán)、促進(jìn)潰瘍面的修復(fù)的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白頭翁湯可平衡體液免疫、緩和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，抗炎殺菌和修復(fù)潰瘍等[17]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是可控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的一類T細(xì)胞亞群，故其數(shù)量的減少或功能異常均可致自身免疫性疾病的發(fā)生。有研究證實(shí)白頭翁湯可活化CD4+、CD25+Treg，促使分泌大量抑制性細(xì)胞因子，抑制炎癥因子的釋放，改善免疫抑制功能，維持腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)，從而更好地控制潰瘍性結(jié)腸炎[18]。李云海等[19]發(fā)現(xiàn)加味白頭翁湯對(duì)潰結(jié)大鼠模型過度激活的NF-κB有抑制作用，這也可能是加味白頭翁湯治療潰結(jié)的作用機(jī)制之一。亦有實(shí)驗(yàn)研究表明，白頭翁湯能顯著降低潰結(jié)大鼠模型血清中IgA、IgG及IL-6含量，同時(shí)血清中及結(jié)腸組織中MDA含量經(jīng)白頭翁湯治療后顯著降低而SOD含量明顯增高，研究還表明白頭翁湯有顯著的抗炎作用及修復(fù)潰瘍的作用[20]。

2.3黃芩湯《傷寒論》中黃芩湯由黃芩、芍藥、大棗、甘草組成，黃芩苦寒可清熱止利，芍藥味酸，與甘草合用，酸甘斂陰和營止痛；甘草、大棗和中緩急。諸藥合用，共奏清熱止利、和中止痛之功[10]。鄭學(xué)寶等[21]為研究黃芩湯治療潰結(jié)的可能的免疫學(xué)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)觀察了CD4+T細(xì)胞及其共刺激分子(CSF)在濕熱型UC大鼠腸黏膜中的表達(dá)及分布，發(fā)現(xiàn)黃芩湯可以下調(diào)濕熱型UC結(jié)腸共刺激分子CD28、OX40的表達(dá)，并維持效應(yīng)CD4+T細(xì)胞活化抑制因子CD152在較高水平，下調(diào)過度激活的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞，認(rèn)為這可能是黃芩湯通過調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞共刺激分子來治療濕熱型UC的免疫學(xué)機(jī)制。CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2兩種T細(xì)胞，目前多數(shù)研究認(rèn)為Th1/Th2比例失衡是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要原因之一。有研究證實(shí)黃芩湯可以調(diào)節(jié)Thl和Th2類細(xì)胞因子的平衡，對(duì)濕熱證型的UC具有較好的調(diào)節(jié)作用，這也有效地證實(shí)了黃芩湯治療UC的免疫干預(yù)作用[22]。王怡薇等[23]則認(rèn)為黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用可能是通過抑制NF-κB P65通路活化，進(jìn)而下調(diào)促炎細(xì)胞因子NO、IL-6、TNF-α和PGE2表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。以鄭學(xué)寶負(fù)責(zé)的潰結(jié)研究組總結(jié)了黃芩湯對(duì)該病的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)為：抑制腸道黏膜巨噬細(xì)胞及γδT細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞的趨化,減少炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及黏附分子的表達(dá),抑制以CD4+為代表的免疫效應(yīng)細(xì)胞的過度活化及表型分化,有效抑制腸道黏膜的炎癥放大效應(yīng)從而發(fā)揮抗炎作用[24]。以上皆證實(shí)了黃芩湯在治療潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)對(duì)免疫功能的影響。

3清腸化濕灌腸方對(duì)UC免疫功能的影響

中醫(yī)治療潰結(jié)除了口服，還有灌腸法。UC患者多數(shù)有局部結(jié)腸黏膜充血水腫、黏膜血管通透性增高、潰瘍糜爛等病理改變,中藥灌腸治療UC有保證藥物作用濃度、使藥物直達(dá)病所、保護(hù)腸道潰瘍面等特點(diǎn)，有較好的抗炎，促進(jìn)潰瘍愈合等作用,是治療UC的重要方法之一。胡丹等[25]研究發(fā)現(xiàn)清腸健脾愈瘍湯在治療濕熱型潰結(jié)時(shí)可抑制巨噬細(xì)胞的表達(dá)，調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)潰瘍愈合。實(shí)驗(yàn)證明外用灌腸比口服給藥治愈率高，而內(nèi)外相結(jié)合可達(dá)到最佳療效。王國香[26]重點(diǎn)研究觀察了采用柳氮磺吡啶聯(lián)用錫類散中藥煎劑保留灌腸治療輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎的臨床療效，充分證實(shí)了西藥治療聯(lián)合中醫(yī)內(nèi)服、外用灌腸在臨床上的顯著療效。梁梅榮[27]將130例潰瘍性結(jié)腸炎患者隨機(jī)分組，治療組65例予清腸化濕方口服并配合灌腸方灌腸治療，對(duì)照組65例予美沙拉嗪口服，經(jīng)過1個(gè)療程觀察示治療組總有效率顯著高于對(duì)照組，治療組血清IL-8、IL-1、TNF-α水平下降幅度顯著高于對(duì)照組，且治療組對(duì)主要臨床癥狀的改善優(yōu)于對(duì)照組。證明清腸化濕口服與灌腸可下調(diào)潰結(jié)患者的血清細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫，改善臨床癥狀。

治療上采用內(nèi)外結(jié)合的方法，是整體與局部治療方法的結(jié)合。內(nèi)服法主要是作用于全身免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而灌腸療法可作用于局部，能通過直接接觸使藥物直接對(duì)局部病灶發(fā)揮作用以減輕炎癥，又有利于藥物的吸收，減少肝臟解毒過程對(duì)藥物的影響，防止消化道酸堿及消化酶對(duì)藥物的破壞，有效地調(diào)節(jié)機(jī)體亢進(jìn)的免疫功能，抗菌抗炎，緩解癥狀，減少復(fù)發(fā)，達(dá)到治療目的。

綜上所述，中醫(yī)清熱化濕法治療濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎，可有效地對(duì)其進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，減輕炎癥反應(yīng)，控制潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展。

[參考文獻(xiàn)]

[1]邱潔英，劉光金. 實(shí)驗(yàn)室檢測對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者診斷和評(píng)估預(yù)后的相關(guān)研究[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010,28(2)：153

[2]謝文，汪付兵,余曉萍，等. 潰瘍性結(jié)腸炎患者血清自身抗體檢測的臨床價(jià)值[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013,34(15)：1959

[3]榮英蕊，劉建平，郎曉猛，等. 泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫球蛋白、ICAM-1表達(dá)的影響[C]. 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第二十二屆全國脾胃病學(xué)術(shù)交流會(huì)暨2010年脾胃病診療新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編，2010：407-409

[4]劉紫艷，田航宇，邢文溪，等. 親環(huán)素A生物學(xué)活性研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2014,4(6):405-410

[5]張建武，諸葛宇征，虞偉，等. 親環(huán)素A及其自身抗體與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010,35(10):990-992

[6]解春靜，莊彥華，欒雨蘢. 潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中免疫因素的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013,29(8)：889-892

[7]郁敏敏，求一秋. 活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎患者細(xì)胞免疫功能的觀察[J]. 現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2001，13(4)：190-191

[8]Jovanovic K,Siebeck M，Gropp R. The route to pathologies in chronic inflammatory diseases characterized by T helper type 2 immune cells[J]. Clin Experim Immunol,2014,178(2):201-211

[9]謝睿，楊曉鐘. 潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜CD4+CD25+ T細(xì)胞及Foxp3表達(dá)水平的研究[J]. 醫(yī)藥論壇雜，2011，32(16)：4-7

[10] 謝鳴. 方劑學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2008：132-134

[11] 金英善，陳曼麗，陶俊. 芍藥化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27(4):745-747

[12] 杜慶波. 黃連化學(xué)成分及藥理活性研究概況[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015,31(5):153-156

[13] 史雪靖. 黃芩藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息，2010，27(4):128-130

[14] 戴潔. 大黃藥理研究與臨床應(yīng)用[J]. 天津藥學(xué)，2011，23(4)：27-29

[15] 羅敏，李帥軍，胡響當(dāng)，等. 芍藥湯對(duì)胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜核因子-κB DNA結(jié)合活性的影響[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12(3)：4-6

[16] 趙曉霞，郭勝，李寶鶴，等. 芍藥湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠ICAM-1、TNF-A、IL-10影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技,2008,15(3)：174

[17] 陳仲廣，李鵬，汪斌. 白頭翁湯治療潰瘍性腸炎的臨床應(yīng)用及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013,8(1):94

[18] 李森娟. 白頭翁湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞、IL-10的影響[J]. 浙江中醫(yī)雜志，2012，47(2)：107

[19] 李云海，何堅(jiān)漢. 加味白頭翁湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB的影響[J]. 光明中醫(yī)，2013,28(10)：2056-2059

[20] 韓捷. 白頭翁湯治療乙酸誘發(fā)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2002，8(3):38-40

[21] 鄭學(xué)寶，封艷玲，劉洪波，等. 黃芩湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠CD4+T細(xì)胞及其共刺激分子的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17(1)：169-172

[22] 鄒穎，遲宏罡，戴世學(xué)，等. 黃芩湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠Th1/Th2細(xì)胞因子的影響[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011,22(11)：2608

[23] 王怡薇，張會(huì)會(huì)，王彥禮，等. 黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κBp65調(diào)控作用研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015,50(1):21-27

[24] 鄭學(xué)寶，榮向路，王東軍，等. 黃芩湯治療實(shí)驗(yàn)性濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎免疫機(jī)制研究[D]. 廣州：廣東醫(yī)學(xué)院，2010

[25] 胡丹,江偉. 清腸健脾愈瘍湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MIF、IL-6的影響[J]. 山西中醫(yī),2012,28(6):43

[26] 王國香. 錫類散中藥煎劑灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床觀察[J]. 中國民康醫(yī)學(xué)，2011,23(4):445

[27] 梁梅榮. 清腸化濕治療潰瘍性結(jié)腸炎療效及細(xì)胞因子變化研究[J]. 山東中醫(yī)雜志，2014，33(2)：96-97

[收稿日期]2015-08-31

[中圖分類號(hào)]R574.62

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)06-0682-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.040

[通信作者]顧勤，E-mail：gq840701@alyun.com