細(xì)胞因子和應(yīng)力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

張淋坤 綜述，趙志河 審校

（天津市口腔醫(yī)院口腔正畸科，天津 300041）

細(xì)胞因子和應(yīng)力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

張淋坤 綜述，趙志河 審校

（天津市口腔醫(yī)院口腔正畸科，天津 300041）

細(xì)胞因子；力；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量最多，稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）；其它來源于外胚層的組織或發(fā)育過程中含有外胚間充質(zhì)的組織已證實(shí)含有間充質(zhì)干細(xì)胞的有皮膚、脂肪、牙周膜等[1-2]。BMSCs屬于成纖維樣細(xì)胞，在不受任何刺激的情況下體外培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞非常相似，不易區(qū)分，成紡錘形或長梭形。BMSCs在相應(yīng)的培養(yǎng)環(huán)境中可以向成骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、心肌等多方向分化。隨著在體外傳代次數(shù)的增加，BMSCs的增殖能力、成骨和成脂分化的能力均有所降低，而成軟骨能力卻沒有明顯下降；其成骨、成軟骨和成脂能力均可以保持到細(xì)胞衰老。多種誘導(dǎo)因素均可刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化，其中細(xì)胞因子和力學(xué)因素起著很重要的作用。

1 細(xì)胞因子

在BMSCs成骨分化的過程中，多種細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用。其中作用比較明確的有骨形成蛋白（BMPs），轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），白細(xì)胞介素6及其受體（IL-6/IL-6R）等。

1.1 骨形成蛋白（BMPs）

骨形成蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，是強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)因子之一，可以啟動(dòng)BMSCs成骨分化過程。BMPs可能是誘導(dǎo)BMSCs向成骨方向分化的基本信號(hào)分子。其中誘導(dǎo)成骨作用最強(qiáng)的是BMP-2、4、7。BMPs在誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的同時(shí)，可以抑制BMSCs向其他方向（比如成脂方向）分化，從而有利于骨的生長和再生。BMPs的合成與分泌受到較多因素的影響。將人BMP-2基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入BMSCs，可以被BMSCs大量表達(dá)，顯著提高BMSCs的成骨分化能力[3]。巨噬細(xì)胞可以通過分泌BMP-2來誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，這在受傷的骨組織中尤為明顯[4]。粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）過表達(dá)時(shí)，會(huì)減少BMP-2的生成，從而抑制成骨細(xì)胞的產(chǎn)生[5]。磷酸二酯酶抑制劑，如己酮可可堿，則可能通過促進(jìn)cAMP產(chǎn)生來增強(qiáng)BMP-4的誘導(dǎo)成骨功能[6]。BMP-2、4是BMSCs成骨分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Liu等[7]在研究不同材料對(duì)BMSCs成骨分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石納米支架材料可以顯著上調(diào)BMSCs內(nèi)BMP-2/4、Runx 2、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和整合素的表達(dá)，并且在整合素—BMP/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白Smad1/5/8出現(xiàn)明顯的核內(nèi)定位以后，骨鈣素的表達(dá)顯著上調(diào)，從而證明整合素—BMP/Smad信號(hào)通路的激活可以明顯促進(jìn)BMSCs的成骨分化。組織工程領(lǐng)域的研究顯示，BMPs可以吸附于支架材料上并可以實(shí)現(xiàn)緩釋，Wang等[8]將BMP-2吸附于納米仿生羥基磷灰石包被的京尼平-殼聚糖共軛支架材料，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)14 d的緩釋；在這14 d中，BMSCs成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶、Runx 2、骨鈣素的上調(diào)持續(xù)了14 d，骨橋蛋白的上調(diào)持續(xù)了3 d，從而證明了BMP-2對(duì)BMSCs成骨分化具有明顯的促進(jìn)作用。

BMPs和其他細(xì)胞因子之間以及BMPs之間存在著復(fù)雜的協(xié)同作用機(jī)制。松弛肽對(duì)BMP-2誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化有明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。BMP-2通過與其受體Rxfp 1結(jié)合，激活BMSCs內(nèi)的Smad、P38信號(hào)通路，上調(diào)Runx 2的表達(dá)和活性，從而促進(jìn)BMSCs成骨分化。而松弛肽一方面可以通過與BMP-2的協(xié)同作用直接強(qiáng)化上述作用，另一方面可以直接上調(diào)BMP-2受體Rxfp 1的表達(dá)，從而與BMP-2發(fā)生協(xié)同作用，強(qiáng)化BMP-2對(duì)BMSCs成骨分化的誘導(dǎo)作用[9]。BMP-4和BMP-7聯(lián)合應(yīng)用促BMSCs成骨分化的作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用BMP-4或BMP-7[10]，BMP-4可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的表達(dá)，而敲除BMP-6基因也可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，BMP-2可以上調(diào)表皮細(xì)胞生長因子（bFGF）的表達(dá)，BMP-5可以上調(diào)SDF-1，這些因子與BMP之間存在相互作用，BMPs之間可以通過這些因子發(fā)揮協(xié)同作用[11]。

由于BMP-2具有顯著的促進(jìn)成骨分化的作用，可以將其作為治療骨質(zhì)疏松和骨缺損的潛在藥物進(jìn)行開發(fā)。為了觀察BMPs對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療作用，Li等[12]對(duì)6月齡雌性SD大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)（去勢大鼠），術(shù)后3個(gè)月行X線檢查證實(shí)去勢大鼠已罹患骨質(zhì)疏松；然后取其BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入重組人BMP-2（rhBMP-2）；2周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組，堿性磷酸酶活性和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，從而證實(shí)BMP-2可以通過上調(diào)VEGF表達(dá)的機(jī)制促進(jìn)去勢大鼠的BMSCs成骨分化。治療骨缺損方面，BMP-2可以誘導(dǎo)BMSCs歸巢，并通過這種機(jī)制加速骨愈合和再生。Gohil SV等[13]制造了顱骨缺損的動(dòng)物模型，然后在缺損部位局部應(yīng)用rhBMP-2和（或）植入BMSCs，二者發(fā)現(xiàn)單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用都可以促進(jìn)骨缺損的愈合，而且成骨現(xiàn)象并不僅僅局限于缺損部位，其周邊正常骨組織也發(fā)生了顯著的成骨現(xiàn)象。Zhang等[14]將含有BMP-2的絲綢支架材料植入裸鼠皮下，自尾靜脈注入BMSCs，觀察到BMSCs明顯聚集于含有BMP-2的絲綢支架材料的植入部位，從而證實(shí)了BMP-2對(duì)BMSCs歸巢的趨化作用；同一研究又將含有BMP-2的絲綢支架材料植入兔的骨缺損部位，從耳緣靜脈注入BMSCs，觀察到了更強(qiáng)的BMSCs歸巢作用，Micro-CT和組織切片發(fā)現(xiàn)骨缺損處的骨質(zhì)再生受到了明顯的促進(jìn)。

1.2 轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）

關(guān)于TGF-β的成骨誘導(dǎo)效應(yīng)有兩方面的觀點(diǎn)：Locklin等[15]認(rèn)為TGF能夠抑制BMSCs的增殖，能提高其ALP的表達(dá)，并能減少和延遲BMSCs成脂分化；而現(xiàn)在比較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為TGF-β主要通過促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生和Ⅰ型膠原合成、促進(jìn)基質(zhì)鈣化等作用來增強(qiáng)骨損傷的修復(fù)能力。Zhao等[16]在鼠BMSCs的培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1），2周后發(fā)現(xiàn)BMSCs對(duì)成骨分化標(biāo)志物Runx 2、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)上調(diào)了7倍，堿性磷酸酶活性顯著提高，而成脂分化標(biāo)志物PPARγ的表達(dá)顯著降低，從而證明TGF-β1的促成骨分化效應(yīng)。TGF-β的促細(xì)胞分裂增殖作用使間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量大量增加，這不僅為BMP誘導(dǎo)成骨提供了更多的靶細(xì)胞，也為骨組織再生修復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。TGF-β的作用有賴于轉(zhuǎn)化生長因子β激酶（transforming growth factor-β activated kinase，TAK）的活性，松弛肽可以提高TAK的活性，從而與TGF-β發(fā)生協(xié)同作用，促進(jìn)BMSCs成骨分化[9]。

1.3 白細(xì)胞介素6及其受體（IL-6/IL-6R）

關(guān)于IL-6/IL-6R誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的研究，目前存在兩種觀點(diǎn)：Taguchi等[17]學(xué)者認(rèn)為，BMSCs表達(dá)IL-6R，IL-6與之結(jié)合后，可以激活JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)未定型的BMSCs分化，使ALP活性增強(qiáng)，表現(xiàn)出成骨表型。然而，另有學(xué)者認(rèn)為IL-6只是對(duì)骨源性成骨細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)成骨作用，對(duì)未定型的BMSCs誘導(dǎo)成骨作用并不明顯[18]；而在地塞米松（Dex）等輔劑作用下已有明確成骨傾向的BMSCs中加入可溶性IL-6（sIL-6）或IL-6/sIL-6R時(shí)，BMSCs的成骨作用加強(qiáng)，這主要是通過BMSCs表達(dá)的Gp130來實(shí)現(xiàn)的[15]。然而Rauner和Guzmán-Morales兩個(gè)課題組分別研究了地塞米松（DEX）在促進(jìn)BMSCs成骨分化的同時(shí)，炎癥因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在成骨分化的過程中，BMSCs對(duì)集落細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β、4、6、10（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）等炎癥因子的表達(dá)都是被抑制的，與此同時(shí)Runx 2、堿性磷酸酶的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)的礦化也顯著加強(qiáng)。Rauner課題組還發(fā)現(xiàn)在DEX誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化早期，BMSCs的增殖被提高了7%～10%，而凋亡被抑制了25%～30%[19-20]。

2 力學(xué)刺激

2.1 張應(yīng)力對(duì)BMSCs分化的影響

張應(yīng)力可以促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的共識(shí)。Jagodzinski等[21]對(duì)人BMSCs施以1 Hz、2%和8%的軸向張應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)8%的形變大小能夠顯著提高ALP、骨鈣素（osteocalcin）、I型膠原和Runx 2的表達(dá)，而2%的形變大小與對(duì)照組相比沒有明顯變化。Simmons等[22]使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人BMSCs，同時(shí)施加0.25 Hz、3%的周期性雙軸拉伸，與未加載的對(duì)照組相比，周期拉伸刺激后細(xì)胞基質(zhì)礦化提高2.3倍，而且BMSCs呈現(xiàn)出更加成熟的成骨細(xì)胞表型。Koike[23]通過Flexercell系統(tǒng)研究雙軸張應(yīng)力對(duì)干細(xì)胞系ST2成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)較低力值（0.8%～5%）下張應(yīng)力能夠更有效地促進(jìn)成骨分化。Grottkau[24]比較了相同力值的機(jī)械張應(yīng)力對(duì)BMSCs和脂肪干細(xì)胞 （ASCs）成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)ASCs在收到張應(yīng)力作用后，細(xì)胞排列方向改變?yōu)榇怪庇趶垜?yīng)力方向，而BMSCs的排列沒有明顯改變；稱骨標(biāo)志物Runx 2和Osterix的表達(dá)無論開始上調(diào)的時(shí)間還是表達(dá)量都沒有明顯差異，而骨鈣素和BMP-2的表達(dá)量雖然沒有差異，但是開始上調(diào)的時(shí)間BMSCs明顯晚于ASCs，從而說明ASCs和BMSCs都可以在張應(yīng)力的誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞方向分化，但ASCs較BMSCs對(duì)張應(yīng)力的反映更加敏感。

2.2 壓應(yīng)力對(duì)BMSCs分化的影響

對(duì)成骨細(xì)胞的研究顯示，壓應(yīng)力可以刺激人成骨細(xì)胞系高表達(dá)骨涎蛋白和骨形成蛋白（BMP）并且低表達(dá)它們的拮抗物，從而誘導(dǎo)成骨[25]。受到這項(xiàng)研究結(jié)果的啟示，同一課題組又將壓應(yīng)力作用于干細(xì)胞，并研究其分化方向，發(fā)現(xiàn)壓應(yīng)力可以顯著增強(qiáng)干細(xì)胞成骨 （Runx 2、Msx 2、Dlx 5、Osterix）和成軟骨（Sox 5，9）標(biāo)記物的表達(dá)水平，同時(shí)降低成?。∕yoD）和成脂（PPARγ）標(biāo)記物的表達(dá)水平[26]。這說明，壓應(yīng)力可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨和成軟骨方向分化；信號(hào)通路的研究顯示，壓應(yīng)力促進(jìn)成骨和成軟骨是通過不同的信號(hào)通路進(jìn)行的。壓應(yīng)力可以通過P38MAPK途徑提高Runx 2的表達(dá)，從而促進(jìn)干細(xì)胞向成骨方向分化[26]。同時(shí)，壓應(yīng)力還可以通過BMPs途徑誘導(dǎo)干細(xì)胞向成軟骨方向分化，Wang等[27]將周期性壓應(yīng)力加載到大鼠BMSCs觀察期成軟骨分化，發(fā)現(xiàn)周期性壓應(yīng)力不僅可以直接誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化，同時(shí)可以促進(jìn)BMSCs增殖，并提高其數(shù)量和活力，上調(diào)Ihh,Cyclin D 1,CDK 4,和Col2α1的表達(dá)；在此過程中MEK/ERK和P38 MAPK信號(hào)通路沒有參與，而BMP信號(hào)通路卻扮演者重要角色。

2.3 流體剪切力對(duì)BMSCs分化的影響

由于骨組織內(nèi)存在大量的微管，外界的應(yīng)力作用于骨組織產(chǎn)生的應(yīng)變，必然引起這些微管內(nèi)的液體的流動(dòng)，這就會(huì)給成骨細(xì)胞帶來流體切應(yīng)力的影響。因此，流體切應(yīng)力對(duì)成骨類細(xì)胞的影響就成了研究的熱點(diǎn)。

對(duì)于成骨細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，流體切應(yīng)力可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟，抑制其凋亡；并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)基因和蛋白，而這種效應(yīng)與流體切應(yīng)力的大小，作用時(shí)間，細(xì)胞培養(yǎng)條件等因素有密切關(guān)系[28]。

BMSCs在流體切應(yīng)力作用下的分化效應(yīng)，不同的研究者有著不同的看法。Riddle等[29]認(rèn)為不同大小的流體切應(yīng)力可以通過MAPK途徑和鈣離子通道促進(jìn)BMSCs的增殖，而Li等[30]卻認(rèn)為周期性流體切應(yīng)力可以明顯的使BMSCs向成骨方向分化，同時(shí)量效和時(shí)效研究發(fā)現(xiàn)2.0 Pa的流體切應(yīng)力作用下3 min后，就可以觀察到鈣沉積的顯著提高，而1.0 Pa的流體切應(yīng)力作用2 h后，BMSCs的成骨相關(guān)基因也顯著表達(dá)。分析這些研究結(jié)果存在差異的原因，可能和各研究者的研究目的不同，所選指標(biāo)不同，施加的流體應(yīng)力的大小、作用時(shí)間等不同所導(dǎo)致。

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（2015-11-12收稿）

R318

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.022

張淋坤（1975-），男，副主任醫(yī)師，博士。E-mail:zlkxjtu@163.com