廣西壯族及漢族代謝綜合征患者的脂聯(lián)素水平及其基因-11377C/G和+276G/T多態(tài)性▲

黃生金 陸俊佳 朱 旭 楊 蘭 鄭利平

(1 廣西南寧市馬山縣人民醫(yī)院檢驗科，馬山縣 530600，E-mail：huangshengjin1964@126.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨南寧市第二人民醫(yī)院檢驗科，南寧市 530031)

論著·臨床研究

廣西壯族及漢族代謝綜合征患者的脂聯(lián)素水平及其基因-11377C/G和+276G/T多態(tài)性▲

黃生金1陸俊佳2朱 旭2楊 蘭2鄭利平2

(1 廣西南寧市馬山縣人民醫(yī)院檢驗科，馬山縣 530600，E-mail：huangshengjin1964@126.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨南寧市第二人民醫(yī)院檢驗科，南寧市 530031)

目的 分析廣西壯族及漢族代謝綜合征(MS)患者的脂聯(lián)素水平及其基因位點+276G/T和-11377C/G的多態(tài)性。方法 壯族MS患者(壯族MS組)、壯族正常人(壯族正常組)、漢族MS患者(漢族MS組)和漢族正常人(漢族正常組)各100例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清脂聯(lián)素濃度，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測脂聯(lián)素基因位點的多態(tài)性。結(jié)果 (1)與同族正常組比較，兩個MS組HDL-C和脂聯(lián)素均顯著降低(P<0.05)，而體重指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、收縮壓、舒張壓、TG、TC、LDL-C明顯升高(P<0.05)；兩個MS組間的FPG、BMI、收縮壓、舒張壓、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)4組的脂聯(lián)素+276和-11377基因型及等位基因分布頻率符合H-W群體遺傳平衡法則(P>0.05)。與同族正常組比較，壯族、漢族MS組的脂聯(lián)素+276GT和TT基因頻率明顯升高(P<0.05)。4組的脂聯(lián)素-11377位點絕大部分是野生型CC基因型，等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)壯族、漢族MS組中脂聯(lián)素+276位點攜帶 GG 型的患者血清脂聯(lián)素水平顯著高于基因型為GT和TT型的患者(P<0.05)。壯族、漢族MS組脂聯(lián)素+276位點GT型的患者脂聯(lián)素水平較TT型患者略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。漢族MS組脂聯(lián)素+276位點GG、GT、TT基因型患者的脂聯(lián)素水平明顯低于壯族MS組相同基因型患者(P<0.05)。兩個MS組中脂聯(lián)素-11377位點CC型和CG型患者的脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 廣西壯族和漢族MS發(fā)生可能與脂聯(lián)素+276位點T基因型導(dǎo)致血清中脂聯(lián)素水平降低有關(guān)。脂聯(lián)素+276基因位點可作為MS的篩選基因之一。

代謝綜合征；脂聯(lián)素；基因多態(tài)性；壯族；漢族；廣西

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)因具有多重心血管危險因素而成為研究熱點之一[1-2]。脂聯(lián)素具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等生物活性，且其所在基因區(qū)域與2型糖尿病和MS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文旨在探討脂聯(lián)素水平及其基因位點+276G/T和-11377C/G基因多態(tài)性與MS的關(guān)系，為防治MS提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇廣西南寧市(壯族主要分布區(qū))的壯族MS患者(壯族MS組)、壯族健康人(壯族正常組)、漢族MS患者(漢族MS組)和漢族健康人(漢族正常組)各100例為研究對象。壯族MS患者：男52例，女48例，年齡46～75歲，平均年齡53.1歲；壯族健康人：男55例，女45例，年齡50～71歲，平均年齡53.9歲；漢族MS患者：男55例，女45例，年齡47～78歲，平均年齡54.3歲；漢族健康人：男53例，女47例，年齡49～72歲，平均年齡54.4歲。壯族、漢族MS患者及健康人入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)三代中未有與其他民族通婚的壯族或漢族家族，選擇第三代個體為研究對象，且盡可能確保研究對象在其可追蹤的歷史上沒有與其他民族人通婚；(2)各個研究對象間無血緣關(guān)系；(3)無遺傳性疾病家族史及其他急、慢性疾病史。MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國成人血脂異常防治指南》[3]。4組研究對象的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均對本研究知情同意，且自愿參加。

1.2 標(biāo)本采集 抽取每個研究對象空腹靜脈血5 ml，分別平均注入干燥管和乙二胺四乙酸抗凝管中。干燥管放置 30 min后，低速(3 000 r/min)離心10 min，取血清置于-20℃冰箱保存，用于測定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂聯(lián)素水平。乙二胺四乙酸抗凝管中的標(biāo)本充分混勻，用于脂聯(lián)素基因位點多態(tài)性檢測。

1.3 主要儀器和試劑 日立-7600全自動生化儀(日本日立公司)，RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。凝膠成像儀(珠海黑馬生物公司)，ABI-9700擴增儀(美國ABI公司)，脂聯(lián)素試劑(美國GBD公司，批號Z2013006)，DNA抽提試劑(北京天根生化科技有限公司，批號N2509)。

1.4 血清FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂聯(lián)素水平的檢測 采用日立-7600全自動生化儀測定FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C。脂聯(lián)素采用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.5 DNA制備 全血DNA的制備嚴(yán)格按照試劑說明書操作，最后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 脂聯(lián)素+276和-11377基因位點檢測

1.6.1 反應(yīng)體系：PCR混合反應(yīng)液8 μl(含脫氧核苷三磷酸緩沖液)、Taq酶0.5 μl、無菌水37.5 μl、DNA模版2 μl和上、下游引物各1 μl，共50 μl反應(yīng)體系。脂聯(lián)素+276和-11377基因位點引物序列見表1。

表1 脂聯(lián)素+276和-11377基因位點引物序列

1.6.2 擴增條件：脂聯(lián)素+276位點擴增條件： 94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)； 72℃延伸7 min。脂聯(lián)素-11377位點擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，62℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.6.3 限制性片段長度多態(tài)性分析：(1)脂聯(lián)素+276位點：PCR產(chǎn)物20 μl、BsmI內(nèi)切酶1 μl，緩沖液3 μl，無菌水6 μl，37℃酶切1 h。脂聯(lián)素+276G/T PCR產(chǎn)物長度為745 bp(T等位基因)，酶切后為225 bp和520 bp的兩個片段(G等位基因)。(2)脂聯(lián)素-11377位點：PCR產(chǎn)物20 μl、AlwNI內(nèi)切酶1 μl，緩沖液3 μl，無菌水6 μl，37℃酶切1 h。脂聯(lián)素-11377C/G的PCR產(chǎn)物長度為450 bp(G等位基因)， 酶切后為95 bp和355 bp(C等位基因)兩個片段。酶切后產(chǎn)物5 μl在2%瓊脂糖凝膠上點樣，電壓100 V，電泳30 min后凝膠圖像分析儀下觀察電泳結(jié)果并攝像保存。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗，多組間計量資料的比較采用方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。脂聯(lián)素等位基因進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P>0.05即表明樣本具有群體代表性。

2 結(jié) 果

2.1 4組血壓、血脂、血糖及脂聯(lián)素比較 4組間體重指數(shù)(body mass index，BMI)、血壓、血脂、FPG及脂聯(lián)素比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步比較，壯族MS組、漢族MS組的HDL-C和脂聯(lián)素均分別低于壯族正常組、漢族正常組(P<0.05)，而BMI、FPG、收縮壓、舒張壓、TG、TC、LDL-C均分別明顯高于壯族正常組、漢族正常組(P<0.05)。壯族MS組與漢族MS組的FPG、BMI、收縮壓、舒張壓、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂聯(lián)素略有不同，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組血壓、血脂、血糖及脂聯(lián)素比較(x±s)

2.2 4組脂聯(lián)素+276和-11377位點多態(tài)性 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，4組的脂聯(lián)素+276G/T和-11377C/G基因型和等位基因頻率分布均達到遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。兩個民族MS組的脂聯(lián)素+276位點T基因型分布頻率雜合程度均較高，其中以漢族的MS組最高。脂聯(lián)素-11377位點4組均以野生型(CC基因型)為主。4組脂聯(lián)素+276位點基因型分布、等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，壯族MS組脂聯(lián)素+276基因的GT和TT基因型分布頻率明顯比壯族正常組高(P<0.05)；漢族MS組的GT和TT基因型分布頻率也顯著高于漢族正常組(P<0.05)；壯族MS組脂聯(lián)素+276基因GT基因型和TT基因型分布頻率與漢族MS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組間的脂聯(lián)素-11377位點基因型分布、等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組脂聯(lián)素+276和-1136177位點基因型和等位基因頻率分布(n，%)

2.3 MS組脂聯(lián)素+276和-11377不同基因型患者血清脂聯(lián)素水平 兩個MS組中脂聯(lián)素+276位點不同基因型患者血清脂聯(lián)素水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩個MS組中脂聯(lián)素+276位點攜帶 GG 型的患者血清脂聯(lián)素水平顯著高于基因型為GT 和TT型的患者(P<0.05)。MS組脂聯(lián)素+276位點GT型患者的脂聯(lián)素水平較TT型的患者略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。漢族MS組脂聯(lián)素+276位點GG、GT、TT基因型患者脂聯(lián)素水平明顯低于壯族MS組相應(yīng)基因型患者(P<0.05)。兩個MS組中脂聯(lián)素-11377位點CC型別和CG型別的脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 壯族、漢族MS組脂聯(lián)素+276和-11377不同基因型患者血清脂聯(lián)素水平比較(x±s，mg/L)

3 討 論

近年來MS的患病率不斷上升，心腦血管病的發(fā)生率和病死率也不斷增加[2]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防MS非常重要。脂聯(lián)素是由脂肪組織特異性分泌的一種激素蛋白，可通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌方式影響葡萄糖轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮功能、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗，與肥胖、2型糖尿病密切相關(guān)[4-5]。MS患者血清脂聯(lián)素水平較正常人顯著降低，脂聯(lián)素被認為是MS的生物學(xué)標(biāo)志。脂聯(lián)素基因位于人染色體3q27區(qū)域，該區(qū)域有3個外顯子和2個內(nèi)含子，具有豐富的多態(tài)性[6]，也是2型糖尿病、MS、冠心病的易感基因區(qū)域[7-9]。但脂聯(lián)素基因多態(tài)性存在種族和地區(qū)差異,以致國內(nèi)外研究結(jié)果不一致，甚至不同地區(qū)同一種族人群也會有相互矛盾的結(jié)果[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)與同民族正常人比較，壯族MS組和漢族MS組血清中脂聯(lián)素水平顯著降低(P<0.05)，這與Kizer等[11]的研究結(jié)果相似，提示血清低脂聯(lián)素水平可能與MS的發(fā)生密切相關(guān)。目前關(guān)于脂聯(lián)素內(nèi)含子3第276位點G/T變異的研究結(jié)果不一致，有研究表明276位點G/T變異與肥胖個體的低脂聯(lián)素水平相關(guān)[12]，而另一項研究表明該變異位點與代謝綜合征不相關(guān)[2]。本文結(jié)果顯示，壯族MS組和漢族MS組脂聯(lián)素+276的GT、TT基因型明顯高于同族正常組(P<0.05)，且T等位基因在壯族和漢族MS患者中較多見。MS組中脂聯(lián)素+276位點攜帶 GG 型的患者血清脂聯(lián)素水平顯著高于基因型為GT 和TT型的患者(P<0.05)，推測攜帶單核苷多態(tài)性+276 T基因型的個體血清中低水平脂聯(lián)素可能更易發(fā)展為MS，這與國內(nèi)外研究結(jié)果[9，11]相似。提示脂聯(lián)素+276是廣西地區(qū)壯族和漢族MS的易感基因。本文結(jié)果顯示，漢族MS組脂聯(lián)素+276位點GG、GT、TT基因型患者脂聯(lián)素水平明顯低于壯族MS組(P<0.05)，分析原因可能與壯族MS患者的血脂、血糖和血壓等均稍低于漢族患者有關(guān)。本文結(jié)果顯示，兩個民族MS組和正常組的脂聯(lián)素-11377位點主要以野生型CC基因型為主，基因突變程度均不高；兩個MS組中脂聯(lián)素-11377位點CC型別和CG型別的脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示SNP-11377基因多態(tài)性與MS可能無關(guān)，不是MS的一個危險因素。這與汪琳姣等[13]在桂北地區(qū)漢族體檢人群中的研究結(jié)論相似。但Lin等[14]的研究表明攜帶脂聯(lián)素-11377 GG基因型的MS患者空腹血清胰島素、FPG和胰島素抵抗指數(shù)水平明顯增高，而血漿脂聯(lián)素水平明顯降低，是MS發(fā)生的一個危險因素。我們推測，造成這種差異的原因可能有以下幾點：(1)研究對象所處的環(huán)境、地區(qū)不同；(2)研究對象的種族不同，基因遺傳規(guī)律存在差異；(3)本研究觀察的樣本量較少，研究人群代表性還不夠強，具有局限性，不足以檢測出相關(guān)性；(4)脂聯(lián)素基因-11377C/G位點不是廣西地區(qū)MS的候選基因位點。

綜上所述，廣西地區(qū)漢族、壯族MS患者的發(fā)生可能與脂聯(lián)素+276T基因型導(dǎo)致血清中低脂聯(lián)素水平密切相關(guān)。將脂聯(lián)素+276基因位點作為MS的篩選基因之一有助于早期發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)MS的易感人群。

[1] Grundy SM.Pre-diabetes,metabolic syndrome,and cardiovascular risk[J].J Am Coll Cardiol,2012,59(7):635-643.

[2] 朱曉巍,吳文君,卜瑞芳,等.代謝綜合征患者脂聯(lián)素基因多態(tài)性分析[J].山東醫(yī)藥,2010,50(49):10-12.

[3] 中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志,2012,19(18):5-15.

[4] Xu XT,Xu Q,Tong JL,et al.Meta-analysis:circulating adiponectin levels and risk of colorectal cancer and adenoma[J].J Dig Dis,2011,12(4):234-244.

[5] Garg MK,Dutta MK,Mahalle N.Adipokines(adiponectin and plasminogen activator inhibitor-1) in metabolic syndrome[J].Indian J Endocrinol Metab,2012,16(1):116-123.

[6] Flynn C,Bakris GL.Interaction between adiponectin and aldosterone[J].Cardiorenal Med,2011,1(2):96-101

[7] 孫 琳,廖 羽,葉 琳,等.FADS1/FADS2基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012,38(1):115-118.

[8] 何慧婧,衛(wèi)大英,王淳秀,等.四川涼山漢族2型糖尿病與脂聯(lián)素基因多態(tài)性[J].中國公共衛(wèi)生,2012,28(3):302-304.

[9] 王遂軍,賈偉平,包玉倩,等.脂聯(lián)素基因多態(tài)性與代謝綜合征相關(guān)性研究[J].中華實用診斷與治療雜志,2012,26(7):659-661.

[10]徐 麗,凌文華.脂聯(lián)素基因多態(tài)性研究進展[J].國外醫(yī)學(xué):內(nèi)分泌學(xué)分冊,2005,25(z1):1-3.

[11]Kizer JR,Barzilay JI,Kuller LH,et al.Adiponectin and risk of coronary heart disease in older men and women[J].J Clin Endocrinol Metab,2008,93(9):3 357-3 364.

[12]薛 磊,李丹丹,龐嫵燕.代謝綜合征患者脂聯(lián)素基因多態(tài)性與胰島素抵抗的相關(guān)性[J].山東醫(yī)藥,2014,54(33):78-79.

[13]汪琳姣,于 健,葉 瑤,等.桂北地區(qū)漢族體檢人群代謝綜合征調(diào)查及脂聯(lián)素基因多態(tài)性研究[J].中華老年心腦血管病雜志,2013,15(11):1 133-1 138.

[14]Lin CH,Ho CY,Liu CS,et al.Influence of adiponectin gene polymorphisms on adiponectin serum level and insulin resistance index in Taiwanese metabolic syndrome patients[J].Chin J Physiol,2012,55(6):405-411.

Adiponectin level and its polymorphisms of -11377C/G and +276G/T genotypes in patients of Zhuang and Han nationalities with metabolic syndrome from Guangxi

HUANGSheng-jin1,LUJun-jia2,ZHUXu2,YANGLan2,ZHENGLi-ping2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,thePeople′sHospitalofMashanCounty,Nanning530600,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,
theThirdAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,theSecondPeople′sHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530031,China)

Objective To analyze the adiponectin level and the polymorphisms of adiponectin +276G/T and -11377C/G genotypes in patients of Zhuang and Han nationalities with metabolic syndrome(MS) from Guangxi.Methods The levels of serum adiponectin were detected by enzyme-linked immunosorbent assay in patients of Zhuang nationality with MS(Zhuang MS group,n=100),normal individuals of Zhuang nationality(Zhuang normal group,n=100),patients of Han nationality with MS(Han MS group,n=100) and normal individuals of Han nationality(Han normal group,n=100).And the polymorphisms of adiponectin genotypes were detected using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.Results ① Compared to the normal group of same nationality,the adiponectin and HDL-C levels significantly decreased,while the body mass index(BMI),fasting plasma glucose(FPG),systolic blood pressure(SBP),diastolic blood pressure(DBP),TC,TG and LDL-C were significantly higher in the two MS groups(P<0.05).There were no significant differences in FPG,BMI,SBP,DBP,TG,TC,HDL-C,LDL-C and adiponectin levels between the two MS groups(P>0.05).② The distribution frequencies of genotype and allele of adiponectin +276 and -11377 in the four groups were consistent with the H-W population genetic equilibrium(P>0.05).The frequencies of GT and TT of adiponectin+276 genotypes in Zhuang and Han MS groups were significantly higher than those of normal group with same nationality(P<0.05).Among the 4 groups,most of the adiponectin -11377 loci were the wild type,but there was no significant difference in the distribution of allele frequencies(P>0.05).③ In the Zhuang and Han MS groups,the serum adiponectin level of patients with adiponectin +276GG genotype was significantly higher than that of patients with GT or TT genotype(P<0.05).The adiponectin level of patients with adiponectin +276GT genotype was a little higher than that of patients with TT genotype,but no significant difference was found(P>0.05).The adiponectin levels of patients with adiponectin +276GG,GT and TT genotype in the Han MS group were significantly lower than those of patients with adiponectin +276GG,GT and TT genotype in the Zhuang MS group respectively(P<0.05).In the two MS groups,there was no significant difference in the adiponectin level between the patients with adiponectin -11377CC and CG genotype(P>0.05).Conclusion The decline of serum adiponectin level induced by T genotype of adiponectin +276 gene locus may be associated with the occurrence of MS in Guangxi Zhuang and Han nationalities.Adiponectin +276 gene locus may become one of the genes for MS screening. 【Key words】 Metabolic syndrome,Adiponectin,Gene polymorphism,Zhuang nationality,Han nationality,Guangxi

廣西南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃(2012135)

黃生金(1964～)，男，本科，副主任技師，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)檢驗。

鄭利平(1965～)，女，本科，主任檢驗技師，研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗，E-mail：46805193@qq.com。

R 589

A

0253-4304(2016)06-0787-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.10

2016-01-20

2016-04-16)