凋亡在原發(fā)性肺損傷中的變化

葉 穎張文勝蘇惠斌王 樂,3*

（1 蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123；2 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)麻醉科，江蘇 蘇州 215000；3 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123）

凋亡在原發(fā)性肺損傷中的變化

葉 穎1張文勝1蘇惠斌2王 樂2,3*

（1 蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123；2 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)麻醉科，江蘇 蘇州 215000；3 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123）

目的氣管滴注法構(gòu)建脂多糖（LPS）引起的大鼠原發(fā)性急性肺損傷(acute lung injury，ALI)模型，研究肺組織細(xì)胞凋亡的時(shí)間變化。方法30只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為5組：對(duì)照組，LPS（1、6、12和24 h）組。LPS組氣管內(nèi)滴注LPS，5 mg/kg，正常對(duì)照組氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。于1 h、6 h、12 h和24 h后處死，取肺組織，行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察病理變化；測(cè)定肺濕重/干重（W/D）比值；TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling）法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)凋亡蛋白cleaved-capase3的表達(dá)水平。結(jié)果HE染色可見，LPS滴注后肺泡間隔增寬、間質(zhì)充血水腫、肺泡腔變窄、炎性細(xì)胞滲出及小氣道損傷隨著時(shí)間增加呈現(xiàn)趨勢(shì)性變化。LPS組肺W/D比對(duì)照組明顯增加。TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1 h、6 h、12 h和24 h實(shí)驗(yàn)組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）較對(duì)照組明顯升高，且1～12 h內(nèi)AI值隨時(shí)間增加而增加，其中12 h AI值最高，24 h時(shí)間點(diǎn)AI有所下降。對(duì)照組AI低于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。Western blot發(fā)現(xiàn)，在1 h、6 h、12 h和24 h實(shí)驗(yàn)組cleaved-caspase-3含量較對(duì)照組明顯升高，且1～12 h內(nèi)隨時(shí)間增加而增加，其中12 h最高，24 h有所下降。對(duì)照組cleaved-caspase-3含量低于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。結(jié)論LPS導(dǎo)致大鼠原發(fā)性肺損傷隨著時(shí)間的推移而逐漸加重，大鼠肺組織細(xì)胞大量凋亡，其凋亡程度對(duì)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一先升后降的過程。

急性肺損傷；內(nèi)毒素；凋亡；時(shí)程變化

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接或間接因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全[1]。ALI發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，是近年來研究的重點(diǎn)[2]。肺性的ALI是病因?qū)Ψ闻菁?xì)胞的直接損傷效應(yīng)，又稱為原發(fā)性肺損傷。直接和間接ALI肺內(nèi)外器官損傷表現(xiàn)，發(fā)病程度，進(jìn)程，致死率以及治療均有所差別，LPS致急性肺損傷進(jìn)展快，發(fā)展至嚴(yán)重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征，如不及時(shí)干預(yù)，致死率極高[3]。關(guān)于肺組織細(xì)胞在ALI發(fā)病進(jìn)程的研究并不多見，本研究采用氣管內(nèi)直接滴注LPS的方法建立原發(fā)性肺損傷，旨在觀察原發(fā)性肺損傷時(shí)肺組織的凋亡情況以及凋亡時(shí)程變化，為進(jìn)一步探討原發(fā)性肺損傷發(fā)病機(jī)制以及早期干預(yù)時(shí)機(jī)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 蘇木精-伊紅染色檢測(cè)肺組織病理變化（放大倍數(shù)×400）

圖2 蛋白印記檢測(cè)Cleavedcaspase-3在肺組織中的表達(dá)水平*P＜0.05 vs.對(duì)照組

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性SD大鼠（蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）30只，體質(zhì)量250～280 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS處理1 h、6 h、12 h、24 h組（每組6只）。5組動(dòng)物均腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后做頸部正中切口，暴露氣管，將LPS用1 mL注射器注入氣管，制備ALI模型，對(duì)照組注射等量生理鹽水，注射LPS后分別于1 h、6 h、12 h、24 h經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，剖胸取肺。

1.2 肺組織病理學(xué)觀察：取右肺下葉組織，10%甲醛固定后用石蠟包埋切片，片厚5 μm，HE染色，光鏡觀察肺組織形態(tài)。

1.3 肺水含量測(cè)定：取右肺中葉，吸水紙吸干表面水分及血液，稱量肺濕重。置于80 ℃烤箱72 h后，稱量肺干重，計(jì)算W/D。

1.4 TUNEL法肺組織細(xì)胞凋亡：步驟如TUNEL分析試劑盒說明。AI的計(jì)算方法：每個(gè)標(biāo)本取2張切片，每張切片選擇4個(gè)具有代表性的視野（×400），計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中明顯的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算AI。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 蛋白免疫印跡：注射LPS后，開胸取出左肺下葉，迅速凍存于液氮中。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫封閉3 h后，加入一抗：抗cleaved-capase-3抗體（1∶800）4 ℃過夜。洗膜3遍后用相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，最后用ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織光鏡檢測(cè)：正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)清晰，胞壁光滑，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)無滲出；LPS組1 h即有肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有滲出液，肺泡隔增厚，肺泡及間質(zhì)充血、出血，部分肺泡塌陷，這些變化在6 h、12 h逐漸加重，24 h時(shí)又有所下降，其中以12 h組改變最明顯（圖1）。

2.2 W/D比值：LPS可以誘導(dǎo)大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量值升高，1 h（4.80±0.13）即開始升高，6 h（6.47±0.36）繼續(xù)升高，12 h（6.74 ±0.26）時(shí)W/D值升高顯著高于其他LPS組，24 h（4.71±0.57）有所下降。與對(duì)照組（4.35±0.37）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 肺組織細(xì)胞凋亡的變化：TUNEL分析LPS處理后，肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞明顯增加[1 h，（28.01±2.74）；6 h，（37.22± 2.95）；12 h，（48.13±1.88）；24 h，（15.85±1.99）]。與對(duì)照組（11.23±2.31）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 肺組織cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)：以?-actin作為內(nèi)參，cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)量的光密度掃描分析顯示，LPS組cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05，圖2），與對(duì)照組組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

目前ARDS的病死率仍高達(dá)40%～60%[4]。ALI是ARDS的早期階段，內(nèi)源性ALI的主要病因有：吸入肺部感染，淹溺，有毒氣體吸入，肺創(chuàng)傷[5]。當(dāng)LPS進(jìn)入體內(nèi)后激活炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，觸發(fā)局部炎性反應(yīng)而產(chǎn)生肺損傷，且LPS本身對(duì)肺上皮和血管內(nèi)皮也有直接損傷作用，可建立確切的直接肺損模型[6]。

在不同肺損傷中，凋亡起到了很大的作用。有報(bào)道顯示，與全身炎性反應(yīng)不同，LPS可以直接導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，支氣管上皮細(xì)胞凋亡[7]。研究顯示，在ALI的修復(fù)期，肺泡Ⅱ型細(xì)胞是以凋亡的方式參與其結(jié)構(gòu)重建，同時(shí)大量凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞清除，故細(xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程。在凋亡信號(hào)通路中，cleavedcaspase-3作為最終末的凋亡蛋白，它的增加表示凋亡已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在直接肺損傷時(shí)，肺組織的整體凋亡率的改變與病理組織形態(tài)改變呈現(xiàn)一致性改變，LPS滴注后1 h，肺損傷逐漸增加持續(xù)至24 h，損傷和凋亡率在12 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后凋亡率開始下降，肺損傷減輕，所以我們認(rèn)為，LPS導(dǎo)致了肺組織炎癥，細(xì)胞的凋亡，二者相輔相成，是一個(gè)先升后降的過程，該結(jié)果為肺源性肺損傷選擇藥物，呼吸支持的時(shí)機(jī)時(shí)間以及預(yù)后提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但其具體凋亡發(fā)展機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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1671-8194（2016）33-0015-02

*通訊作者