殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞免疫的影響

盧亞楠，王 武，李 明，張建清，王 麗，叢玉婷

大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連，116023

殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞免疫的影響

盧亞楠，王 武，李 明，張建清，王 麗，叢玉婷

大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連，116023

考察了三種抗凝劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞的抗凝效果，研究了殼寡糖作為免疫添加劑對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬能力的影響，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)殼寡糖對(duì)吞噬過(guò)程中活性氧作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌海水對(duì)刺參體腔細(xì)胞具有一定的抗凝效果，且細(xì)胞形態(tài)和活性保持較好，將殼寡糖以1%、3%的質(zhì)量濃度添加入到基礎(chǔ)飼料中，分別檢測(cè)體腔液細(xì)胞吞噬情況和呼吸氧爆發(fā)情況，結(jié)果表明殼寡糖可顯著提高仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬能力和活性氧水平(P<0.05)，總體表現(xiàn)為1%殼寡糖組>3%殼寡糖組>對(duì)照組。

仿刺參；殼寡糖；體腔液細(xì)胞；吞噬；活性氧

仿刺參(Apostichopusjaponicus)為我國(guó)北方棘皮動(dòng)物養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類(lèi)[1-2]。近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖海參的水體環(huán)境逐漸惡化，海參疾病頻繁發(fā)生，給養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。為了減少海參疾病造成的損失，養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)戶大量使用抗生素和化學(xué)藥物，雖然取得了一定的效果，但污染了水體環(huán)境，動(dòng)物及其產(chǎn)品殘留有藥物，影響人體健康，因此國(guó)家對(duì)這類(lèi)藥物的使用已作了嚴(yán)格限制[5]。為了解決海參養(yǎng)殖中病害與食品安全等問(wèn)題，一些學(xué)者著手免疫增強(qiáng)劑的研究，即在海參飼料中添加免疫增強(qiáng)劑如多糖、寡糖、益生菌等，以提高海參機(jī)體的免疫機(jī)能，進(jìn)而減少病害的發(fā)生。

殼寡糖作為免疫增強(qiáng)劑，在魚(yú)蝦和海參的養(yǎng)殖上已有相關(guān)研究[6-7]，但對(duì)殼寡糖提高海參免疫力的機(jī)理和效果鮮有報(bào)道。為此，本文研究殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬作用和吞噬過(guò)程中呼吸氧爆發(fā)現(xiàn)象的影響，并探究殼寡糖作為免疫添加劑提高仿刺參體腔液細(xì)胞免疫功能的機(jī)理和效果，以期為海參的綠色養(yǎng)殖和疾病防治提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與飼料1.1.1 材 料

仿刺參購(gòu)于遼寧省普蘭店某水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，大小為25～30 g左右，于(50×35×20)cm PVC水槽內(nèi)暫養(yǎng)3天，投喂基礎(chǔ)飼料(購(gòu)于大連海洋大學(xué)海珍苗種培育基地，為幼參配合飼料)，至仿刺參出現(xiàn)有規(guī)律攝食為止。

1.1.2 飼 料

實(shí)驗(yàn)用殼寡糖購(gòu)自大連化學(xué)物理研究所。將殼寡糖粉劑分別以0%(對(duì)照組)、1%、3%的濃度加到海參基礎(chǔ)飼料中，混勻后，置于陰涼、干燥的地方，密封、備用。

1.2 儀器與試劑1.2.1 儀 器

化學(xué)發(fā)光儀(Centro XS3 LB960型，德國(guó)Berthold Technologies公司)，顯微鏡(Olympus CX21型，日本奧林巴斯有限公司)，高速離心機(jī)(GT10-1型，上?；C(jī)械廠有限公司)，真空抽濾器(C-50型，北京眾益眾和生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 試 劑

無(wú)菌海水：海水取自大連海洋大學(xué)海養(yǎng)樓，用0.45 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾并高壓滅菌。

酵母懸液：取5 mg干酵母，用少量離心仿刺參體腔液自體血清調(diào)理2 h以上(室溫)，再用無(wú)菌海水20 mL配成2 mg/mL的懸液，分裝于聚乙烯離心管冰凍貯存，用前融化。

魯米諾溶液(3-氨基鄰苯二甲酰肼)：取0.78 g氫氧化鉀、0.618 g硼酸和0.014 g魯米諾粉劑，溶解于10 mL的雙蒸水中，然后移置棕色瓶中，放入冰箱(4℃)貯存[8]。

殼寡糖：用無(wú)菌海水配置200 μg/mL寡糖溶液，4℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方 法1.3.1 仿刺參培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)分為A、B和C三組，A組為基礎(chǔ)飼料組，不加殼寡糖；B組添加1%的殼寡糖；C組添加3%的殼寡糖。每組設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放入25頭25～30 g仿刺參，試驗(yàn)中水溫設(shè)為(14±2)℃，pH為8±0.12，鹽度30。每天投喂飼料一次，定時(shí)換水，每次換水約為總水量的三分之一,連續(xù)充氣。

實(shí)驗(yàn)每5天取樣一次。使用0.5 mL無(wú)菌注射器吸取酵母懸液0.5 mL(用無(wú)菌過(guò)濾海水配制成4 mg/mL),分別從仿刺參背部注射入體腔，每次每組取2頭仿刺參，3 h后解剖、收集體腔液。

1.3.2 體腔液細(xì)胞抗凝劑的篩選

選用0.01 mol/L EGTA溶液、1.0 mg/L EDTA-Na2和無(wú)菌海水作為體腔液細(xì)胞抗凝劑，并分別將它們與體腔液細(xì)胞按1∶1的比例混合，顯微鏡下觀察在不同的時(shí)間內(nèi)體腔液細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞群落凝集情況。

1.3.3 吞噬率測(cè)定

將所取體腔液與無(wú)菌海水按1∶1比例均勻混合，顯微鏡下觀察并記錄體腔液細(xì)胞吞噬情況。

1.3.4 活性氧測(cè)定

從A、B和C三組仿刺參體內(nèi)各取150 μL體腔液細(xì)胞，分別加入發(fā)光板孔內(nèi)，使用Centro XS3LB960化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定體腔液的基礎(chǔ)發(fā)光值，然后加入150 μL魯米諾溶液，記錄發(fā)光最高值，考察不同濃度對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬過(guò)程中呼吸氧爆發(fā)的影響。

表1 三種抗凝劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞的抗凝效果

注:+++為凝集情況嚴(yán)重.TIF，++為凝集較嚴(yán)重.TIF，+為凝集較輕，-為基本無(wú)凝集；P++++為伸展?fàn)顩r好，變形細(xì)胞變形明顯，無(wú)細(xì)胞破裂現(xiàn)象；P+++為伸展?fàn)顩r較好，變形細(xì)胞偽足伸出明顯減少，無(wú)明顯的細(xì)胞破裂現(xiàn)象；P++為伸展情況差，大部分變形細(xì)胞縮回偽足，細(xì)胞出現(xiàn)輕微破裂現(xiàn)象；P+為變形細(xì)胞幾乎無(wú)偽足伸出，并且細(xì)胞出現(xiàn)較嚴(yán)重的破裂現(xiàn)象，體腔液內(nèi)有細(xì)胞破裂物存在。

2 結(jié) 果

2.1 體腔液細(xì)胞抗凝劑的確定

根據(jù)表1，綜合細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞群落凝集情況，無(wú)菌海水對(duì)刺參體腔細(xì)胞具有一定的抗凝效果，且細(xì)胞形態(tài)和活性保持完好，伸展?fàn)顩r好，變形細(xì)胞變形明顯，無(wú)細(xì)胞破裂現(xiàn)象，因此選定作為無(wú)菌海水仿刺參體腔液細(xì)胞抗凝劑。

2.2 飼喂殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬率的影響

由圖1可知，隨投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度的殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬的影響趨勢(shì)不同。培養(yǎng)5 d，A組和C組的差異不明顯；培養(yǎng)10 d后，B組顯著高于A組和C組(P<0.05)。

圖1 殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬的影響

2.3 飼喂殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬過(guò)程中呼吸氧爆發(fā)的影響

由圖2可知，各組仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬過(guò)程中呼吸氧爆發(fā)均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。10天后，B組呼吸氧爆發(fā)活性變化明顯，且均顯著高于A組和C組(P<0.05)。

圖2 殼寡糖對(duì)仿刺參體腔液細(xì)胞吞噬過(guò)程中呼吸氧爆發(fā)的影響

4 結(jié) 論

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，殼寡糖對(duì)仿刺參非特異性免疫能力產(chǎn)生了影響，且濃度不同作用效果不同，一般隨著殼寡糖濃度的升高，作用有一個(gè)由低到高，再由高到低的變化，但高濃度未見(jiàn)有抑制作用。具體來(lái)說(shuō)，投喂殼寡糖對(duì)仿刺參吞噬情況和呼吸氧活性有顯著增強(qiáng)效應(yīng)，雖在不同個(gè)體體腔液中作用時(shí)間和作用效果有些差異，但均能表現(xiàn)出免疫指標(biāo)的增強(qiáng)，對(duì)仿刺參體腔液中吞噬情況和呼吸氧活性的影響幾乎都在15天左右達(dá)到最高，且殼寡糖添加質(zhì)量百分比為1%比較合適。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.12.025

2016-08-12

遼寧省教育廳一般計(jì)劃項(xiàng)目(L2013278)。

盧亞楠(1977-),女,遼寧營(yíng)口人,博士,實(shí)驗(yàn)師,主要研究方向:水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)。

R734.2

A

1673-2006(2016)12-0086-03