吡格列酮對前脂肪細胞分化及GILZ蛋白表達的影響*

王毅飛，　伊　娜，　吳琳英，　黃曉淳，　梁思虹

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣東 廣州 510120；2廣州市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州510130)

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吡格列酮對前脂肪細胞分化及GILZ蛋白表達的影響*

王毅飛1△，伊娜2，吳琳英1，黃曉淳1，梁思虹1

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣東 廣州 510120；2廣州市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州510130)

[摘要]目的： 探討吡格列酮在3T3-L1前脂肪細胞分化及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈(GILZ)蛋白表達調(diào)節(jié)方面的作用。方法: 形態(tài)觀察3T3-L1細胞分化過程，不同濃度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)處理細胞48 h，然后于分化的第2、4、6天用油紅O染色測定細胞甘油三酯相對含量，實時熒光定量PCR法檢測過氧化物增殖活化受體(PPAR)γ2 和脂蛋白酶(LPL)的mRNA表達。不同濃度藥物處理細胞48 h后，Western blot檢測GILZ蛋白表達。結(jié)果: 油紅O法顯示甘油三酯相對含量隨藥物處理濃度的增加而增加，與對照組比，1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L組甘油三酯含量顯著性增加(P<0.05)。實時熒光定量PCR檢測顯示PPARγ2、LPL的mRNA表達也是隨著藥物處理濃度的增加而增加。與對照組比，吡格列酮高于1×10-3mmol/L濃度時，PPARγ2、LPL的mRNA表達顯著性增加(P<0.01)。Western blot顯示GILZ蛋白表達隨著藥物處理濃度的增加而降低。結(jié)論: 吡格列酮可下調(diào)GILZ表達，上調(diào)PPARγ2及下游LPL的表達。

[關(guān)鍵詞]吡格列酮； 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈； 脂肪細胞分化； 過氧化物增殖活化受體γ2； 3T3-L1細胞

脂肪細胞是哺乳動物的一類重要功能細胞,在維持脂類代謝及能量代謝平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。大量的實驗證明，長期使用糖皮質(zhì)激素會導(dǎo)致骨髓脂肪細胞數(shù)量增加、骨質(zhì)疏松、胰島素抵抗、血脂異常、肥胖和糖尿病等[1]。在脂肪細胞形成過程中, 作為細胞相關(guān)信號通路作用靶點的轉(zhuǎn)錄因子——過氧化物增殖活化受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)被認為起了極其重要的作用。吡格列酮(pioglitazone)屬噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)胰島素增敏劑，是人工合成型PPARγ的高親和性配體激活劑，已廣泛用于 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者的治療，已被報道其可通過激活PPARγ2，調(diào)節(jié)下游靶基因表達，發(fā)揮促進脂肪細胞分化發(fā)育、改善胰島素抵抗、抗炎等作用[2-3]。

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)具有誘導(dǎo)細胞生長、分化和凋亡等多種功能，已經(jīng)被廣泛用于抗炎、免疫抑制等方面的治療。但是長期使用糖皮質(zhì)激素，會加速骨的丟失導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，取而代之的是骨髓脂肪細胞數(shù)量的增加。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈(glucocorticoid-induced leucine zipper，GILZ)蛋白是一種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白，被報道可通過抑制脂肪細胞分化而拮抗糖皮質(zhì)激素的副作用。GILZ屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員, 我們先前的研究及其它國外研究表明GC可上調(diào)GILZ表達，后者通過下調(diào)脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2、C/EBPα的表達而抑制下游脂肪代謝必需基因脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)等的表達，進而抑制脂肪細胞的分化，GILZ可作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)下游基因的表達[4-6]。

那么吡格列酮是否對GILZ表達有影響尚不清楚，為了進一步探討吡格列酮誘導(dǎo)脂肪細胞分化的藥理作用機制，本文試圖通過研究吡格列酮對前脂肪細胞分化及GILZ、PPARγ2、LPL等表達的影響，探討吡格列酮對前脂肪細胞分化的影響。

材料和方法

1主要材料

牛血清、DMEM(HyClone)；吡格列酮、油紅O、地塞米松、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤、胰島素(Sigma)；PVDF膜(Bio-Rad)；羊抗小鼠GILZ的 I 抗(Santa Cruz)；驢抗羊IRDye 800的II抗(LI-COR)；TRIzol(Invitrogen)；實時熒光定量(real-time) PCR 試劑(Promega)。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2主要方法

2.13T3-L1前脂肪細胞株的誘導(dǎo)分化將3T3-L1前脂肪細胞接種于12孔或6孔培養(yǎng)板，采用含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液 1 次。待細胞生長至完全融合后2 d，開始誘導(dǎo)分化,將培養(yǎng)液換為脂肪細胞誘導(dǎo)劑(含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤、0.25 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的DMEM完全培養(yǎng)液)處理48 h。隨后換含10 mg/L胰島素的DMEM培養(yǎng)液孵育48 h。在誘導(dǎo)同時，加入不同濃度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)。然后以不含任何誘導(dǎo)劑的10% DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)液 1 次。

2.2油紅O染色法生化測定甘油三酯相對含量取分化的3T3-L1細胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液固定細胞5 min。去掉多聚甲醛固定液，再加相同體積的多聚甲醛固定液固定細胞至少1 h。去掉多聚甲醛固定液，60%異丙醇洗 1 次。細胞完全晾干，加油紅O工作液于細胞表面，靜置10 min。棄油紅O染液，立即流水洗至背景透明。油紅O染色的細胞于室溫完全晾干，加0.4 mL 100%異丙醇, 靜置10 min以上，用tip頭反復(fù)吹打幾次，使油紅O完全溶解，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管使用，檢測500 nm的吸光度(A)值(空白對照100%異丙醇)。

2.3實時熒光定量PCR法檢測以不同濃度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)處理細胞，取誘導(dǎo)的第6天(day 6th, D6)的3T3-L1前脂肪細胞，按Invitrogen的TRIzol說明書提取細胞總RNA。200 μL PCR反應(yīng)管中依次加入如下試劑進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：RNA 抽提物1 μg，計算補水量至總體積25 μL;立即放入冰浴中，然后依次加入RNasin 1 μL，Oligo(dT)隨機引物 2 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，5×RT 緩沖液 5 μL，MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，在PCR儀上70 ℃ 10 min。然后以1 μL合成的cDNA為模版，依次加入2×Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O至總反應(yīng)體系20 μL。95 ℃ 5 min;94 ℃ 30s,56 ℃ 30s,72 ℃ 30s,共40個循環(huán);72 ℃ 10 min進行PCR擴增。測定各樣品的Ct值，以管家基因β-actin為內(nèi)參照對待測樣品的Ct值進行校正，計算校正值2-ΔΔCt進行統(tǒng)計分析。

選取脂肪細胞分化相關(guān)標志物PPARγ2和LPL檢測，根據(jù)PPARγ2和LPL的mRNA在Genbank中的序列設(shè)計引物，見表1。

F: forward; R: reverse;

2.4Western blot實驗收集不同濃度吡格列酮處理48 h的3T3-L1細胞，加RIPA裂解液，高速離心后，測上清蛋白濃度。取60 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后半干電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h，加GILZ的 I 抗(1∶1 000)，室溫1 h,TBST洗3次，加抗羊IRDye 800的 II 抗(1∶2 000)，室溫反應(yīng)1 h，TBST洗滌3次，Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)上掃描顯像。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1吡格列酮對脂肪細胞分化的影響

誘導(dǎo)前的3T3-L1前脂肪細胞成纖維形、梭形或多角形，細胞核為圓形，位于細胞質(zhì)中央。換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化第2天，細胞內(nèi)開始觀察到反光的脂質(zhì)小滴，并隨著分化的進展越來越多的細胞出現(xiàn)脂質(zhì)小滴，而且單個細胞內(nèi)的脂質(zhì)小滴的數(shù)目逐漸增加，并使細胞的形狀由多角形逐漸變?yōu)闄E圓形或圓形，到了分化的第6天左右，脂肪細胞內(nèi)的脂肪小滴會相互融合成較大的淡黃色脂肪滴。形態(tài)學(xué)初步觀察到吡格列酮組比無藥物處理的對照組細胞分化程度高，見圖1。

Figure 1.The effection of pioglitazone (1×10-2mmol/L) on 3T3-L1 cells differentiation (×200).

圖1吡格列酮對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

進一步用油紅O法生化測定分化脂肪細胞內(nèi)甘油三酯相對含量。顯示各濃度吡格列酮均促進3T3-L1前脂肪細胞的分化，在誘導(dǎo)分化的第2、4、6天所測得A值均高于陰性對照組，其中1×10-3和1×10-2mmol/L能顯著地促進前脂肪細胞的分化(P<0.05)，見表2。

表2吡格列酮對3T3-L1前脂肪細胞甘油三酯相對含量的影響

Table 2.The effection of pioglitazone on relative content of triglyceride during 3T3-L1 cells differentiation (Mean±SD.n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol/L.

2吡格列酮對脂肪細胞分化相關(guān)標志物PPARγ2和LPL mRNA表達的影響

不同吡格列酮濃度誘導(dǎo)后，real-time PCR法檢測分化第6天的3T3-L1細胞內(nèi)PPARγ2和LPL的mRNA表達，結(jié)果顯示隨著吡格列酮濃度的增加，PPARγ2和LPL的mRNA表達也相應(yīng)增加。1×10-4mmol/L吡格列酮組與對照組比較，PPARγ2和LPL的 mRNA表達雖增加，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。而1×10-3mmol/L吡格列酮組PPARγ2和LPL的mRNA表達則顯著提高(P<0.01)，1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L吡格列酮組PPARγ2的mRNA表達分別增加了2.56和3.00倍，LPL的mRNA表達分別增加了1.73和1.93倍，見圖2。

3吡格列酮對脂肪細胞GILZ蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示: 與對照組比較，隨著吡格列酮濃度的增加，GILZ蛋白表達降低，尤其是1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L組3T3-L1前脂肪細胞的GILZ表達較對照組明顯降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.The effect of pioglitazone on the mRNA expression of PPARγ2 and LPL during differentiation of 3T3-L1 cells detemined by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖2Real-time PCR檢測吡格列酮對3T3-L1脂肪細胞過氧化物增殖活化受體γ2和脂蛋白酶mRNA表達的影響

Figure 3.The effect of pioglitazone on the protein expression of GILZ in 3T3-L1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mmol/L.

圖3吡格列酮對3T3-L1脂肪細胞GILZ蛋白表達的影響

討論

前脂肪細胞是脂肪細胞的一種, 由多能干細胞(multipotential stem cells，MSCs)或胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)分化而來。脂肪細胞分化異常是導(dǎo)致肥胖的主要途徑之一，脂肪組織除了是被動的能量儲存器官,而且還是多種激素類物質(zhì)分泌的內(nèi)分泌器官；脂肪細胞分化與調(diào)控失?？蓪?dǎo)致人類多種疾病如肥胖癥、糖尿病、脂肪肝、高脂血癥及乳腺癌等發(fā)生。肥胖被認為是2型糖尿病、心血管疾病及其它慢性疾病的主要危險因子。改善前脂肪細胞的分化可能是治療或預(yù)防糖尿病的策略之一[4,7]。

細胞分化的本質(zhì)是基因表達模式的轉(zhuǎn)變。前脂肪細胞在多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下, 激活多個脂肪組織相關(guān)基因, 并在這些基因的順序性協(xié)調(diào)控制下, 經(jīng)過一系列復(fù)雜的步驟后才分化成成熟脂肪細胞。過氧化物增殖活化受體家族是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內(nèi)受體，是調(diào)節(jié)脂肪形成的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，在脂肪組織分化過程中起了重要的作用。PPARs家族由3個不同基因編碼組成核內(nèi)受體PPARα、PPARβ和PPARγ等亞型。PPARα和PPARβ分別同機體的脂質(zhì)代謝及細胞的基礎(chǔ)脂質(zhì)代謝有關(guān), PPARγ與脂肪細胞分化關(guān)系更為密切。由于啟動子和拼接方式不同, PPARγ分為PPARγ1、PPARγ2及PPARγ3 3種亞型。PPARγ2主要在脂肪組織中表達，因此,在脂肪組織分化過程中, PPARγ2尤為重要，被認為是調(diào)控脂肪細胞分化的關(guān)鍵分子，有的稱是主控調(diào)節(jié)子[8-9]。PPAR通過與下游靶基因啟動子上的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合而激活基因表達[10]。它的表達可以促使脂肪細胞分化、調(diào)節(jié)細胞周期及許多細胞系的終末脂肪細胞分化等[11]。由于脂肪細胞分化過程中，PPARγ2表達會增加，因此，PPARγ2被認為既是脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子，又是脂肪細胞分化相關(guān)標志基因。

目前臨床主要用于治療2型糖尿病、改善胰島素抵抗的藥物是胰島素增敏藥噻唑烷二酮類，主要有吡格列酮和羅格列酮。TZDs作為PPARγ的配體，激活PPARγ，從而調(diào)控其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進脂肪細胞的分化。本實驗檢測結(jié)果顯示吡格列酮上調(diào)PPARγ2和LPL mRNA表達，增加脂肪細胞內(nèi)甘油三酯，促進脂肪細胞的分化，與文獻所報道結(jié)果一致[12]。促脂肪分化的作用目前被認為是吡格列酮作為治療2型糖尿病藥物改善胰島素抵抗的重要原因，同時也可以解釋吡格列酮引起腹部皮下脂肪增加的副作用。

GILZ是由D’Adamio等[13]在比較糖皮質(zhì)激素地塞米松(dexamethasone，DEX)處理和非DEX處理的鼠胸腺細胞mRNA表達差異時發(fā)現(xiàn)的一種亮氨酸拉鏈蛋白家族新成員。已發(fā)現(xiàn)GILZ具有多種生物學(xué)功能，如選擇性的保護T細胞激活凋亡，抗炎及參與腎集合管細胞Na+通道的調(diào)節(jié)。GILZ能與HDAC1、NF-κB、Ap1等多種蛋白發(fā)生相互作用，并參與Fas/FasL、NF-κB、Ap1、MAPKs成員Raf21等多條信號通路的信號傳遞，因此，GILZ是一種重要的信號蛋白分子[13-14]。后來發(fā)現(xiàn)GILZ有抑制脂肪細胞分化的功能，國外和我們先前的實驗[4,6]均表明單獨GILZ過表達可顯著性抑制PPARγ2、C/EBPα、LPL 和FAS的mRNA表達從而抑制脂肪細胞的分化，因此,GILZ被認為是一種PPARγ2的轉(zhuǎn)錄抑制因子。本實驗結(jié)果顯示隨著吡格列酮濃度的增加，GILZ蛋白表達降低，表明吡格列酮可調(diào)節(jié)GILZ的表達。那么吡格列酮促進脂肪細胞分化是否通過下調(diào)GILZ表達，然后上調(diào)PPARγ2表達的還需要進一步研究。糖皮質(zhì)激素在臨床應(yīng)用過程中，發(fā)現(xiàn)有引起脂肪細胞異常分化、加重胰島素抵抗等副作用，長期使用還可能會導(dǎo)致肥胖及2型糖尿病的發(fā)生。文獻還報道TZDs可通過促進PPARγ的表達激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進下游與胰島素效應(yīng)有關(guān)的涉及葡萄糖的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運、利用及脂肪代謝的多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而改善胰島素抵抗[15]。本實驗結(jié)果顯示吡格列酮不僅促進PPARγ2的表達，而且抑制了GILZ表達，因此，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的GILZ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在吡格列酮調(diào)節(jié)脂肪細胞分化和胰島素抵抗中的路徑及交匯的節(jié)點，值得進一步研究。

深入研究吡格列酮和GILZ對脂肪細胞的分化調(diào)控機制有助于更好地了解糖脂代謝障礙及胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生機制。隨著未來它們分子作用機制的不斷闡明，調(diào)節(jié)GILZ表達有可能成為治療2型糖尿病的新靶點。那么由于吡格列酮這種明顯的促脂肪細胞分化作用，如對于某些糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的肥胖或糖尿病患者，其應(yīng)用可改善糖皮質(zhì)激素引起的脂肪細胞異常分化，改善葡萄糖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，更好地防治糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的糖脂代謝障礙和2型糖尿病的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of pioglitazone on pre-adipocytes differentiation and GILZ expression

WANG Yi-fei1, YI Na2, WU Lin-ying1, HUANG Xiao-chun1, LIANG Si-hong1

(1DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofEndocrinology,TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangzhou,Guangzhou510130,China.E-mail:wangyifeigz@126.com)

[KEY WORDS]Pioglitazone; Glucocorticoid-induced leucine zipper; Adipocytes differentiation; peroxisome proliferator-activated receptor γ2; 3T3-L1 cells

[ABSTRACT]AIM: To investigate the roles of pioglitazone on differentiation and expression of GILZ in 3T3-L1 pre-adipocytes. METHODS: The morphological changes during 3T3-L1 cell differentiation were observed. The cells were treated with pioglitazone at concentrations of 1×10-4～1×10-2mmol/L for 48 h, then the relative content of triglyceride were analyzed by oil red O staining at 2nd, 4th and 6th day during adipogenesis. The mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) and lipoprotein lipase (LPL) was measured by real-time PCR. GILZ protein expression was determined by Western blot after the cells were treated with pioglitazone at concentrations of 1×10-4～1×10-2mmol/L for 48 h.RESULTS: Oil-red O staining showed that the relative contents of triglyceride in adipocytes were increased with the increase in the pioglitazone concentration. Compared with the control, the relative contents of triglyceride in group 1×10-3mmol/L and group 1×10-2mmol/L were significantly increased (P<0.05). The mRNA expression of PPARγ2 and LPL was also increased with the increase in the pioglitazone concentration. When pioglitazone concentration was more than 1×10-3mmol/L, compared with the control, the mRNA expression of PPARγ2 and LPL significantly increased (P<0.01). The protein expression of GILZ was decreased with the increase in the pioglitazone concentration.CONCLUSION: Pioglitazone down-regulates GILZ expression, and up-regulate PPARγ2 expression and the downstream functional factor such as LPL.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1122- 05

[收稿日期]2016- 01- 07[修回日期] 2016- 04- 25

*[基金項目]廣東省科技計劃(No. 2013B021800195);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目(No. A2014291)

通訊作者△Tel: 020-83062299; E-mail: wangyifeigz@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.027