FOXP3+Treg細(xì)胞對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌患者新輔助化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

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(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科2病區(qū)　河南 鄭州　450052)

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FOXP3+Treg細(xì)胞對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌患者新輔助化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

竇冬青張?zhí)觳殴鶑V成張連平

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科2病區(qū)河南 鄭州450052)

【摘要】目的觀察新輔助化療對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌患者外周血及組織中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的影響，探討FOXP3+Tregs對(duì)乳腺癌新輔助化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法回顧性分析鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年1月至2014年12月期間收治的73例治療前均經(jīng)病理活檢證實(shí)的女性浸潤(rùn)性乳腺癌患者，采用TAC方案(多西他賽+阿霉素+環(huán)磷酰胺)新輔助化療2個(gè)周期。采集新輔助化療前1 d和化療后第10天的外周靜脈血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD4+、Treg細(xì)胞的變化；采用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中FOXP3的表達(dá)，評(píng)估患者新輔助化療后的療效，并分析FOXP3+Tregs的高低與病理完全緩解率(pCR)之間的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌患者新輔助化療后外周血中Treg細(xì)胞明顯下降，CD4+細(xì)胞及CD4+細(xì)胞/Treg細(xì)胞顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；熀?7例有效組患者Treg細(xì)胞較16例無效組患者明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pCR為17.8%，而FOXP3+Tregs高表達(dá)患者較低表達(dá)患者病理完全緩解率低(P=0.016)。結(jié)論新輔助化療可降低乳腺癌患者外周血Treg細(xì)胞的比例；乳腺癌組織中Treg細(xì)胞FOXP3表達(dá)水平可預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療的療效，將作為指導(dǎo)乳腺癌治療的一個(gè)潛在指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤；新輔助化療；CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家乳腺癌發(fā)病率逐年升高，世界范圍內(nèi)每年新患乳腺癌人數(shù)約100萬以上。在我國(guó)每年城市乳腺癌的女性患者死亡率可達(dá)到38.9%，因此，對(duì)乳腺癌患者的治療和預(yù)防仍是一項(xiàng)值得長(zhǎng)期研究的課題[1]。新輔助化療作為乳腺癌綜合治療常用的手段之一，可用于局部晚期乳腺癌患者的降階梯治療，增加保乳的機(jī)會(huì)；新輔助化療還能在個(gè)體化療中檢測(cè)并篩選新藥在體內(nèi)的敏感性，推動(dòng)新藥的研發(fā)。新輔助化療過程中達(dá)到病理完全緩解(pCR)患者的DFS和OS明顯延長(zhǎng)，而另一部分患者則出現(xiàn)疾病進(jìn)展甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，在新輔助化療前準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體新輔助化療的療效顯得至關(guān)重要。

研究表明，CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg細(xì)胞)能夠抑制CD8+T細(xì)胞增殖[2]，故推測(cè)其有助于腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸、浸潤(rùn)生長(zhǎng)及增殖。在正常人體內(nèi)存在著少量的Treg細(xì)胞，而腫瘤患者體內(nèi)均有大量的Treg細(xì)胞存在[3]，Tan等[4]發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Treg細(xì)胞數(shù)明顯增加與腫瘤進(jìn)展程度以及患者預(yù)后成負(fù)相關(guān)。本研究通過觀察新輔助化療對(duì)乳腺癌患者機(jī)體免疫功能的影響，以及FOXP3+Tregs與乳腺癌患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系，探討FOXP3作為Tregs的一個(gè)重要標(biāo)志性因子，能否作為一個(gè)預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療效果的潛在靶點(diǎn)。

1資料和方法

1.1臨床資料選取2013年1月至2014年12月期間鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外二科收治的73例女性乳腺癌住院患者，年齡29～67歲，平均年齡46.5歲。入選患者均經(jīng)病理活檢確診為浸潤(rùn)性乳腺癌，治療前1個(gè)月內(nèi)未接受任何抗腫瘤治療，近3個(gè)月內(nèi)未用過免疫增強(qiáng)劑，無合并影響療效的其他疾病。乳腺癌病理組織學(xué)類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌68例，浸潤(rùn)性小葉癌5例。按2009年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)JMCC乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅱa期12例，Ⅱb期18例，Ⅲa期20例，Ⅲb期16例，Ⅲc期7例。搜集該73例患者的術(shù)前病理活檢乳腺癌標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱備用。

1.2新輔助化療與療效評(píng)價(jià)73例患者均于術(shù)前給予TAC方案[多西他賽(T)75 mg/m2，d1；阿霉素(A)50 mg/m2，d1；環(huán)磷酰胺(C)500 mg/m2，d1]新輔助化療2個(gè)周期。化療前后及治療過程中定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、CT等檢查。每2周期治療結(jié)束2周后評(píng)價(jià)療效，患者接受新輔助化療2個(gè)周期后行手術(shù)治療。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)目標(biāo)病灶進(jìn)行新輔助化療的療效評(píng)估，分為病理完全緩解(pCR)、臨床完全緩解(cCR)、臨床部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)。

1.3試劑與儀器鼠抗人FITC-CD4單克隆抗體、鼠抗人PE-CD25 單克隆抗體(美國(guó)BD公司)；CD4的同型對(duì)照分別是鼠抗人FITC-IgG1免疫球蛋白和PC-IgG1免疫球蛋白(Beckman Coulter)；SP9000試劑盒(北京中杉金橋生物工程公司)；鼠抗人FoxP3單克隆抗體(Santa Cruz)，DAB顯色液、檸檬酸緩沖修復(fù)液(福州邁新生物技術(shù)公司)，熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Epics XL)。

1.4流式細(xì)胞儀和免疫組化法分別檢測(cè)外周血及乳腺癌組織中FOXP3+Treg細(xì)胞的變化在化療前1 d和2個(gè)化療周期后第10天清晨空腹抽取外周靜脈血4 ml，每例患者制備3份樣品，每個(gè)樣品管中加入100 μl外周血及不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體各20 μl，暗室孵育、裂解紅細(xì)胞、固定、制成重懸緩沖液。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并測(cè)定淋巴細(xì)胞區(qū)域CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞百分率。搜集乳腺癌患者治療前穿刺活檢標(biāo)本，切片常規(guī)脫蠟水化后，采用SP免疫組化法檢測(cè)標(biāo)本中Treg細(xì)胞FOXP3+的表達(dá)。嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，用病理已經(jīng)確診為陽性的乳腺癌標(biāo)本作為陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。每張標(biāo)本選取10個(gè)高倍鏡視野，視野中FOXP3+Treg細(xì)胞的均值≥15定義為FOXP3高表達(dá)。

2結(jié)果

2.1乳腺癌患者化療前、后外周血中T細(xì)胞亞群的比較乳腺癌患者新輔助化療前外周血中Treg細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞比例較化療后明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；新輔助化療前外周血中CD4+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞/Treg細(xì)胞較化療后顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　新輔助化療前、后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較±s)

2.2新輔助化療前、后不同療效乳腺癌患者Treg細(xì)胞的變化經(jīng)2個(gè)周期的新輔助化療后對(duì)73例乳腺癌患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，其中pCR 13例，cCR 15例，PR 29例，SD 10例，PD 6例，有效組(pCR+cCR+PR)57例，無效組(SD+PD)16例。對(duì)化療前后有效組與無效組兩組患者的Treg細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示化療前兩組Treg細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而化療后有效組的Treg細(xì)胞較無效組的Treg細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。

表2　新輔助化療前、后不同療效乳腺癌患者Treg細(xì)胞的比較

2.3FOXP3表達(dá)水平和乳腺癌新輔助化療療效的關(guān)系所有患者在化療期間，均無化療藥物的更換以及劑量的下調(diào)。73例患者經(jīng)TAC方案新輔助化療后，pCR為17.8%，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平與療效采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，兩變量相互獨(dú)立，不存在相關(guān)性(χ2=8.289，P=0.082)。療效比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，其中FOXP3+Tregs高表達(dá)患者pCR率較低表達(dá)患者明顯降低(P=0.016)，見表3。FOXP3在乳腺癌組織中表達(dá)情況見圖1。

表3　FOXP3高表達(dá)和低表達(dá)患者經(jīng)TAC方案治療的療效比較[n(%)]

圖1　FOXP3+Treg細(xì)胞在浸潤(rùn)性乳腺癌患者中的不同表達(dá)

注：A為FOXP3+Treg細(xì)胞表達(dá)變化圖(SP×400)；B為FOXP3+Treg細(xì)胞表達(dá)變化圖(SP×200)；C為FOXP3+Treg細(xì)胞在乳腺癌組織中高表達(dá)圖(SP×200)；D為FOXP3+Treg細(xì)胞在乳腺癌組織中低表達(dá)圖(SP ×200)。

3討論

近年來研究表明，在乳腺癌[5]，黑色素瘤[6]，卵巢癌，肺癌，胃癌[7]，前列腺癌，肝癌，胰腺癌[8]等惡性腫瘤患者的外周血和腫瘤局部微環(huán)境中Treg細(xì)胞比例均明顯增高，其愈來愈受到學(xué)者的重視。Treg細(xì)胞是一類具有負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用的特殊T細(xì)胞亞群，對(duì)免疫系統(tǒng)功能具有抑制效應(yīng)，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。另外，Treg細(xì)胞具有參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)的功能，與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸及免疫耐受有密切關(guān)系。FOXP3是一種叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)基因編碼的蛋白，作為Treg細(xì)胞特異性標(biāo)志物，已在多種惡性腫瘤中檢測(cè)到表達(dá)升高，且FOXP3+的表達(dá)對(duì)Treg細(xì)胞的成熟和功能形成發(fā)揮重要作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)檢測(cè)到的FOXP3量越多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)越多[10]。Takenaka等[11]檢測(cè)到乳腺癌組織中FOXP3及其他調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子含量較正常乳腺組織含量升高，且與乳腺癌預(yù)后有關(guān)。一些研究顯示，F(xiàn)OXP3+Treg細(xì)胞與ER、PR成負(fù)相關(guān)，與組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2成正相關(guān)[12]。而且，F(xiàn)OXP3甚至可能成為三陰性乳腺癌的一個(gè)靶作用點(diǎn)[13]。

新輔助化療是局部晚期乳腺癌綜合治療的常用方法之一，TAC方案目前作為乳腺癌化療的常用方案廣泛應(yīng)用于臨床。Treg細(xì)胞在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展﹑腫瘤免疫治療以及抑制自身免疫性疾病發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用[14]，而乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與機(jī)體免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。因此，本研究通過Treg細(xì)胞的高低變化觀察新輔助化療對(duì)乳腺癌患者免疫功能及療效的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌患者經(jīng)過2個(gè)周期的多西他賽+阿霉素+環(huán)磷酰胺新輔助化療后，外周血CD4+細(xì)胞及CD4+細(xì)胞/Treg細(xì)胞顯著升高，Treg細(xì)胞水平則明顯下降。其可能機(jī)制為新輔助化療通過細(xì)胞毒作用殺滅腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)其凋亡等，有效控制腫瘤生長(zhǎng)，減輕機(jī)體的瘤負(fù)荷，從而排除某些免疫抑制因素，使乳腺癌患者的細(xì)胞免疫功能得到一定程度的恢復(fù)。本研究中對(duì)化療前后有效組與無效組兩組患者的外周血Treg細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療前兩組Treg細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而化療后有效組的Treg細(xì)胞較無效組的Treg細(xì)胞明顯降低。這可能是由于療效達(dá)到PR的患者對(duì)化療更敏感，多西他賽+阿霉素+環(huán)磷酰胺新輔助化療殺死了大量腫瘤細(xì)胞，使腫瘤體積明顯縮小，解除了腫瘤細(xì)胞通過釋放某些免疫抑制因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增生；另外，多西他賽+阿霉素+環(huán)磷酰胺的非選擇性殺傷作用對(duì)增殖活躍的Treg細(xì)胞也有一定的殺傷作用，使化療后Treg細(xì)胞進(jìn)一步降低，從而減少其對(duì)腫瘤免疫的抑制，二者共同作用使新輔助化療后的細(xì)胞免疫功能得到明顯改善。

目前尚缺乏公認(rèn)的新輔助化療的有效預(yù)測(cè)因子，主要通過臨床及病理有效率判斷療效，而兩者往往具有滯后性[15]。因此，在新輔助化療前準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體新輔助化療療效具有重要的臨床意義。本研究還通過免疫組化測(cè)定瘤體內(nèi)FOXP3含量對(duì)新輔助化療的療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示73例患者經(jīng)TAC方案新輔助化療后，病理完全緩解率(pCR)為17.8%，在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中存在大量FOXP3+Tregs細(xì)胞，且FOXP3高表達(dá)較低表達(dá)的乳腺癌患者pCR顯著降低(P<0.05)，這可能與高表達(dá)FOXP3的患者常伴有較高的組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FOXP3可作為新輔助化療的一個(gè)有效預(yù)測(cè)因子，對(duì)判斷和改善乳腺癌患者的預(yù)后可能具有積極意義?？紤]到樣本量有限且化療方案單一，新輔助化療預(yù)測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的過程，臨床存在不可避免的偏差。今后將進(jìn)行大樣本的臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步研究，更有效地預(yù)測(cè)療效進(jìn)而提高腫瘤綜合治療的效果。

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The value of FOXP3+Treg cells in predicting the curative effect of

neoadjuvant chemotherapy in patients with invasive breast cancer

Dou Dongqing, Zhang Tiancai, Guo Guangcheng, Zhang Lianping

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of the neoadjuvant chemotherapy on CD4+CD25+FOXP3+Treg cells in the peripheral blood and tissues of the patients with invasive breast cancer, and explore the predictive value of the FOXP3+Tregs to the efficacy of neoadjuvant chemotherapy of breast cancer. MethodsA total of 73 female patients with invasive breast cancer confirmed by pathological biopsy before treatment in the First Affiliated Hospital of ZhengZhou University from January of 2013 to December of 2014 were retrospectively analyzed. During two cycles of the TAC regimen as neoadjuvant chemotherapy, peripheral venous blood samples were collected on the first day before neoadjuvant chemotherapy and the tenth day after neoadjuvant chemotherapy, and flow cytometry was used to test the changes of CD4+and Treg cells in peripheral blood. FOXP3 Tregs in tissue were assessed by immunohistochemistry, and the relationship between the high or low expression of FOXP3+Tregs and the pathological complete response (pCR) rate was analyzed. ResultsTreg cells in the peripheral blood of patients with breast cancer were decreased obviously. However, CD4+cells and CD4+cells/Treg cells were increased significantly after neoadjuvant chemotherapy, and the difference was statistically significant(P<0.05). Treg cells in the 57 patients from effective chemotherapy group were significantly lower than 16 patients of invalid group(P<0.05). The pCR was 17.8%. Compared with the patients with low expression of FOXP3+Tregs, pathologic complete response rate was lower in patients with high expression of FOXP3+Tregs(P=0.016). ConclusionNeoadjuvant chemotherapy can reduce the proportion of Treg cells in peripheral blood of breast cancer patients. The expression level of FOXP3 in Treg cells of breast cancer tissue can predict the curative effect of neoadjuvant chemotherapy, and will serve as a potential indicator of breast cancer treatment.

【Key words】breast tumor; neoadjuvant chemotherapy; CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells

收稿日期：(2015-06-26)

【中圖分類號(hào)】R 737.9doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2015.12.002

通訊作者：張連平，E-mail：zhanglp@163.com。