腦紅蛋白-中風及神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點

黃建民 王凱華(通訊作者) 黃龍堅

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530011

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·綜述與講座·

腦紅蛋白-中風及神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點

黃建民 王凱華(通訊作者) 黃龍堅

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530011

當腦組織受到亞致死性損傷時，會激活內(nèi)源性保護通路來保護腦組織。隨著大批的通過抑制缺血治療中風的臨床試驗失敗，通過內(nèi)源性神經(jīng)保護來治療中風和神經(jīng)退行性疾病似乎更有潛力和前景。腦紅蛋白是一種與氧結合的球蛋白，在神經(jīng)元內(nèi)大量表達。眾多證據(jù)表明，在體外培養(yǎng)及動物身上，腦紅蛋白都是內(nèi)源性神經(jīng)保護分子，對腦缺氧/缺血、氧超載相關損傷及神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病均有保護作用。因此，上調(diào)內(nèi)源腦紅蛋白的表達將可能是一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新療法。本文總結了最近關于腦紅蛋白的生物學功能、基因表達調(diào)控及神經(jīng)元保護機制的研究。

腦紅蛋白；神經(jīng)元保護；中風；神經(jīng)退行性疾?。蝗毖?缺血

1 背景

在過去的20 a中，對于治療中風及神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護劑進行了大量的臨床研究，而結果大多讓人失望。但其中也不乏一些有意義的研究，如有研究證明激活內(nèi)源性保護機制可以預防或減輕腦損傷。內(nèi)源性保護通路可被多種內(nèi)源神經(jīng)元保護分子激活，包括蛋白和一些轉錄因子，從而發(fā)揮保護作用[1]。腦紅蛋白(Ngb)是一種與氧結合的球蛋白，在神經(jīng)元內(nèi)表達[2]。大量證據(jù)表明，在體外培養(yǎng)及動物身上，腦紅蛋白是內(nèi)源神經(jīng)保護分子，對腦缺氧/缺血損傷有保護作用[3]。過表達Ngb基因能減輕缺血性卒中后組織損傷及功能損傷[4]，而下調(diào)Ngb的表達則增加缺氧缺血性腦損傷的程度[5]。此外，Ngb對β-淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病中退行性改變具有神經(jīng)保護作用[6]。本文將回顧關于Ngb的生物學功能、基因表達調(diào)控及神經(jīng)元保護機制的最新研究。

2 Ngb對缺血/缺氧所致神經(jīng)損傷的保護作用

血紅蛋白、肌紅蛋白及細胞球蛋白等，都是與氧結合的球蛋白，在人體和某些動物體內(nèi)發(fā)揮了重要功能。小鼠Ngb的蛋白序列和人有高達94%相似度，腦紅蛋白在腦神經(jīng)元中表達。此外，腦紅蛋白還在周圍神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌組織及視網(wǎng)膜中表達[7]。由于腦紅蛋白在腦內(nèi)能與氧結合的特性，據(jù)此研究者們推測，腦紅蛋白可能具有治療缺氧/缺血神經(jīng)損傷的作用。而事實上已經(jīng)有一系列的實驗研究證明了這個推測[8]。

有研究報導，運用反義技術介導敲除Ngb基因后，皮層神經(jīng)元在缺氧時更易受損傷。而上調(diào)表達Ngb能提高細胞在缺氧情況下的存活率[9]。在動物中風模型中，通過注射腺相關病毒過表達Ngb，可顯著降低大鼠大腦中動脈閉塞模型中梗死的范圍。Raida等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在Ngb過表達的轉基因小鼠內(nèi)，閉塞大腦中動脈后的梗死面積比野生鼠縮少了約30%。國內(nèi)也有研究者用轉基因小鼠測試Ngb對局部短暫腦缺血模型的腦保護作用，結果與Raida等研究結果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)梗死面積縮少可持續(xù)至缺血后14 d，但具體的機制仍需進一步研究。

之前大多使用Ngb基因過表達的動物模型來研究Ngb神經(jīng)保護作用，但從治療的角度，則應在中風發(fā)生后再提高腦組織的Ngb蛋白水平。蔡等通過轉錄蛋白轉染區(qū)的11-氨基酸HIV轉錄激活蛋白將Ngb蛋白分別在中風發(fā)生前后傳送至小鼠腦組織(這種Ngb蛋白簡稱為TAT-Ngb)[11]；結果顯示，在普通小鼠大腦中動脈閉塞模型中，中風前預先給TAT-Ngb和再灌注開始后馬上給予TAT-Ngb都能有效地保護腦組織。但缺血發(fā)生2 h后再給藥，已無明顯獲益。研究表明，Ngb過表達在中風早期的治療可能是獲益的，對中風高危人群，Ngb過表達也能達到預防作用。

3 腦紅蛋白對神經(jīng)退行性疾病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護作用

作為腦內(nèi)特異性的氧結合蛋白，腦紅蛋白對其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型有保護作用并不足為奇。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞和阿爾茨海默病的小鼠模型，過表達Ngb都能抗β-淀粉樣蛋白及NMDA的毒性，保護神經(jīng)元。此外，母系遺傳的新生癲癇大鼠，其小腦的Ngb表達上調(diào)，提示Ngb對癲癇也有神經(jīng)保護作用[12]。最新的研究表明，Ngb過表達對眼內(nèi)高壓和青光眼導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷有保護作用[13]。Ngb的適應證越廣泛，表明它這個內(nèi)源性保護因子的生理功能越重要，因此，任何可以上調(diào)內(nèi)源性Ngb表達的策略都可能使病人獲益。

4 Ngb對神經(jīng)系統(tǒng)保護作用的分子機制

Ngb能保護缺氧/缺血所致的腦損傷已經(jīng)是公認的，但是其作用機制卻未被完全解開。初步研究表明，Ngb的作用機制可能與其跟氧和一氧化氮結合特性有關，另外還可能與其在信號轉導的作用及對線粒體功能的影響有關。

4．1 Ngb能感測氧氣濃度及抗氧化損害 從腦紅蛋白結構來看，其細長的間質腔使氧氣易于擴散至腔隙中并與血紅素結合。起初許多人推測腦紅蛋白的作用是儲存和運輸氧氣。但腦紅蛋白與氧氣的結合率高而分解率卻很低，而且腦紅蛋白在腦內(nèi)的濃度相對并不高。因此腦紅蛋白的主要功能更可能是感測氧氣，而非儲存和運輸氧氣[14]。

另有研究指出，Ngb的神經(jīng)保護作用與其能清除活性氧有關。Ngb能直接與一氧化氮(NO)結合，親和力高且分解率低，通過與體內(nèi)的NO進行結合并將其清除，起到抗氧化的作用[15]。Singh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，過表達Ngb能使神經(jīng)元中的線粒體處在NO誘導作用下的氧消耗率下降，包括減小細胞基本氧消耗率、質子滲透能力，與此同時加強呼吸儲備的能力，從而抵抗NO誘導的神經(jīng)細胞氧化損傷作用。另一方面，Tsio等[16]報道，Ngb可將硝酸鹽轉化成一氧化氮。可見，Ngb相當于受氧化還原反應調(diào)節(jié)的亞硝酸鹽還原酶。除了可抑制通過NO誘導的氧化損害，實驗發(fā)現(xiàn)Ngb的抗氧化保護作用還可能通過上調(diào)bcl-2基因的表達以及下調(diào)bax基因的表達，從而增加超氧化物歧化酶(SOD)的含量，使得體抗氧化水平上升，減少細胞色素C的釋放以及caspase-3的活性，從而實現(xiàn)抵抗氧化作用對機體的損害[9]。Li等[17]實驗結果顯示，Ngb轉基因小鼠的腦組織在缺血缺氧缺血時，其Ngb過表達，從而減少氧化應激作用促使氧化物質ROS和RNS的生成效應[18]。以上研究均表明，Ngb的作用不僅是生理性的氧化應激感受器，同時還可通過調(diào)節(jié)缺血缺氧時一系列的信號轉導通路來抑制氧化損害反應。

4．2 Ngb參與調(diào)節(jié)信號轉導 除了假設Ngb有感測O2和抗氧化損害的作用之外，也有假設指出Ngb是個信號轉導因子。依據(jù)是在G蛋白與GDP結合的狀態(tài)下，人三價鐵腦紅蛋白(met-Ngb)與G蛋白的α亞基結合，能激活鳥苷酸分解抑制劑(guanine-nucleotide dissociation inhibitor，GDI)，從而抑制GDP替換GTP，抑制Gα與Gβγ結合，從而激活了下游信號轉導通路以緩解氧化刺激，而這一通路主要依靠Ngb分子中第60位的谷氨酸殘基對GDI活性的調(diào)控作用加以實現(xiàn)的[19]。這一發(fā)現(xiàn)也證明了腦紅蛋白是信號轉導因子的假設。

研究[20]Ngb的超表達與神經(jīng)元中線粒體滲透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放狀態(tài)之間的關系發(fā)現(xiàn)，Ngb能減少氧糖掠奪(oxygen glucose deprivation，OGD)所誘導的mPTP開放，使mPTP更多的處于關閉狀態(tài)，減少細胞色素C(Cytochrome C，CytC)的釋放，使得受損的神經(jīng)元的死亡信號轉導受到抑制，發(fā)揮Ngb的神經(jīng)保護作用。

另外，在阿爾茨海默病的動物模型上也發(fā)現(xiàn)了Ngb參與信號轉導的證據(jù)。阿爾茨海默病的特征性標志是tau蛋白的過磷酸化作用。研究者發(fā)現(xiàn)，過表達Ngb或通過激活Akt信號通路，減弱tau蛋白的過磷酸化作用[6]。需要注意的是，這些只是關聯(lián)性研究，Ngb與這些信號通路的聯(lián)系可能是直接的，也可能是間接的。充分證明其直接因果關系的證據(jù)尚遠遠不足。但Ngb對中風和阿爾茨海默病有保護作用已然是不爭的結論。

4．3 Ngb能維持線粒體正常功能 Ngb只表達于代謝活躍且耗氧的細胞中，與線粒體關系密切。線粒體的功能廣泛，可以對多種細胞損傷作出應答。一方面，Ngb可如上所述，通過穩(wěn)定線粒體上mPTP的功能，減少CytC的釋放，然而Ngb與CytC對于細胞的綜合作用兩者之間的比值密切相關，研究發(fā)現(xiàn)，當hNGB/CytC比例至少是3：1時，hNGB才能下調(diào)凋亡通路的激活物caspase-3的活化，而當?shù)陀谶@一比例時，hNGB并未能體現(xiàn)出對caspase-3活化的抑制作用[21]。另一方面，Ngb對線粒體的作用還可以通過線粒體復合物得以實現(xiàn)。Yu等[22]利用酵母雙雜交技術研究發(fā)現(xiàn)，Ngb可與CytC1進行結合，后者是線粒體復合物Ⅲ上的一個亞基，同時，他們在免疫電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，約10%的Ngb存在于原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞的線粒體中，并且線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ的活性隨Ngb的含量下降而減弱，說明Ngb可通過線粒體復合物的結合對線粒體的生物學功能發(fā)揮作用。尚有研究表明，Ngb可促使氧向神經(jīng)細胞中的線粒體內(nèi)進行擴散，使ATP的產(chǎn)生量上升，從而起到對線粒體乃至神經(jīng)細胞功能的維持作用[6]。

5 Ngb的表達及其基因表達的調(diào)控

5．1 Ngb在病理狀態(tài)下表達的變化 Ngb大量存在于大腦皮質、海馬、丘腦、下丘腦以及小腦[23]，Ngb蛋白分布基本與其mRNA分布相一致，說明上述組織也是表達Ngb的mRNA主要分布的地方。在缺氧/缺血狀態(tài)下，Ngb的基因表達水平上升[24]?；寄赶颠z傳的癲癇乳鼠，其小腦的Ngb在癲癇導致的缺血-缺氧中表達上調(diào)。臨床研究也表明，在中風病人梗死周圍皮層區(qū)，Ngb表達升高[5]。Ngb表達上升是亞致死性缺血/缺氧損傷后的內(nèi)源性代償或保護機制。Ngb的除了在腦內(nèi)分布，在視網(wǎng)膜細胞的表達水平非常高，還表達于各類腫瘤組織，包括惡性膠質瘤和星形細胞瘤。這些研究表明，Ngb在病理狀態(tài)有更廣泛的意義，提示Ngb可能與腫瘤細胞適應缺氧環(huán)境有關。

5．2 Ngb基因的轉錄調(diào)控機制 近來一些研究把重點放在影響Ngb表達的轉錄調(diào)控機制上。Zhang等報道，轉錄因子Sp1和Sp3能夠結合到人Ngb啟動子區(qū)域并激活Ngb的轉錄[25]。Ngb表達所需的轉錄因子有NFκB(p65、p50、cRel)、Egr1和Sp1。它們能結合到Ngb啟動子并負責啟動基礎Ngb的表達。此外，NFκB(p65)、Sp1以及Hif1α對缺氧狀態(tài)下Ngb表達也有作用[26]。這些研究結果有利于篩選出能上調(diào)Ngb表達的化合物。

5．3 能上調(diào)內(nèi)源性Ngb表達的化合物 腦紅蛋白一般位于細胞內(nèi)，除了在斑馬魚外，腦紅蛋白通常不能通過細胞膜，所以普遍認為外源性地給予腦紅蛋白是不可行的。若能找出能上調(diào)內(nèi)源腦紅蛋白的小分子，或許就能通過這些小分子上調(diào)Ngb的表達并使其發(fā)揮腦保護作用，找到治療中風和相關疾病的新方法。最近有研究報道，腦紅蛋白能被某些化合物上調(diào)[27]。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸[11]和17β-estradiol(雌二醇)對均有上調(diào)Ngb的作用[28]。肉桂酸能降低谷氨酸對大鼠皮層神經(jīng)元毒性[11]，但并不能保護OGD狀態(tài)下的GT1-7細胞。另一研究肉桂酸對β-淀粉樣蛋白在大鼠神經(jīng)細胞株產(chǎn)生的毒性，結果也是對細胞無保護作用[28]。這些研究質疑肉桂酸對中風到底有沒有保護作用，該質疑值得進一步研究。雌二醇雖既能上調(diào)Ngb的表達，又對神經(jīng)損傷有保護作用[29]，但由于其潛在的致癌作用，因此將雌二醇用作保護神經(jīng)藥物也基本無望。此外，上述三種化合物能上調(diào)Ngb表達的作用都是在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)，因此它們在動物模型身上是否有上調(diào)Ngb作用仍有待考究。雖然這些藥物尚不能作為治療中風及神經(jīng)退行性病變的藥物手段進入臨床，但它們?nèi)绾紊险{(diào)Ngb的機制值得進一步研究，而且它們還能作為對照藥，篩選出更多能刺激腦紅蛋白上調(diào)的化合物。

綜上所述，眾多的研究清楚地證明Ngb蛋白表達的上調(diào)對缺氧/缺血所致的腦損傷以及其他神經(jīng)系統(tǒng)病變均有保護作用。因此以Ngb作為靶分子篩選出能上調(diào)Ngb表達的小分子，并建立篩選分子的策略，或許將有助于我們找出治療中風和其他相關神經(jīng)疾患的新方法。

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(收稿2016-04-25)

廣西科技廳自然科學基金青年基金項目(2013GXNSFBA-19153)資助；廣西中醫(yī)藥管理局中醫(yī)民族醫(yī)藥傳承創(chuàng)新專項(GZLC14-08)資助

R743.3

A

1673-5110(2016)20-0134-03