石菖蒲水提物對PC12細(xì)胞增殖及細(xì)胞突起的作用

姚　娜，梁　迷，林森相，張　琦，譚　琰，王　旭，王淑艷，華　茜

(1. 天津市血液中心檢驗(yàn)科，天津　300110；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京　100029)

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石菖蒲水提物對PC12細(xì)胞增殖及細(xì)胞突起的作用

姚娜1,2，梁迷2，林森相2，張琦2，譚琰2，王旭2，王淑艷2，華茜2

(1. 天津市血液中心檢驗(yàn)科，天津300110；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029)

[摘要]目的研究石菖蒲水提物對PC12細(xì)胞增殖及細(xì)胞突起的作用，觀察藥物是否具有神經(jīng)營養(yǎng)功能或促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。方法采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒檢測不同濃度的石菖蒲水提物對細(xì)胞活力的影響；采用Image J軟件統(tǒng)計PC12細(xì)胞的梭型細(xì)胞率、細(xì)胞分化率、細(xì)胞突起長度及陽性細(xì)胞分化率，以評價石菖蒲水提物對細(xì)胞分化的影響。結(jié)果石菖蒲水提物在完全培養(yǎng)條件和低血清培養(yǎng)條件下對PC12細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用，對細(xì)胞突起的長出、分支、延伸有明顯的抑制作用。結(jié)論石菖蒲水提物具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)功能。

[關(guān)鍵詞]PC12；石菖蒲水提物；細(xì)胞增殖；細(xì)胞突起

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(pheochromocytoma cells，PC12)在形態(tài)和功能上都具有類似神經(jīng)細(xì)胞的特征，被廣泛用于研究各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。神經(jīng)損傷前期均存在著神經(jīng)突起萎縮，突觸間聯(lián)系變少、消失，神經(jīng)細(xì)胞丟失等現(xiàn)象。雖然成熟神經(jīng)細(xì)胞不可再生，但一些有限的突起再生、突觸重塑的行為還是普遍存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，這給神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來幫助。因此，改善神經(jīng)細(xì)胞存活環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)已成為研究和治療的熱點(diǎn)。

石菖蒲來源于《神農(nóng)本草經(jīng)》，古代文獻(xiàn)記載其具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功能，被用來治療癲癇、痰厥、熱病神昏、健忘等疾病。有學(xué)者[1]通過統(tǒng)計1980—2011年治療老年癡呆的臨床文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，臨床上用于改善學(xué)習(xí)記憶能力的172種中藥中石菖蒲使用頻率最高，說明其可能具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用?，F(xiàn)代研究顯示，石菖蒲能明顯改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，縮短通過水迷宮的時間，同時使模型大鼠海馬CA區(qū)突觸后膜致密物質(zhì)增厚，使神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞器的病理性改變有一定程度的恢復(fù)[2]。其不同部位水提物能顯著改善β-淀粉樣蛋白1-42(amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42)致阿爾茲海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞作為體外模型，研究石菖蒲水提物對細(xì)胞增殖和細(xì)胞突起的作用，觀察其是否具有神經(jīng)營養(yǎng)功能或者促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的功能。

1材料

1.1細(xì)胞PC12細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞資源中心。

1.2試驗(yàn)藥物石菖蒲水提物由北京中醫(yī)藥大學(xué)

神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈，由水提醇沉而得干燥粉末，無菌水配置成100 mg/mL的母液，過濾除菌后于4 ℃長期保存。

1.3主要試劑達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium)：美國Invitrogen；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：美國Invitrogen；馬血清(horse serum，HS)：美國Hyclone；細(xì)胞黏附劑：普利萊，北京；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)：Dojindo，日本；青霉素-鏈霉素混合液：普利萊，北京。

2方法

2.1CCK法測定細(xì)胞活力收取預(yù)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min，離心5 min后用完全培養(yǎng)基(DMEM+10% HS+5% FBS)重懸成單細(xì)胞懸液，以每孔1 500的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后或次日加入石菖蒲水提物(設(shè)置6個濃度組，每組5個復(fù)孔)，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在檢測細(xì)胞活力前將培養(yǎng)基替換成無血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加入100 μL(含10 μL CCK-8試劑)，繼續(xù)37 ℃孵育1～4 h，采用多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力，檢測波長為450 nm，參考波長為630 nm。在低血清培養(yǎng)環(huán)境下檢測藥物對細(xì)胞增殖的作用時，采用低血清培養(yǎng)基(DMEM+1% HS+0.5% FBS)將細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，以每孔2 000的密度接種于96孔板中。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為促進(jìn)細(xì)胞分化，降低血清對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，且同時模擬神經(jīng)損傷后腦內(nèi)營養(yǎng)缺乏的環(huán)境，在觀察細(xì)胞形態(tài)時采用低血清培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。隨著血清濃度的下降，PC12細(xì)胞的死亡率將明顯升高，貼壁性進(jìn)一步下降[3]，因此采用細(xì)胞黏附劑對培養(yǎng)皿進(jìn)行提前包被，即用無菌水或者磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)將200倍的細(xì)胞黏附劑稀釋成1倍的工作液，按照試劑盒說明書將所述劑量加入至培養(yǎng)皿中，隨后在37 ℃繼續(xù)孵育0.5 h，用無菌水或者PBS清洗1～2遍后使用。

選擇對數(shù)期PC12細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min，離心5 min后用低血清培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，以每孔104的密度接種于預(yù)先采用細(xì)胞粘附劑包被的24孔板中。次日加入不同濃度的石菖蒲提取物，每組設(shè)3個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)胞形態(tài)并在顯微鏡下隨機(jī)選擇兩個視野進(jìn)行拍照，隨后采用Image J軟件統(tǒng)計PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。①梭形細(xì)胞率：梭形細(xì)胞(包含梭型、多角形及橢圓形細(xì)胞)占總細(xì)胞的百分比，觀察藥物對細(xì)胞形態(tài)的影響。②細(xì)胞分化率D1及細(xì)胞分化率D2：D1指長出突起的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，D2為長出突起數(shù)目>2的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，觀察藥物對細(xì)胞分化并長出突起的作用。③突起長度：每個視野選擇具有最長突起的20個細(xì)胞，統(tǒng)計其最長突起的平均長度，觀察藥物對突起延伸的作用。④陽性細(xì)胞分化率：突起長度>20 μm為陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，觀察藥物對突起延伸的作用。

3結(jié)果

3.1完全培養(yǎng)環(huán)境下石菖蒲水提物對細(xì)胞增殖的影響在完全培養(yǎng)環(huán)境下，濃度<1 000 mg/L的石菖蒲水提物對細(xì)胞活力并無抑制效果。與對照組比較，50、200、1 000 mg/L石菖蒲水提物均能明顯提高細(xì)胞活力(P<0.05)，其中200 mg/L的石菖蒲水提物作用效果最明顯(P<0.01)。見圖1。

注：含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P<0.05。

3.2 低血清培養(yǎng)環(huán)境下石菖蒲水提物對細(xì)胞形態(tài)的影響加入石菖蒲水提物后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，突起明顯減少甚至消失，細(xì)胞變圓，梭型細(xì)胞變少，胞體直徑相對較小，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。見圖2。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，與對照組比較，50～500 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯抑制細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮突蚨嘟切危?0～500 mg/L石菖蒲水提物能夠顯著降低細(xì)胞分化率D1，說明其能抑制細(xì)胞長出突起；10 mg/L及50～500 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯降低細(xì)胞分化率D2，說明藥物能夠顯著抑制細(xì)胞突起長出分支；100～500 mg/L石菖蒲水提物能夠顯著降低陽性細(xì)胞率，50～500 mg/L石菖蒲水提物還能明顯減少細(xì)胞突起長度，說明藥物能夠抑制細(xì)胞突起延伸。見表1。

圖2　低血清培養(yǎng)環(huán)境下石菖蒲水提物對細(xì)胞形態(tài)的影響(10×20倍)

注：同列含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P>0.05；同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P<0.05。3.3低血清培養(yǎng)環(huán)境下石菖蒲水提物對細(xì)胞增殖的影響低血清培養(yǎng)條件下，加入高濃度的石菖蒲水提物組細(xì)胞數(shù)量明顯增多。與對照組相比，50、100 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞活力(P<0.05)。見圖3。

注：含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P<0.05。

4討論

目前認(rèn)為，石菖蒲的主要成分在于揮發(fā)油中，通常采用揮發(fā)油或者β-細(xì)辛醚作為實(shí)驗(yàn)藥物，對水提液的研究尤其是在細(xì)胞水平上的研究甚少。但多個實(shí)驗(yàn)研究都證明，石菖蒲的水提液和揮發(fā)油成分均能改善學(xué)習(xí)記憶能力[4]，說明水提液及揮發(fā)油成分中均含有改善學(xué)習(xí)記憶能力的物質(zhì)。有文獻(xiàn)[5-6]報道，石菖蒲提取物能夠抑制缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其揮發(fā)油中的主要成分β-細(xì)辛醚作用于PC12細(xì)胞后，高濃度組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，突起結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞變圓，一定濃度的石菖蒲對PC12細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。從本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，石菖蒲水提物具有顯著的抑制細(xì)胞突起生長，促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，與文獻(xiàn)報道有一定的相似性，說明石菖蒲的水提物和揮發(fā)油均具有神經(jīng)營養(yǎng)的功能。石菖蒲的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其增強(qiáng)bcl-2基因的表達(dá)，防止神經(jīng)細(xì)胞變性有關(guān)[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)中石菖蒲水提物具有顯著抑制細(xì)胞突起生長、延伸的功能，可能與本實(shí)驗(yàn)采用的是石菖蒲的水提液有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，石菖蒲水煎劑可以顯著提高小鼠腦內(nèi)多巴胺和5-羥色胺的含量，說明石菖蒲水煎劑可能是通過降低單胺類神經(jīng)遞質(zhì)來起到鎮(zhèn)靜作用[9-10]。石菖蒲去油水煎液具有降低興奮性氨基酸，拮抗大鼠腦皮質(zhì)N-甲基-D-天冬氨酸受體與其配體的結(jié)合，清除自由基，阻止過氧化物形成的功能[11-13]，提示石菖蒲水提物改善學(xué)習(xí)記憶能力是從突觸功能可塑性及抗氧化應(yīng)激通路來實(shí)現(xiàn)的，可能并不通過改變突觸結(jié)構(gòu)可塑性這一通路。

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收稿日期：(2014-10-22；編輯：姚實(shí)林)

作者簡介：姚娜(1987-)，女，碩士，技師

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.022

基金項(xiàng)目：國家教育部博士點(diǎn)課題博導(dǎo)類項(xiàng)目(20120013110013)