線粒體形態(tài)學(xué)變化與急性缺血性卒中相關(guān)性的研究進(jìn)展

李俞辰，王永朋，戴家興，吳培，史懷璋

缺血性卒中病理生理過程中主要涉及的因素有氧化應(yīng)激、鈣超載、自噬和細(xì)胞凋亡等[1-3]。而神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)學(xué)變化在以上致病因素中均有著不容忽視的作用[3-4]。

線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，主要功能有產(chǎn)生能量，調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)，參與氧化磷酸化、神經(jīng)突觸的形成及細(xì)胞凋亡等[5-6]。作為高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，在不同的細(xì)胞活動(dòng)和外界刺激下，線粒體數(shù)量、分布及形態(tài)會(huì)發(fā)生頻繁的變化，目前研究證實(shí)線粒體的這些動(dòng)態(tài)變化主要是通過自身分裂、融合的形態(tài)學(xué)變化而實(shí)現(xiàn)的[7]。近年來，線粒體形態(tài)學(xué)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的相關(guān)研究逐漸增多。為此，本文就線粒體的分裂、融合，特別是其在缺血性卒中病理生理過程中的功能做一綜述。

1 線粒體的分裂與融合

1898年，德國(guó)科學(xué)家卡爾·本達(dá)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的一些結(jié)構(gòu)時(shí)而呈線狀時(shí)而呈顆粒狀，并將其命名為線粒體。之后的研究逐步揭示，線粒體是一個(gè)動(dòng)態(tài)、巨大的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并處于不斷的重組中，具有高度的可塑性[8]。一般情況下，由于線粒體分裂與融合活動(dòng)是同時(shí)進(jìn)行且速度基本相同從而能保持相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)和功能[7]。而病理?xiàng)l件下，這一動(dòng)態(tài)平衡將被破壞，當(dāng)分裂、融合中一方活性被抑制時(shí)，另一方活性將顯著增強(qiáng)，致使線粒體形態(tài)學(xué)平衡被破壞，并進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體的功能障礙，如能量生成障礙、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加和細(xì)胞凋亡異常增強(qiáng)等[9-10]。

分裂與融合各自的功能具有既互補(bǔ)又獨(dú)立的特性，并受到多種蛋白質(zhì)的精細(xì)調(diào)節(jié)[6]，其中分裂可以增加線粒體的數(shù)量和分布，對(duì)于調(diào)控細(xì)胞不同部位的鈣離子水平、膜電位的維持及神經(jīng)元細(xì)胞器的運(yùn)輸?shù)扔兄匾饬x[11]，調(diào)節(jié)分裂活動(dòng)的蛋白質(zhì)主要有：Drp1和Fis1等[12]。而融合則可促進(jìn)各類細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞、膜電位的傳導(dǎo)及線粒體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的互補(bǔ)修復(fù)等[13-14]，調(diào)節(jié)融合活動(dòng)的蛋白質(zhì)主要有：Mfn1、Mfn2、Opa1及Ugo1等[15]。除以上提到的蛋白外，Bcl-2蛋白家族，如Bax、Bcl-2及Bif-1也參與線粒體分裂、融合的調(diào)節(jié)。Wang[16]和Grohm[4]等已證實(shí)，Bcl-2蛋白家族主要通過與Drp1等分裂、融合蛋白的協(xié)同作用，對(duì)線粒體的形態(tài)產(chǎn)生影響。

2 線粒體分裂、融合與急性缺血性卒中發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性

人類神經(jīng)元能量需求高，并承擔(dān)著興奮的產(chǎn)生與傳導(dǎo)，遞質(zhì)的釋放與結(jié)合，以及穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境等多種功能，而線粒體作為與細(xì)胞功能息息相關(guān)的細(xì)胞器，對(duì)神經(jīng)元尤為重要，特別在各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，線粒體將參與整個(gè)損傷、應(yīng)激及修復(fù)過程中[17]。

急性缺血性卒中損傷不僅能同時(shí)上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和自噬，還可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量的ROS，而且通過對(duì)Ca2+分布的影響造成線粒體內(nèi)鈣超載[18]，但有研究認(rèn)為線粒體的分裂增加可能是上述損傷機(jī)制的上游事件[19]。經(jīng)Lackner等[20]證實(shí)，促進(jìn)線粒體融合或抑制線粒體分裂可以減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，在大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，抑制線粒體分裂，可使腦組織的梗死面積明顯減小[17，21]。綜上可知，線粒體形態(tài)學(xué)異常在缺血性卒中的病理生理過程中具有關(guān)鍵性作用。

2.1 線粒體分裂、融合與氧化應(yīng)激 線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)和氧消耗的主要場(chǎng)所，并且是ROS的主要來源及作用位點(diǎn)[22]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除失衡。過量的ROS將造成DNA、蛋白質(zhì)的合成障礙，脂質(zhì)過氧化乃至細(xì)胞凋亡[23]。線粒體分裂、融合與氧化應(yīng)激及其所致的細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。正常機(jī)體中，線粒體內(nèi)含有多種抗氧化酶類，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），特別是錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD），能夠大量地消除ROS，對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷[12]。

體外的糖氧剝奪模型（oxygen-glucose deprivation，OGD）和體內(nèi)的腦組織缺血再灌注實(shí)驗(yàn)（ischemia/reperfusion，I/R）都是用來模擬人類缺血性卒中的病理生理過程，且有關(guān)二者的研究均證實(shí)，無論是氧化應(yīng)激反應(yīng)本身還是線粒體分裂活動(dòng)增加，均可使ROS產(chǎn)生增多，SOD含量降低，進(jìn)一步惡化氧化應(yīng)激所造成的損傷甚至引起細(xì)胞凋亡[19，24]。Tian等[25]通過使用Drp1的選擇性抑制劑Mdivi1作用于體外的OGD和再灌注模型，可以顯著地降低線粒體內(nèi)ROS水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，在ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中起到保護(hù)作用。由此可見，急性卒中后，線粒體的分裂活動(dòng)增強(qiáng)，與氧化應(yīng)激損傷之間有密切的聯(lián)系，并且二者可協(xié)同作用，造成細(xì)胞凋亡及組織損傷。

2.2 線粒體分裂、融合與鈣超載 1981年有研究就已發(fā)現(xiàn)Ca2+可誘導(dǎo)線粒體出現(xiàn)片段化現(xiàn)象。隨后的研究證實(shí)，Ca2+可通過介導(dǎo)Drp1的磷酸化和去磷酸化作用來影響線粒體的分裂、融合平衡，其中細(xì)胞內(nèi)的Ca2+可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CN），也稱蛋白磷酸酶2B（protein phosphatase 2B，PP2B），引起Drp1的磷酸化及向線粒體外膜的聚集，促進(jìn)線粒體的分裂，間接影響細(xì)胞的存亡[26-27]。另外，某些促細(xì)胞凋亡刺激，如過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）和花生四烯酸等，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）向線粒體釋放，引發(fā)線粒體內(nèi)鈣超載和Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)程序[28]。Han等[29]對(duì)神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可以通過電壓依賴性鈣離子通道（voltage-dependent calcium channels，VDCC）進(jìn)入細(xì)胞，然后激活Ca2+／鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Iα，誘導(dǎo)線粒體活動(dòng)停止和分裂增加。

在PC12細(xì)胞的OGD模型中，Ca2+顯像和免疫熒光掃描結(jié)果顯示，通過使用Drp1選擇性抑制劑抑制線粒體分裂后，雖然細(xì)胞質(zhì)中Ca2+水平無明顯變化，但可以顯著降低ER中Ca2+的釋放和線粒體中Ca2+的攝取，一定程度上防止了鈣超載損傷的出現(xiàn)[25]。但先前Szabadkai等[30]研究顯示Drp1促進(jìn)線粒體分裂的同時(shí)，可影響線粒體內(nèi)Ca2+的升高，并減輕鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此Ca2+分布與線粒體形態(tài)之間的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

此外Ca2+信號(hào)還可以通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)線粒體的分裂、融合，例如新近發(fā)現(xiàn)的Miro三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶類（主要是Miro1和Miro2），正常情況下，Miro1/2能促進(jìn)線粒體的融合，但在高Ca2+濃度的情況下則會(huì)加快線粒體分裂[15]。

2.3 線粒體分裂、融合與細(xì)胞凋亡 缺血性卒中的多種致病機(jī)制最終都能引起細(xì)胞的凋亡，并且這種增強(qiáng)的凋亡變化與線粒體分裂、融合失衡密切相關(guān)[31-32]。體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)，急性腦缺血再灌注損傷中，線粒體分裂的增加可以促進(jìn)細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的活化、釋放及細(xì)胞凋亡[33]。在神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究中，Cyt-C的活化被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑和Caspase介導(dǎo)凋亡途徑的關(guān)鍵一步，Cyt-C是呼吸鏈的重要組成部分，胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C水平的升高，會(huì)促進(jìn)凋亡小體的形成[凋亡蛋白酶活化因子1，caspase-9酶原和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等組成]，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體呼吸活性的喪失和后續(xù)的級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)[34]。

調(diào)控Cyt-C釋放的因素很多，目前研究較多的是Bax蛋白和線粒體分裂、融合蛋白如Opa1、Drp1等。Bax蛋白除可促進(jìn)Cyt-C釋放啟動(dòng)凋亡反應(yīng)外，在細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)，還可與增加的Drp1蛋白協(xié)同作用于線粒體外膜，促進(jìn)線粒體分裂，間接啟動(dòng)凋亡[4]。Bax和Drp1蛋白還可使線粒體外膜的通透性增加，促進(jìn)Cyt-C的釋放[24]。使用Opa1si RNA抑制Opa1表達(dá)可引起線粒體的片段化，并能觀察到Cyt-C釋放和細(xì)胞凋亡增加[35]，相反，通過Drp1抑制劑（Mdivi1）可以降低線粒體的片段化，減少細(xì)胞色素C的釋放、凋亡蛋白的活化及細(xì)胞凋亡[7，36]，其他分裂、融合蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持類似的結(jié)論。另外，線粒體分裂、融合失衡也與上述鈣超載，氧化應(yīng)激相互促進(jìn)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。凋亡早期線粒體就已發(fā)生顯著的片段化，線粒體的分裂、融合蛋白參與細(xì)胞凋亡，調(diào)控凋亡的分子也能夠改變線粒體的形態(tài)[32]。

2.4 線粒體分裂融合與線粒體自噬 自噬在急性缺血性卒中的早期就已出現(xiàn)，其具體功能還存在爭(zhēng)議。一方面，自噬是細(xì)胞自體修復(fù)的重要過程，可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)而使細(xì)胞避免受到進(jìn)一步損傷[37]；另一方面，有的研究顯示，缺血缺氧損害后，自噬又可與凋亡信號(hào)產(chǎn)生交互協(xié)同作用，這一作用能加重海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。

線粒體同樣存在自噬，即受損或過剩線粒體的選擇性清除過程，并受胞內(nèi)各種因素的精密調(diào)節(jié)，是細(xì)胞清除損傷線粒體和維持自身穩(wěn)態(tài)的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制[38]。線粒體分裂增加使線粒體數(shù)量增多，可以促進(jìn)線粒體自噬，而自噬的激活又能增強(qiáng)線粒體的分裂，無論是過度的自噬還是線粒體分裂都可進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。

Drp1磷酸化對(duì)線粒體的分裂和自噬有顯著促進(jìn)作用，在有關(guān)小鼠線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）實(shí)驗(yàn)中，研究者可以檢測(cè)到Drp1磷酸化作用逐漸增強(qiáng)并在模型成功后14 d達(dá)到高峰[31]，也就代表著線粒體自噬在這期間也存在活性增強(qiáng)的過程。Cavallucci等[39]用哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑雷帕霉素作用于腦損傷的體外模型，可以得到線粒體自噬和分裂都增強(qiáng)的結(jié)果，并高度懷疑是自噬誘導(dǎo)線粒體分裂的增強(qiáng)，但卒中時(shí)線粒體形態(tài)變化與自噬的確切關(guān)系還有待證實(shí)。

急性缺血性卒中的缺血半暗帶，一直是醫(yī)生治療和改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[18]。不斷積累的科研成果，使醫(yī)生對(duì)線粒體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)逐漸深入，線粒體分裂融合是細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特而復(fù)雜的過程，其在卒中病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，眾多研究也通過使用Mdivi1等抑制劑來降低線粒體分裂水平，多數(shù)得到了如Cyt-C釋放減少、氧化應(yīng)激損傷減輕和細(xì)胞凋亡緩解等良好效果。然而，其具體機(jī)制目前尚不能確切闡明，特別是其在出血性卒中領(lǐng)域的研究目前還很少。因此，未來需要醫(yī)學(xué)研究人員對(duì)線粒體分裂融合機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以期為今后各類疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

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