卵巢癌組織中miRNA-204表達變化及其對細胞株SKOV3凋亡的影響

張偉熙，李家福，周春(武漢大學中南醫(yī)院，武漢430071)

卵巢癌組織中miRNA-204表達變化及其對細胞株SKOV3凋亡的影響

張偉熙，李家福，周春
(武漢大學中南醫(yī)院，武漢430071)

摘要:目的觀察卵巢癌組織中微小RNA-204( miR-204)表達變化，以及miR-204對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響。方法選擇卵巢癌患者50例，分別取其卵巢癌及相應癌旁組織;體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞，隨機分為1、2、3組，分別加入轉染試劑、陰性對照載體、化學合成的雙鏈miRNA-204表達載體;采用實時熒光定量PCR( qRTPCR)法檢測組織及細胞中miRNA-204相對表達量;觀察miRNA表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系;采用流式細胞儀檢測卵巢癌SKOV3細胞凋亡情況。結果卵巢癌組織中miR-204 mRNA相對表達量低于癌旁組織( P＜0.01) ; miR-204 mRNA表達與FIGO分期、淋巴結轉移、CA125水平相關( P均＜0.05)。1、2、3組miRNA-204 mRNA相對表達量分別為2.35±0.67、2.01±0.45、5.32±0.88，3組較1、2組增加( P均＜0.05) ;細胞凋亡率分別為7.32%±1.40%、5.14%±1.90%、52.4%±9.10%，3組較1、2組增加( P均＜0.05)。結論卵巢癌組織中miRNA-204表達下調，且與病情進展相關; miRNA-204促進卵巢癌細胞凋亡，這可能是其發(fā)揮抑癌作用的機制之一。

關鍵詞:卵巢腫瘤;卵巢癌;卵巢癌SKOV3細胞株;微小RNA-204;細胞凋亡

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)病死率最高的惡性腫瘤，早期無癥狀，缺乏有效的篩查手段，近70%的卵巢癌患者確診時已屬晚期，5年生存率低于30%［1］。CA125是目前卵巢癌診斷和預后判斷最常用的血清標志物，但是CA125僅在50%的早期和70%～90%的晚期卵巢癌患者血清中增高，缺乏診斷特異性和敏感性［2］。微小RNA( microRNA)在腫瘤組織中性質穩(wěn)定、功能廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-204 ( miR-204)在子宮內膜樣腺癌［3］、鼻咽癌［4］等腫瘤組織中表達明顯降低，并與臨床病理特征及預后相關;上調腫瘤細胞中miR-204，可以促進腫瘤細胞凋亡、抑制遷移、增加對化療藥物的敏感性。但是，miR-204與卵巢癌的關系尚無相關報道。本研究觀察卵巢癌組織中miR-204表達變化，以及miR-204對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2006年1月～2008年1月武漢大學中南醫(yī)院收治的卵巢癌患者50例，年齡32 ～75歲、平均54歲;均行手術治療，均未接受化療或放療;分別取其卵巢癌組織和相應的癌旁組織。手術切除標本立即放入液氮中保存，隨后轉入－80℃冰箱保存。

1.2細胞培養(yǎng)及分組卵巢癌SKOV3細胞株(上海細胞研究所)培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)液為含100 mg/mL鏈霉素、10%小牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。收集對數(shù)生長期SKOV3細胞，PBS沖洗3次，1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞密度為4×104/mL，轉移細胞至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h后，隨機分為1、2、3組，分別加入轉染試劑、陰性對照載體、化學合成的雙鏈miRNA-204表達載體，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3卵巢癌組織及細胞中miRNA-204 mRNA檢測

采用實時熒光定量PCR法。取凍存卵巢癌及其癌旁正常組織和三組轉染后培養(yǎng)48 h的SKOV3細胞，加入TRIzol抽提RNA，按照Prime-ScriptTM逆轉錄試劑盒( TaKaRa公司)說明書逆轉錄成cDNA;取cDNA進行qRT-PCR檢測。反應條件: 95℃預變性20 s; 95℃10 s，60℃20 s，共40個循環(huán); 70℃延伸10 s。引物序列［4］: miRNA-204: (正義) 5'-AACCUGAUCCCGUCUGAGAUUG-3'，(反義) 5'-CCGGAUCAAGAUUAGUUCGGUU-3';內參β-actin: (正義) 5'-AGCGGGTCTGACGTAAAGCGA-3'，(反義) 5'-GTGGACGGGAGAGGACTGG-3'。采用2－ΔΔCt方法檢測miRNA-204 mRNA相對表達量。卵巢癌組織中miRNA-204 mRNA相對表達量＜2.34為低表達，≥

2.34為高表達。

1.4細胞凋亡情況檢測三組SKOV3細胞轉染后培養(yǎng)48 h，分別取5×104～10×104重懸細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。隨后加入5 μL Annexin VFITC，混勻，4℃避光孵育15 min。加入5 μL碘化丙啶染色液，混勻，4℃避光孵育5 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算凋亡率。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，比較采用Student's t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

卵巢癌組織中miR-204 mRNA相對表達量為2.34±0.92，癌旁組織為5.74±1.59;兩者比較，P ＜0.01。miR-204 mRNA表達水平與卵巢癌FIGO分期、淋巴結轉移、CA125水平相關( P均＜0.05)，與年齡、組織學分級、有無腹腔積液無關( P均＞0.05)，見表1。1、2、3組miRNA-204 mRNA相對表達量分別為2.35±0.67、2.01±0.45、5.32±0.88，3組較1、2組增加( P均＜0.05) ;細胞凋亡率分別為7.32%±1.40%、5.14%±1.90%、52.4%± 9.10%，3組較1、2組增加( P均＜0.05)。

表1　 miR-204 mRNA相對表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系(例)

3　討論

盡管卵巢癌的發(fā)病機制在蛋白及基因水平得到深入認識，手術、放化療等為主的綜合治療有了長足的發(fā)展，但卵巢癌的早期診斷和預后沒有明顯進展。microRNA是一種長18～25個核苷酸的小分子單鏈RNA，可與靶信使RNA的3'非翻譯區(qū)( 3'UTR)結合，通過誘導的沉默復合物抑制或降解靶信使RNA的翻譯，負性調節(jié)靶基因轉錄后水平［5，6］。研究證實，microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程［7，8］;有多種microRNA在卵巢細胞及組織中表達上調或下調，可作為卵巢癌的癌基因或抑癌基因，在卵巢癌細胞生長、分化、浸潤及轉移過程中發(fā)揮中至關重要的作用［9～11］。

miR-204作為一種新的抑癌或致癌基因，在不同腫瘤細胞中功能不同，其主要通過誘導靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，調控相關靶基因表達，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程［12］。miR-204在前列腺癌中作為一種癌基因，在腫瘤組織或細胞中高表達，促進癌細胞增殖、轉移;腫瘤組織中的miR-204與臨床分期及預后明顯相關，其高表達是提示預后差的獨立影響因素;通過小干擾RNA沉默miR-204的表達可以促進前列腺癌細胞的凋亡［13］。在子宮內膜癌組織中miR-204表達下調，作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與臨床病理特征和預后相關［3］。通過轉染上調miR-204在頭頸部鱗狀上皮細胞癌細胞株中的表達，可以抑制癌細胞的增殖和轉移［14］。但是，miR-204在卵巢癌中的表達、功能目前尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織miR-204相對表達量低于癌旁組織，提示miR-204可能作為一種抑癌基因參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步對卵巢癌患者臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-204表達與FIGO分期、淋巴結轉移、CA125水平相關。從細胞水平對miR-204在卵巢癌中的功能或作用機制進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉染miR-204至卵巢癌SKOV3細胞后，上調miR-204可以促進細胞凋亡。但是，miR-204通過何種機制促進細胞凋亡，還需要進一步研究。

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收稿日期:( 2014-10-23)

通信作者:周春，E-mail: zhouchun6@126.com

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0055-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.024