蓮子紅皮多糖抗氧化與抑菌活性研究

薛淑靜　楊德　李露　何建軍　關(guān)健　曾予　王肖莉

摘要：以蓮子（Semen nelumbinis）紅皮磨皮粉為原料提取多糖，研究其抗氧化性及抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)蓮子紅皮多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除率達(dá)96.29%，對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除率為41.79%，蓮子紅皮多糖的體外抗氧化活性低于維生素C；抑菌試驗(yàn)表明，蓮子紅皮多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，最小抑菌濃度為20 mg/mL，在酸性條件下的抑菌作用更明顯，且對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用比金黃色葡萄球菌強(qiáng)，對(duì)黃曲霉和黑曲霉沒(méi)有抑菌作用。

關(guān)鍵詞：蓮子（Semen nelumbinis）；紅皮多糖；抗氧化性；抑菌性

中圖分類號(hào)：S682.32；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6342-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.064

Abstract：The antioxidant and antimicrobial activities of the polysaccharides from red skin of locus seed were assessed in this paper. The study found that the polysaccharide on hydroxyl free radical （·OH） removal effect reached 96.29%， the highest DPPH· free radical （DPPH·） scavenging effect reached 41.79%. Through comparing with VC， the polysaccharide on free radical clearance rate was lower. The polysaccharide from red skin of locus seed had a strong antibacterial effect on the bacteria with the minimum inhibitory concentration of 20 mg/mL. Meanwhile，the antibacterial effect was stronger under acidic condition. The effect on colibacillus was more obvious than Staphylococcus aureus. And the fungus had no antibacterial effect on Aspergillus favus and Aspergillus niger.

Key words：Semen nelumbinis；polysaccharide from red skin of locus seed；antioxidant activity；antimicrobial activity

蓮子（Semen nelumbinis）是睡蓮科植物蓮的果實(shí)和種子。蓮子是補(bǔ)脾止瀉、益腎澀精、養(yǎng)心安神的常用中藥，也是民間常用的滋補(bǔ)品。蓮子含有豐富的多糖、磷脂、生物堿和類黃酮等營(yíng)養(yǎng)保健成分，列入中國(guó)衛(wèi)生部公布的首批既是食品又是藥品的品種名單[1]。

蓮子的加工一般要經(jīng)過(guò)干燥、分級(jí)、去殼、除皮去心等工序，去皮一般采用手工除皮和機(jī)械磨皮兩種方式。這兩種去皮工藝生產(chǎn)率較低，損耗高。例如采用機(jī)械磨皮法，每加工100 kg紅蓮，就會(huì)磨去約15 kg紅皮粉，目前這層紅皮粉尚無(wú)有效的利用方式，由于味澀甚至不能作為牲畜飼料，只能大量堆于田間地頭[2]。這些加工副產(chǎn)物蓮皮粉含有多糖、黃酮、生物堿等多種生物活性成分，若能有效地開(kāi)發(fā)利用，將變廢為寶。

陳軒等[1]對(duì)蓮子皮的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析，徐虹等[2，3]報(bào)道了從蓮皮粉中提取多糖和蛋白質(zhì)的工藝研究，多糖和蛋白質(zhì)得率分別為8.42%、30.75%；王超等[4]用草酸銨溶液作為提取溶劑提取了紅湘蓮蓮皮粉中的果膠多糖。而關(guān)于蓮子紅皮多糖抗氧化活性和抑菌作用研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以蓮子磨皮粉為原料，提取其水溶性多糖，考察了蓮子紅皮多糖對(duì)羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）的清除率，以及蓮子紅皮多糖對(duì)黑曲霉（Aspergillus nige）、黃曲霉（Penicillium Chrysogenum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylosocus aureus）的抑菌活性，以期為蓮子磨皮粉的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 蓮子紅皮磨皮粉由湖北省洪湖市晨光實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.1.2 供試菌種 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；真菌：黃曲霉、黑曲霉均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、酵母浸膏、牛肉浸膏均為生化試劑；苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、抗壞血酸、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZM-80KCS，上海申安醫(yī)療器械廠）、恒溫恒濕箱（HPX160BSH-TV，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（752，上海光譜儀器有限公司）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂10 g、水500 mL，pH 7.0。

2）馬鈴薯-葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（PDA）。馬鈴薯300 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。取馬鈴薯切塊，加水1 000 mL，加熱煮沸25～30 min后補(bǔ)足失水至所需體積，加入葡萄糖、瓊脂，繼續(xù)加熱溶化并補(bǔ)足失水。

3）葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基。葡萄糖5 g、蛋白胨6 g、酵母浸膏6 g、牛肉浸膏1.5 g、吐溫80 0.1%、瓊脂20 g、水1000 mL，pH 7.4。

1.3.2 蓮子紅皮多糖的提取與含量測(cè)定 以蓮子紅皮磨皮粉為原料，參照文獻(xiàn)[2]水提醇沉法提取蓮子紅皮多糖。采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定蓮子紅皮多糖含量[5]。

1.3.3 蓮子紅皮多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用 稱取干燥的蓮子紅皮多糖樣品1.0 g用蒸餾水溶解，定容至100 mL，制得10.0 mg/mL樣品多糖液。采用Fenton試劑制備羥自由基。取0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mL樣品多糖液，再依次加入9 mmol/L FeSO4 1 mL、9 mmol/L 水楊酸-乙醇1 mL、8.8 mmol/L H2O2 1 mL[6]。以蒸餾水代替H2O2測(cè)本底吸光度AR。將空白對(duì)照、本底組、樣品組在37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，在510 nm處測(cè)量3組反應(yīng)液的吸光度，按照公式（1）計(jì)算清除率E。同時(shí)用0.5 mg/mL濃度的維生素C（VC）水溶液作樣品對(duì)照試驗(yàn)。

E=1-■×100% （1）

式中，E為羥自由基（·OH）的清除率（%）；AS為加入樣品的吸光度；AR為本底吸光度；A0為空白對(duì)照的吸光度。

1.3.4 蓮子紅皮多糖對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 取6.5×10-3 mmol/L DPPH-60%乙醇溶液4.5 mL，分別加入不同濃度多糖提取液0.5 mL，混勻，反應(yīng)30 min，于517 nm測(cè)定吸光度AS。同時(shí)，測(cè)定樣品溶液0.5 mL與60%乙醇4.5 mL混合液在517 nm處的吸光度AR，再測(cè)定4.5 mL DPPH-60%乙醇溶液與0.5 mL 60%乙醇在517 nm處的吸光度A0[7]。按照公式（2）計(jì)算清除率E。同時(shí)用0.01 mg/mL濃度的VC水溶液作樣品對(duì)照試驗(yàn)。

E=1-■×100% （2）

1.3.5 蓮子紅皮多糖的抑菌效果 將熔化好的培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)約25 mL（培養(yǎng)皿底約一半高度），待其凝固，用移液槍吸取0.5 mL供試菌懸液加到上述平板中，用無(wú)菌玻璃刮鏟涂布均勻。在平板底部標(biāo)記藥液濃度后，用無(wú)菌鑷子將牛津杯按標(biāo)記位置放置在培養(yǎng)基上，用移液槍在相對(duì)應(yīng)的牛津杯中加入不同濃度的藥液（用無(wú)菌水配制的濃度為10、20、30、40、50 mg/mL的蓮子紅皮多糖溶液）0.2 mL，以生理鹽水為空白對(duì)照，在最適溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培16～18 h，黑曲霉、黃曲霉在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d）。取出測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，比較不同濃度蓮子紅皮多糖的抑菌效果[8]。

1.3.6 pH對(duì)蓮子紅皮多糖抑菌活性的影響 選擇抑菌效果最好的蓮子紅皮多糖液10 mL，根據(jù)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)pH范圍在4～8之間，黑曲霉、黃曲霉的最適生長(zhǎng)pH范圍在6～8之間，用1 mol/L 鹽酸和0.1 mol/L NaOH 配制成pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的多糖溶液[9]。在平板底部標(biāo)記藥液pH后，用無(wú)菌鑷子將牛津杯按標(biāo)記位置放置在培養(yǎng)基上，用移液槍在相對(duì)應(yīng)的牛津杯中加入不同pH的藥液0.2 mL，以生理鹽水為空白對(duì)照，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌置37 ℃培養(yǎng)16～18 h，黑曲霉、黃曲霉在28 ℃的中培養(yǎng)2～3 d）。取出測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，比較不同pH對(duì)蓮子紅皮多糖的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子紅皮多糖的抗氧化性

2.1.1 蓮子紅皮多糖對(duì)·OH的清除作用 不同濃度蓮子紅皮多糖對(duì)·OH的吸光度A，按照公式（1）計(jì)算清除率E，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，蓮子紅皮多糖對(duì)·OH有一定的清除作用。隨著多糖濃度的不斷增加，對(duì)·OH的清除作用呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，多糖濃度6.0 mg/mL時(shí)，趨勢(shì)漸緩；多糖濃度10.0 mg/mL時(shí)清除率最高，達(dá)到96.29%。

2.1.2 VC對(duì)·OH的清除作用 不同濃度VC對(duì)·OH的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。VC對(duì)·OH有很強(qiáng)的清除作用，隨著VC濃度的不斷增加，對(duì)·OH的清除作用呈現(xiàn)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，在濃度為0.4 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到100%。相同濃度的蓮子紅皮多糖對(duì)羥自由基清除作用較VC弱。

2.1.3 蓮子紅皮多糖對(duì)DPPH·的清除作用 不同濃度蓮子紅皮多糖對(duì)DPPH·的吸光度A按照公式（2）計(jì)算清除率E，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，蓮子紅皮多糖對(duì)DPPH·有清除作用，多糖濃度在0～120 μg/mL時(shí)清除作用隨濃度的增大呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在120 μg/mL時(shí)最大，達(dá)到41.79%，之后清除率呈下降趨勢(shì)。

2.1.4 VC對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 不同濃度VC對(duì)DPPH·的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著VC濃度的不斷增大，對(duì)DPPH·的清除作用呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，在10 μg/mL時(shí)清除率達(dá)到了57.63%。相同濃度的蓮子紅皮多糖對(duì)DPPH自由基清除作用低于VC。

2.2 蓮子紅皮多糖的抑菌作用

2.2.1 蓮子紅皮多糖對(duì)黃曲霉和黑曲霉的抑菌作用 黃曲霉和黑曲霉通過(guò)28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察未出現(xiàn)抑菌圈，結(jié)果見(jiàn)圖5（圖中空白、20、100 mg/mL分別編號(hào)為0、1、2）。因此，蓮子紅皮多糖液對(duì)黃曲霉和黑曲霉沒(méi)有抑菌作用。

2.2.2 蓮子紅皮多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌作用 通過(guò)37 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)大腸桿菌24 h后，觀察多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用并測(cè)量抑菌圈的直徑，結(jié)果見(jiàn)圖6（圖中空白、20、40、60、80、100 mg/mL分別編號(hào)為0、1、2、3、4、5）。由圖6可知，空白組未出現(xiàn)抑菌圈，蓮子紅皮多糖濃度20 mg/mL時(shí)，抑菌圈出現(xiàn)。因此，蓮子紅皮多糖對(duì)大腸桿菌有抑制作用，最小抑菌濃度為20 mg/mL，且隨多糖濃度增加，抑菌圈增大，試樣中多糖濃度100 mg/mL的試樣抑菌性最強(qiáng)。

2.2.3 蓮子紅皮多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用 通過(guò)37 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌24 h后，觀察多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用并測(cè)量抑菌圈的直徑，結(jié)果見(jiàn)圖7（圖中濃度空白、20、40、60、80、100 mg/mL分別編號(hào)為0、1、2、3、4、5）。空白組未出現(xiàn)抑菌圈，蓮子紅皮多糖濃度20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)抑菌效果。因此，蓮子紅皮多糖對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，最小抑菌濃度為20 mg/mL，且隨多糖濃度增加，抑菌圈增大，試樣中多糖濃度100 mg/mL的試樣抑菌性最強(qiáng)。

2.3 pH對(duì)蓮子紅皮多糖抑菌作用的

根據(jù)不同濃度蓮子紅皮多糖的抑菌研究可知多糖對(duì)真菌無(wú)抑菌性，濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌最強(qiáng)抑制性濃度為100 mg/mL。已知適合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的pH為4～8（最適pH為6～8），在該范圍將100 mg/mL糖液制成不同pH進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)37 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察不同pH蓮子紅皮多糖液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用。

2.3.1 對(duì)大腸桿菌抑菌作用 經(jīng)過(guò)37 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察不同pH蓮子紅皮多糖溶液對(duì)大腸桿菌的抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8（圖中pH 4、5、6、7、8編號(hào)分別為4、5、6、7、8）。在大腸桿菌適合生長(zhǎng)pH 4～8范圍內(nèi)，100 mg/mL蓮子紅皮多糖在pH 4時(shí)對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，隨著pH的升高，抑菌圈直徑呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。

2.3.2 對(duì)金黃色葡萄球菌作用 經(jīng)過(guò)37 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察不同pH的蓮子紅皮多糖溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9（圖中pH 4、5、6、7、8分別編號(hào)為4、5、6、7、8）。在金黃色葡萄球菌適合生長(zhǎng)pH 4～8范圍內(nèi)，100 mg/mL蓮子紅皮多糖溶液在pH 4時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最顯著，隨著pH的升高，抑菌圈直徑呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。不同pH蓮子紅皮多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用比較見(jiàn)表1。由表1可知，在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌適合生長(zhǎng)pH 4～8范圍內(nèi)，隨著pH增大，抑菌圈的直徑變小，說(shuō)明蓮子紅皮多糖在偏酸性條件下的抑菌作用較強(qiáng)。在pH>4時(shí)，100 mg/mL蓮子紅皮多糖溶液對(duì)大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，在pH 4時(shí)，100 mg/mL蓮子紅皮多糖溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制較強(qiáng)。

3 小結(jié)

蓮子紅皮多糖對(duì)·OH和DPPH·有明顯的清除作用。蓮子紅皮多糖對(duì)·OH清除率可達(dá)96.29%，且隨多糖濃度增加清除率增大；在0～120 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除作用隨濃度增加而增強(qiáng)，濃度大于120 μg/mL時(shí)，清除率下降，120 μg/mL時(shí)清除率最高，達(dá)41.79%。通過(guò)比較，蓮子紅皮多糖的體外抗氧化活性略低于VC。

蓮子紅皮多糖對(duì)黃曲霉和黑曲霉沒(méi)有明顯的抑菌作用；對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，最小抑菌濃度為20 mg/mL，隨多糖濃度增加，抑菌圈變大，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，最大濃度100 mg/mL時(shí)抑菌圈最大；蓮子紅皮多糖在酸性條件下的抑菌作用較好；且在酸性條件下對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用比金黃色葡萄球菌強(qiáng)。

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