多菌種發(fā)酵豆粕的篩選試驗

■宋春陽 李少寧 聶昌林

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島266109）

豆粕是飼料工業(yè)中應用最為廣泛的植物性蛋白原料，但其中存在的多種抗營養(yǎng)因子，降低了動物對豆粕營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。目前，消除大豆粕中抗營養(yǎng)因子的主要方法有物理加熱法、化學處理法和微生物處理法[1]。用微生物發(fā)酵法處理豆粕可以有效地去除豆粕中抗營養(yǎng)因子，并降解大分子蛋白質(zhì)生成小肽，同時還可生成多種益生菌，積累有益的微生物代謝產(chǎn)物，最終得到具有多種功能的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料——發(fā)酵豆粕。國內(nèi)外有大量研究表明，經(jīng)微生物發(fā)酵處理的發(fā)酵豆粕抗營養(yǎng)因子含量少、富含小分子大豆肽、消化酶、維生素和未知生長因子[2]，是優(yōu)于其他大豆產(chǎn)品的多功能優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料。

發(fā)酵豆粕是經(jīng)微生物發(fā)酵制得的一種蛋白類飼料。目前，市場上多為乳酸菌發(fā)酵的豆粕產(chǎn)品。發(fā)酵豆粕與普通豆粕的營養(yǎng)成分差異主要包括蛋白質(zhì)含量、粗纖維含量、總消化能和抗營養(yǎng)因子含量等[3]。發(fā)酵豆粕經(jīng)微生物的發(fā)酵作用，抗營養(yǎng)因子的含量有極大程度的下降[4]；發(fā)酵豆粕pH值較低，酸化可以激活胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶、麥芽糖酶和乳糖酶等的活性，提高飼料的消化吸收效率；經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用，豆粕中的大分子蛋白有很大一部分變成了更容易消化吸收的小分子蛋白或小肽，而且這些小肽中還有一部分是具有抗菌活性的抗菌肽，其可以使仔豬免受有害病菌的侵害，從而保護仔豬更加健康地成長[5]；發(fā)酵豆粕的氨基酸比例也比豆粕更加的均衡，更有利于仔豬的生長；發(fā)酵豆粕還可以螯合一些微量元素、維生素等，減少流失，提高其利用率[6]。在發(fā)酵豆粕初期，主要是利用單一菌種來發(fā)酵豆粕，單一菌種發(fā)酵豆粕簡單方便，具有一定的作用,多菌種發(fā)酵研究較少。本試驗選用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌作為發(fā)酵菌種，分別從A、B、C、D 4個不同的公司均購買乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌三種菌種，通過單菌種篩選試驗選出本試驗所用的合適菌種，再通過正交試驗篩選出三種菌的最佳比例以達到最好的發(fā)酵豆粕制作效果，以期為發(fā)酵豆粕在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌為發(fā)酵豆粕的菌種。分別從A、B、C、D 4個不同的公司均購買乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌三種菌種，通過前期單菌種篩選試驗，對比乳酸產(chǎn)量、酸溶蛋白含量、蛋白酶酶活、粗蛋白含量，確定本試驗所用的乳酸桿菌活菌數(shù)為2×109U/g（購自C公司），酵母菌活菌數(shù)為20×109U/g（購自C公司），枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為100×109U/g（購自D公司），豆粕為生豆粕。通過前期探索試驗得出適宜的發(fā)酵參數(shù)見表1。

表1 發(fā)酵參數(shù)

1.2 試驗設備和試劑

1.2.1 試驗設備

分析天平：精度0.000 1 g；恒溫水浴鍋：精度±0.2℃；752型分光光度計；pHS-3C型pH計，0.01pH單位；離心機：3 000 r/min；凱氏定氮儀。

1.2.2 試驗試劑

乳酸緩沖液（pH=3.0）；0.4 mol/l碳酸鈉溶液；0.5 mol/l的NaOH溶液；10.00 mg/l干酪素溶液；100 μg/ml酪氨酸標準溶液；400 g/l NaOH溶液；硼酸吸收液；0.05 mol/l HCl溶液。10%三氯乙酸溶液。

1.3 試驗設計

按正交表L16（43）設計試驗發(fā)酵豆粕，因素水平見表2。

表2 發(fā)酵豆粕菌種配比L16（43）正交試驗因素水平

通過測定發(fā)酵后豆粕的pH值、酸溶蛋白的量、蛋白酶酶活，從中選出最優(yōu)組合及其最佳比例。發(fā)酵豆粕正交表L16（43）見表3。

表3 發(fā)酵豆粕菌種配比L16（43）正交試驗

1.4 發(fā)酵豆粕制作方法

先將豆粕粉碎（過40目），稱取160 g裝入已編號的16個消毒具塞三角燒瓶中，按照正交表3稱取相應的菌種于對應的三角燒瓶中，加入90 ml去離子水，混合均勻。將三角燒瓶置于28℃的厭氧培養(yǎng)箱中發(fā)酵2 d，發(fā)酵成熟。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 發(fā)酵豆粕pH值的測定

稱取發(fā)酵后的新鮮豆粕5 g于100 ml錐形瓶中，加入50 ml去離子水，攪拌30 min后，用pHS-3C型pH計測定溶液的pH值。

1.5.2 發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活的測定

蛋白酶酶活的測定參照中華人民共和國SB/T10317-1999標準[7]。

1.5.2.1 酶樣的制備

稱取10 g新鮮發(fā)酵豆粕于250 ml錐形瓶中，加入100 ml乳酸緩沖液，攪拌溶解2 h，用慢速定性濾紙過濾，即得稀釋10倍的酶液。

1.5.2.2 標準曲線的繪制

L-酪氨酸標準溶液按表4配制。

表4 L-酪氨酸標準溶液配制

分別取0～5號管中的溶液1 ml，加入0.4 mol/l的碳酸鈉溶液5.00 ml，福林酚試劑1.00 ml，置于40℃水浴中顯色20 min，用分管光度計在680 nm處比色，測定其OD值，繪制標準曲線，計算回歸方程(見圖1)。當OD值為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值。回歸方程為y=0.010 2x-0.001 7，R2=0.999 1。

圖1 蛋白酶標準曲線

1.5.2.3 樣品的測定

先將干酪素溶液放入40℃水浴中預熱5 min；取48支編號的10 ml離心管，各加入1 ml酶液，另取2支空白管加入1 ml乳酸緩沖液，同時加入2 ml三氯乙酸；1～48號離心管加入1 ml干酪素溶液，搖勻40℃準確反應10 min；取出離心管，1-48號加入2 ml三氯乙酸，空白管加入1 ml干酪素溶液靜置10 min；

離心：3 000 r/min離心15 min，另取對應編號的離心管各取1 ml上清液，分別加入0.4 mol/l碳酸鈉溶液5 ml，1 ml福林酚試劑。

在40℃水浴條件下顯色20 min，680 nm處測OD值。

1.5.2.4 計算公式

式中：A為OD值；K為吸光常數(shù)；10為酶解反應時間；n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.5.3 酸溶蛋白的測定

將發(fā)酵好的豆粕于65℃烘干3 h，取出在干燥器中冷卻30 min，稱重。再同樣烘干1 h，冷卻，稱重，直到2次質(zhì)量差小于0.000 2 g。

稱取6 g烘干好的發(fā)酵豆粕樣品于100 ml燒杯中，加入75 ml 10%三氯乙酸，攪拌30 min。將所有液體用慢速定性濾紙過濾。

取15 ml上清液進行消化，凱氏定氮測量粗蛋白質(zhì)的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2007進行統(tǒng)計、計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種比例對發(fā)酵豆粕粗蛋白含量的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果進行方差分析，比較各因素對發(fā)酵豆粕粗蛋白含量的影響。由方差分析結(jié)果（見表5）可知，每個因素對粗蛋白含量均有一定的影響，只是效果不同，影響因素的主次順序是酵母菌＞乳酸桿菌＞枯草芽孢桿菌，即影響最顯著的是酵母菌，其次是乳酸桿菌，影響最小的是枯草芽孢桿菌。由表5可知，乳酸桿菌為22 ml/kg時粗蛋白含量最高，酵母菌為4 mg/kg時粗蛋白含量最高，枯草芽孢桿菌為2.6 mg/kg時粗蛋白含量最高。所以最佳菌種配比為：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg。

表5 正交試驗不同菌種比例對發(fā)酵豆粕粗蛋白含量的影響

2.2 不同菌種比例對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果進行方差分析，比較各因素對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量的影響。由方差分析結(jié)果（見表6）可知，每個因素對酸溶蛋白含量均有一定的影響，只是效果不同，影響因素的主次順序是乳酸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞酵母菌，即影響最顯著的是乳酸桿菌，其次是枯草芽孢桿菌，影響最小的是酵母菌。由表6可知，乳酸桿菌為22 ml/kg時酸溶蛋白含量最高，酵母菌為4 mg/kg時酸溶蛋白含量最高，枯草芽孢桿菌為2.2 mg/kg時酸溶蛋白含量最高。所以最佳菌種配比為：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.2 mg/kg。

表6 正交試驗不同菌種比例對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量的影響

2.3 不同菌種比例對發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果進行方差分析，比較各因素對發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活含量的影響。由方差分析結(jié)果（見表7）可知，每個因素對蛋白酶酶活均有一定的影響，只是效果不同，影響因素的主次順序是枯草芽孢桿菌＞乳酸桿菌＞酵母菌，即影響最顯著的是枯草芽孢桿菌，其次是乳酸桿菌，影響最小的是酵母菌。由表7可知，乳酸桿菌為22 ml/kg時蛋白酶酶活最高，酵母菌為4 mg/kg時粗蛋白酶酶活最高，枯草芽孢桿菌為2.2 mg/kg時蛋白酶酶活最高。所以最佳菌種配比為：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.2 mg/kg。

表7 正交試驗不同菌種比例對發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活的影響

2.4 不同菌種比例對發(fā)酵豆粕pH值的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果進行方差分析，比較各因素對發(fā)酵豆粕pH值的影響。由方差分析結(jié)果（見表8）可知，每個因素對粗蛋白含量均有一定的影響，只是效果不同，影響因素的主次順序是酵母菌＞枯草芽孢桿菌＞乳酸桿菌，即影響最顯著的是酵母菌，其次是枯草芽孢桿菌，影響最小的是乳酸桿菌。由表8可知，乳酸桿菌為22 ml/kg時發(fā)酵豆粕pH值最低，酵母菌為4 mg/kg時發(fā)酵豆粕pH值最低，枯草芽孢桿菌為2.6 mg/kg時發(fā)酵豆粕pH值最低。所以最佳菌種配比為：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg。

2.5 菌種最佳比例篩選試驗結(jié)果

由上述試驗可篩選出兩組結(jié)果，第Ⅰ組：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.2 mg/kg；第Ⅱ組：乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg。由表9可知，兩組粗蛋白、酸溶蛋白的含量差異不顯著（P＞0.05），但蛋白酶酶活，第Ⅱ組顯著高于第Ⅰ組（P＜0.05）。并且第Ⅱ組的pH值低于第Ⅰ組。所以，確定第Ⅱ組為最優(yōu)菌種配比。即乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg。

表8 正交試驗不同菌種比例對發(fā)酵豆粕pH值的影響

表9 最佳比例篩選試驗結(jié)果

3 討論

隨著我國畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，動物飼料蛋白資源供應短缺，嚴重依賴進口，研究可以替代魚粉的新型植物蛋白源引起了廣大科研工作者的關注。豆粕是我國當前使用最廣泛的飼料蛋白原料，但飼用豆粕一般是高溫豆粕，蛋白變性比較嚴重，溶解性較差，會影響蛋白的消化，而且還含有一定的抗營養(yǎng)因子和脹氣因子。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵處理，不僅能夠提高其粗蛋白含量，還能夠降解存在的抗營養(yǎng)因子，改善蛋白質(zhì)的質(zhì)量，使經(jīng)過發(fā)酵后的豆粕更有利于動物的消化吸收，是優(yōu)于其他大豆產(chǎn)品的多功能優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料。

國內(nèi)外對于發(fā)酵豆粕的報道大多是單一菌種或者兩種菌種混合發(fā)酵豆粕，很少有3種菌種混合發(fā)酵的研究。據(jù)邢力研究，用枯草芽孢桿菌和米曲霉混合菌種發(fā)酵豆粕比用單一菌種枯草芽孢桿菌發(fā)酵更有利于提高發(fā)酵豆粕營養(yǎng)水平，發(fā)酵豆粕最優(yōu)的方案為枯草芽孢桿菌和米曲霉混合菌種比例為2∶1[8]。另根據(jù)研究報道，枯草芽孢桿菌與米曲霉混合比例為2∶1時，發(fā)酵豆粕中多肽含量顯著高于1∶1組和4∶1組。同時，王哲奇也得出同樣的結(jié)論：枯草芽孢桿菌與米曲霉混合比例為2∶1時，豆粕中大豆多肽含量顯著高于其他2組（P＜0.05）?？莶菅挎邨U菌與釀酒酵母接種比例為4∶1時大豆多肽含量顯著高于其他2組（P＜0.05），與接種比例為2∶1時的發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量差異不顯著，但顯著低于接種比例為1∶1時的發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量，pH值差異均不顯著（P＜0.05）[9]。本試驗通過正交試驗確定乳酸桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌3種菌的添加比例，得出3種菌的添加比例為乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4.0 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg。本文通過正交試驗確定發(fā)酵豆粕中乳酸桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌3種菌的最佳配比，為發(fā)酵豆粕的合理使用提供理論依據(jù)。使發(fā)酵豆粕能夠更好地應用于生產(chǎn)實際，從而提高豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，也為后續(xù)有關研究提供科學依據(jù)。

4 結(jié)論

發(fā)酵豆粕3種菌的添加配比為乳酸桿菌22 ml/kg、酵母菌4.0 mg/kg、枯草芽孢桿菌2.6 mg/kg，即乳酸桿菌44×109U/kg、酵母菌80×109U/kg、枯草芽孢桿菌260×109U/kg。