大豆蛋白類抗?fàn)I養(yǎng)因子對腸道健康的影響與新型蛋白酶的解決方案

■喬 偉

（北京盛拓達生物技術(shù)有限公司，北京100081）

大豆是一種優(yōu)秀的植物蛋白源，蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸平衡性好，是性價比高的優(yōu)質(zhì)動物飼料原料，在魚粉價格高漲的今天，更是一種優(yōu)質(zhì)原料。然而，大豆本身所含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響機體對養(yǎng)分的吸收利用與腸道健康。大豆中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子為大豆抗原蛋白、大豆凝集素和胰蛋白酶抑制因子，它們都是大豆蛋白組成的重要成分，本文主要闡述大豆三大抗?fàn)I養(yǎng)因子對腸道健康的影響與新型蛋白酶解決方案，為大豆蛋白在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 大豆蛋白類三大抗?fàn)I養(yǎng)因子

1.1 大豆抗原蛋白

大豆中的抗原蛋白又稱致敏蛋白，主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三種伴大豆球蛋白（如：α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin），這四種大豆球蛋白均能引起斷奶仔豬過敏反應(yīng)，其中g(shù)lycinin和βconglycinin是大豆中免疫原性最強的兩種抗原蛋白。大豆球蛋白是六聚體復(fù)合物，相對分子質(zhì)量介于300～380 kDa之間。在大豆蛋白質(zhì)中，大豆球蛋白含量最高，是大豆中的主要貯藏蛋白，也是最大的單體成分，占大豆籽實的25%～35%，是一種聚合蛋白質(zhì)，含糖蛋白較少，具有良好的熱穩(wěn)定性。

β-伴大豆球蛋白是三聚體，相對分子質(zhì)量150～200 kDa，占大豆總量的10%～12.7%，大豆蛋白質(zhì)含量的30%，其含量僅次于大豆球蛋白，是導(dǎo)致大豆過敏的另一種主要抗原蛋白。β-伴大豆球蛋白同大豆球蛋白一樣也具有良好的干熱穩(wěn)定性，100℃條件干炒對其抗原活性幾乎沒有影響。孫澤威等（2006）研究表明，120℃、7.5 min蒸汽熱處理大豆，能使大豆球蛋白失去免疫活性，但對β-伴大豆球蛋白的活性來說基本不能失活。而在濕熱處理過程中，70～80℃為β-伴大豆球蛋白的變性溫度，溫度升高至80℃左右時，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生最大程度的變化，β-伴大豆球蛋白的剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生部分解離，變?yōu)闊o規(guī)則的柔性結(jié)構(gòu)；到達100℃時，亞基結(jié)構(gòu)基本破壞。體外酶解試驗表明，β-伴大豆球蛋白酶解產(chǎn)物中分子量為10～20 kDa的這部分肽段對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有一定抵抗力。

大豆球蛋白分子結(jié)構(gòu)緊密，大量酶切位點藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，很難被蛋白酶水解。因此，大豆球蛋白即有熱穩(wěn)定性也有不被內(nèi)源蛋白酶降解的特性。大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的30%由大豆球蛋白引起。

1.2 胰蛋白酶抑制因子

生大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的40%是由胰蛋白酶抑制因子（trypsin inhibitors，TI）引起的，按照結(jié)構(gòu)分胰蛋白酶抑制因子大約有7種，但目前只有庫尼茲大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）和包曼-伯克蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk proteinase inhibitor，BBI）得到較廣泛的關(guān)注和詳細研究。生大豆中含有1.4%的KTI和0.6%的BBI（李德發(fā)，2003）。其中KTI含有181個氨基酸殘基，含2個二硫鍵，1個活性中心，不溶于乙醇，易被酸和蛋白酶失活，由于分子內(nèi)的二硫鍵含量少，所以對熱也比較敏感，一般80℃短時間加熱即可使其變性，而在90℃時就發(fā)生不可逆失活，可以與胰蛋白酶1∶1進行結(jié)合。BBI含71個氨基酸殘基，7個二硫鍵，有2個活性中心，BBI不溶于丙酮，對熱、酸的熱穩(wěn)定性好，即使在105℃干熱10 min仍可以保持活性，且可以與胰蛋白酶1∶2進行結(jié)合，或者同時結(jié)合一個胰蛋白酶和一個胰凝乳蛋白酶。

1.3 大豆凝集素

大豆凝集素(SBA)主要存在于大豆子葉細胞中，約為大豆蛋白質(zhì)總量的10%，是具有特異性結(jié)合能力的糖蛋白，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性非常高，具有凝集動物紅細胞、T淋巴細胞、促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化等生物活性，是大豆中含量較高的生物活性蛋白質(zhì)。大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的20%由SBA引起。它通過與動物小腸上皮細胞結(jié)合，進而破壞小腸正常結(jié)構(gòu)來發(fā)揮其抗?fàn)I養(yǎng)作用，影響體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、抑制動物生長、引發(fā)腹瀉等病理變化。

大豆凝集素具有很強的抗熱變性能力，很多傳統(tǒng)的熱處理方法都不能使它有效失活。研究表明，即使經(jīng)過140℃、15 min的干熱處理，其活性下降的程度也較小。大豆凝集素經(jīng)濕熱處理后，80℃時其活性沒有發(fā)生明顯的變化，從95℃、25 min開始活性明顯喪失，在95℃、35 min或120℃、15 min其活性完全喪失，這是因為凝集素是一種糖蛋白，有不可逆熱變性的轉(zhuǎn)折點，所以濕熱處理可以作為消除凝集素抗?fàn)I養(yǎng)作用的有效方法。

2 大豆三大抗?fàn)I養(yǎng)因子對腸道健康的影響

2.1 大豆抗原蛋白對腸道健康的影響

大豆球蛋白在腸道內(nèi)的分布受其濃度、抗原活性、動物健康等多方面因素的影響。在健康仔豬腸道中，大豆球蛋白含量呈先降后升的U字型變化趨勢；從十二指腸到空腸中部顯著下降，而在空腸后部到回腸呈現(xiàn)上升趨勢，其中回腸的含量最高，而空腸中部的含量最低。在小腸絨毛內(nèi)的大豆球蛋白濃度均極顯著高于隱窩和集合淋巴小結(jié)。

大豆球蛋白對仔豬腸道健康的影響與其腸上皮細胞通透性有關(guān)。使用大豆球蛋白對體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細胞進行刺激，結(jié)果表明大豆球蛋白能使仔豬小腸上皮細胞通透性增加。在一定劑量范圍內(nèi)，細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性與大豆球蛋白濃度呈依賴式升高，而細胞跨膜電阻值(TEER)則下降；高濃度大豆球蛋白可使仔豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白mRNA相對表達量降低。在水產(chǎn)動物研究中也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加一定量大豆球蛋白使不同食性魚類腸道組織結(jié)構(gòu)完整性出現(xiàn)了不同程度的損傷，在鯉魚的前腸、后腸及草魚前腸和埃及胡子鲇后腸的小腸絨毛均有不同程度破損，固有層組織疏松而且斷裂。

β-伴大豆球蛋白具有內(nèi)在的免疫刺激能力，并能誘發(fā)過敏反應(yīng)。β-伴大豆球蛋白可以通過誘導(dǎo)腸道氧化反應(yīng)影響腸道結(jié)構(gòu)及細胞通透性等，造成腸道損傷，并由此引發(fā)生長不良、消化和吸收功能障礙，影響動物腸道健康和正常生長。Chen等(2011)給10日齡仔豬飼喂β-伴大豆球蛋白并結(jié)合仔豬小腸上皮細胞體外培養(yǎng)試驗，通過分析指出，β-伴大豆球蛋白刺激能增加腸細胞應(yīng)激和炎癥蛋白質(zhì)的表達，通過抑制腸細胞的生長，破壞細胞骨架，并導(dǎo)致細胞凋亡引起仔豬小腸腸道損傷。這在體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細胞通透性研究中也得到了驗證。Zhao等(2014)用不同濃度的β-伴大豆球蛋白對仔豬小腸上皮細胞刺激測定其對上皮通透性、完整性、代謝活性、緊密連接分布和表達等的影響，結(jié)果表明，顯著減少反式上皮電阻(TEER)、代謝活性和堿性磷酸酶(ALP)活性，且呈劑量依賴性方式顯著增加；降低緊密連接mRNA的表達，免疫熒光標(biāo)記細胞面積減小。對魚的研究也表明，β-伴大豆球蛋白降低建鯉飼料轉(zhuǎn)化率及體內(nèi)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、肌酸激酶、鈉離子、K+-ATP酶、堿性磷酸酶的活性，β-伴大豆球蛋白減少腸細胞中谷胱甘肽(GSH)及抗氧化酶的含量，誘導(dǎo)炎癥和氧化，降低建鯉胰腺和腸道重量，減少腸道長度，從而導(dǎo)致腸道消化吸收的功能障礙。研究表明，β-伴大豆球蛋白提取物可以破壞鯉魚腸上皮細胞結(jié)構(gòu)的完整性，一定劑量β-伴大豆球蛋白能夠破壞鯉魚腸上皮細胞膜和線粒體膜，降低鯉魚腸上皮細胞蛋白質(zhì)沉積，抑制鯉魚腸上皮細胞增殖。

2.2 胰蛋白酶抑制因子對腸道健康的影響

大豆胰蛋白酶抑制因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在降低蛋白質(zhì)消化率、引起胰腺增生和胰腺腫大、加劇氨基酸的不平衡、抑制動物生長等方面。

首先，胰蛋白酶抑制劑可與小腸液中胰蛋白酶特異性地結(jié)合生成無活性的復(fù)合物，降低胰蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率和利用率降低；腸道內(nèi)胰蛋白酶活性低時，引起胰腺機能亢進，分泌更多的胰蛋白酶，補充至腸道中，這會導(dǎo)致胰腺增生和胰腺腫大。

其次，引起動物體蛋白質(zhì)內(nèi)源性消耗，加劇氨基酸，尤其是含硫氨基酸的不平衡性。胰蛋白酶中含硫氨基酸豐富，胰蛋白酶大量補償性分泌會造成體內(nèi)含硫氨基酸內(nèi)源性的消失，而大豆中含硫氨基酸的含量并不高，這會加劇體內(nèi)氨基酸代謝不平衡，導(dǎo)致生長受阻或停滯。胰蛋白酶抑制劑引起含硫氨基酸內(nèi)源性丟失是受到小腸黏膜分泌的一種激素——腸促胰酶肽(Cholecystokinin-Pancreozymin，CCK-PZ)調(diào)控的，腸促胰酶肽刺激胰腺腺體細胞分泌蛋白水解酶原(如胰蛋白酶原、糜蛋白酶原等)，腸促胰酶肽的分泌和小腸食糜中胰蛋白酶的含量呈負相關(guān)，即食糜中胰蛋白酶由于和胰蛋白酶抑制劑結(jié)合而減少時，腸促胰酶肽就分泌更多，因而刺激胰腺分泌更多的胰蛋白酶原至腸道中。這種機制稱為胰腺分泌受腸道中胰蛋白酶數(shù)量的負反饋調(diào)節(jié)機制。除胰腺增生性變化而增重外，還可引起胰腺細胞的變性。表現(xiàn)為腺細胞體積增大或數(shù)量增多，胞質(zhì)為酶原顆粒所充滿，也會有細胞的變性，即胞質(zhì)內(nèi)細胞器排列不規(guī)則，酶原顆粒減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小囊擴張、破碎并浮于細胞結(jié)構(gòu)的半透明質(zhì)內(nèi)。

2.3 大豆凝集素對腸道健康的影響

大豆凝集素對動物生長有抑制作用，并隨動物種類、生理階段和飼喂量等而變化；影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，其中對氮代謝的影響明顯，尿氮損失隨著日糧凝集素水平的提高而明顯增加；同時對小腸結(jié)構(gòu)和功能有不良影響。

SBA可特異性結(jié)合動物的上皮細胞，SBA作為一類糖蛋白化合物對N-乙?；肴樘前泛桶肴樘怯刑禺愋缘淖R別作用。豬的下頜黏蛋白也可以與SBA結(jié)合，因為其中含有Q-半乳糖胺在動物腸上皮細胞表面，特別是腸微絨毛頂端的細胞表面恰好存在著N-乙?；肴樘前罚琒BA能特異性與小腸上皮細胞結(jié)合，不同種屬動物腸壁對SBA的集合能力有所差異，但在小腸中總體來說呈降低趨勢。其中十二指腸濃度最高，而回腸濃度最低。采用生物素標(biāo)記技術(shù)及免疫組化技術(shù)研究不同動物腸上皮SBA結(jié)合位點的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在豬小腸內(nèi)SBA結(jié)合主要在絨毛邊緣及皺襞處的淋巴組織，隱窩內(nèi)也有少量分布；在小腸各段中也多有結(jié)合，但在空腸前段最強；SBA在兔空腸各段有較多結(jié)合位點分布，空腸是SBA最敏感部位，主要集中于小腸絨毛柱狀上皮細胞游離面；在雞小腸各段均有SBA結(jié)合位點分布，主要在上皮細胞和杯狀細胞，在空腸前段到后段，杯狀細胞受體含量逐漸增加。

一定劑量的SBA與小腸上皮細胞的結(jié)合會引起動物腸道結(jié)構(gòu)的損傷，改變其結(jié)構(gòu)。斷奶仔豬飼喂高濃度SBA可以增加腸道通透性，減少仔豬腸上皮緊密連接蛋白的表達。Li(2013)從細胞分子層面證明了大豆凝集素對仔豬小腸上皮細胞機械屏障功能和緊密連接蛋白表達的影響，結(jié)果表明凝集素處理增加體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細胞膜的通透性，抑制細胞活力，降低緊密連接蛋白的表達水平，導(dǎo)致小腸上皮細胞機械屏障功能下降。

3 新型蛋白酶解決方案

早期對于大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子的處理方法，多為化學(xué)法，如熱乙醇提取等，但該類方法所耗人力、物力太大，對環(huán)境污染大，化學(xué)試劑殘留、影響適口性，且會造成一定的養(yǎng)分損失，因此只限于科研。20世紀(jì)90年代后用熱處理如膨化等的方式較多，但只對熱敏性的抗?fàn)I養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制因子等有作用，且高溫處理對大豆中的營養(yǎng)成分如維生素等損失較大，卻對熱穩(wěn)定的大豆抗原蛋白作用不明顯。近年來，用生物發(fā)酵的方式較多，降解抗原的效果也較好，但存在設(shè)備投入大、生產(chǎn)周期長、菌種變化大、產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等多種因素，而且發(fā)酵過程會使大豆中的能量大量因微生物發(fā)酵生長而消耗，降低大豆類產(chǎn)品的能量價值。超級蛋白酶SP100（北京盛拓達生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）是一種新型蛋白酶，是具有良好的熱穩(wěn)定性、pH值廣譜性、原料底物廣譜性，可以降解羽毛粉、醇溶蛋白，也對大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子有較好的降解作用。

3.1 蛋白酶對大豆抗原蛋白的降解

針對大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子，我們提出了完全不同于以往的研究，采用新型耐高溫蛋白酶SP100進行處理的方式，可以有效降解大豆抗原蛋白，降解率可達90%左右，而且不會對大豆中的營養(yǎng)成分有損害。該方式簡單易行，用于飼料中，也可以用于發(fā)酵豆粕的發(fā)酵過程中。蛋白酶SP100對生大豆、豆粕、純抗原蛋白這三種形態(tài)存在的大豆蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果如表1所示。因此可見，蛋白酶SP100在體外對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解率分別達94%和88%，如果在體內(nèi)，結(jié)合其內(nèi)源他酶的作用，降解率會更高。

表1 蛋白酶SP100對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果

3.2 蛋白酶對胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素的降解

將大豆凝集素和胰蛋白酶因子用蛋白酶水解后再電泳分析進行研究，結(jié)果表明，蛋白酶SP100對大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子KTI和BBI都有良好降解效果。

3.3 蛋白酶對機體腸道健康的影響

Wang等（2008）在肉雞中的研究報道，在日糧中添加蛋白酶可改善肉雞的腸道形態(tài)，增加小腸絨毛高度，降低隱窩深度。

Wang(2011)用蛋白酶在斷奶仔豬上的研究結(jié)果表明，添加蛋白酶顯著降低回腸、盲腸和結(jié)腸中食糜氨態(tài)氮的含量（P＜0.05），降低盲腸和結(jié)腸中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），增加了乳酸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），并降低斷奶仔豬結(jié)腸中總耗氧菌的數(shù)量（P＜0.05），增加總厭氧菌的數(shù)量（P＜0.05）。對斷奶仔豬腸道形態(tài)影響的結(jié)果表明，蛋白酶可以顯著提高斷奶仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值（P＜0.05），降低空腸和回腸的隱窩深度（P＜0.05），從而表明蛋白酶可以改善腸道結(jié)構(gòu)健康，并促進腸道有益菌群的繁殖，有利菌群平衡。

4 小結(jié)

大豆作為一種良好的植物蛋白源在飼料中具有重要的營養(yǎng)地位，然而抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴重影響了動物腸道健康，刺激腸道產(chǎn)生不良反應(yīng)，破壞腸道的正常結(jié)構(gòu)，影響動物腸道的消化、吸收、屏障和免疫功能。盛拓達公司新研發(fā)的蛋白酶SP100，可以有效的降解大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子，減少它們對腸道健康的不良影響，促進腸道有益微生物的繁殖，改善腸道結(jié)構(gòu)和健康。