西藏小型豬GH基因部分序列的SNP分析

研究報(bào)告

西藏小型豬GH基因部分序列的SNP分析

王玉玨，岳敏，顧陽(yáng)，顧為望，田雨光

(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州510515)

【摘要】目的對(duì)西藏小型豬GH基因(部分序列)進(jìn)行SNP分析，篩選體型較小的基因型。 方法 采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)108頭西藏小型豬GH 基因5′端部分片段進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析。 結(jié)果 通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)GH基因共有5個(gè)變異位點(diǎn)，其中T45C位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高。不同基因型生長(zhǎng)性狀比較的結(jié)果顯示：在GH基因中T45C突變位點(diǎn)上TC基因型6～8月齡的西藏小型豬的腹圍值較小，G84A突變位點(diǎn)上AA基因型3～5月齡的西藏小型豬的體重、體長(zhǎng)值較小，G93A 突變位點(diǎn)上GG基因型6～8月齡的西藏小型豬的體長(zhǎng)、體高值較小。結(jié)論在GH基因中T45C、G84A、G93A位點(diǎn)突變的TC、AA、GG基因型可能與體型較小有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)西藏小型豬在以上位點(diǎn)遺傳變異程度大，具有較高的雜合度和遺傳多樣性，可以為選育工作提供比較豐富的素材。

【關(guān)鍵詞】西藏小型豬；GH基因； SNP

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81402625)；國(guó)家973項(xiàng)目(2011CBA01006)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010014720)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M550439)；國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2011DFA33290)。

[作者簡(jiǎn)介]王玉玨( 1983-)，女，助理研究員，研究方向: 比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型，E-mail: yujue.wang@qq.com。岳敏( 1983-)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向: 比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: 343779791@ qq.om。兩者為并列第一作者。

[通訊作者]田雨光( 1987-)，男，博士生，研究方向: 比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型，E-mail: yuguang.tian@qq.com。顧為望(1956-)，男，教授、博導(dǎo)，研究方向: 比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: 645294283@qq.com。

【中圖分類號(hào)】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.009

Single nucleotide polymorphism analysis of growth

hormone gene in Tibet minipigs

WANG Yu-jue，YUE Min，GU Yang，GU Wei-wang，TIAN Yu-guang

(Center of Laboratory Animal and Institute of Comparative Medicine of Southern Medical University，Guangzhou 510515, China)

Abstract【】ObjectiveTo screen genotypes of small body in Tibet minipigs by single nucleotide polymorphism analysis (SNP) of growth hormone (GH) gene. Methods The PCR products are sequenced. According to the results, SNP analysis are applied in GH gene 5′ fragment of 108 Tibet minipigs. ResultsFive mutation points were found by comparison. The polymorphism information content of the T45C locus is highest. The results of growth traits of different genotypes showed that the abdomen of 6～8 month old Tibet minipigs of TC genotype at T45C mutation site is small; the weight and height of 3～5 month old Tibet minipigs of AA genotype at G84A mutation site is small; the body length and height of 6～8month old Tibet minipigs of GG genotype at G93A mutation site is small. Conclusion The AA TC, GG genotypes of T45C, G84A, G93A mutation sites in GH gene may be associated with small body. We also found that genetic mutations always occur in the above sites with high heterozygosity and genetic diversity, which can provide rich material for breeding research.

【Key words】Tibet minipigs；Growth hormone gene；Single-nucleotide polymorphism (SNP)

由于具有體型小、便于操作，而且解剖生理特性與人特別相近的特點(diǎn)，小型豬已逐漸成為生物醫(yī)藥研究的重要模式動(dòng)物，應(yīng)用數(shù)量逐年大幅遞增[1]。本研究中的西藏小型豬是世界上體型較小的小型豬之一，來(lái)源于青藏高原、海拔2500～4300 m的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)牧區(qū)，是唯一能夠適應(yīng)高海拔氣候和以放牧為主的豬種，封閉的地理環(huán)境使西藏小型豬保存了非常純正的品種資源。本課題組于2004 年將西藏小型豬從西藏引進(jìn)至廣州，目前已完成風(fēng)土馴化及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究，并開(kāi)展了相關(guān)動(dòng)物模型、藥物實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)基因克隆等研究。從免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該品系具有獨(dú)特的免疫相關(guān)指標(biāo)和遺傳特征，加上其獨(dú)特的外形，是一種優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)用小型豬品種[2]。

生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)是由垂體前葉中嗜酸性細(xì)胞合成和分泌的單鏈多態(tài)激素，由190～191個(gè)氨基酸組成[3]。它是重要的生理功能物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)脂類、糖類和蛋白質(zhì)代謝， 促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[4]。GH基因是GH的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，它是重要的生理功能基因，與醛縮酶、cAMP依賴性蛋白調(diào)節(jié)單位類型存在連鎖。因此GH基因研究一直為人們所關(guān)注[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用直接測(cè)序法對(duì)西藏小型豬GH基因5’調(diào)控區(qū)部分片段的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分析比較,尋找品種內(nèi)SNP位點(diǎn)以及不同基因型與其生產(chǎn)性狀之間的相關(guān)性。

1材料和方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及基因組DNA 提取

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

西藏小型豬(108頭)均達(dá)到性成熟和體成熟，年齡在3～8月齡之間，均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(粵)2011-0015】。

1.1.2基因組DNA的提取

采集西藏小型豬前腔靜脈血并提取基因組 DNA(北京艾德萊生物科技有限公司全血/組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒)，紫外分光光度法檢測(cè) DNA 的純度，A260/A280介于1.65～1.85之間。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中豬GH (GI: 347618782)基因的序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列：上游引物 5’-GGAGGAGAAGGGACAGGG-3’；下游引物5’-TAGGTGTCGGCAGCCAGT-3’。

1.3PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增總體積為50 μL(北京艾德萊生物科技有限公司)，體系組成：50 ng樣品DNA，2 μL引物混合物(10 μmol/L)，25 μL 2×MasterMix(Taq DNA Polymerase: 0.05 units/μL; MgCl2:4 mmol/L; dNTPs: 4 mmol/L)，ddH2O加至 50 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s， 60℃ 退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物1%凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察。

1.4PCR產(chǎn)物測(cè)序分型

PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。使用DNA STAR Lasergene v7.1, Chromas等生物信息軟件來(lái)尋找SNP位點(diǎn)，并進(jìn)行基因分型。用Popgene32軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)確定，同時(shí)對(duì)基因型頻率(genotypic frequency)、等位基因頻率(allele frequencies)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)西藏小型豬群體GH基因做 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢驗(yàn)，使用PIC Calc 0.6軟件進(jìn)行多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)的計(jì)算。通過(guò)SPSS13.0對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因型頻率及等位基因型頻率做卡方檢驗(yàn)。

1.5西藏小型豬部分生長(zhǎng)性狀的測(cè)量

分別選取3～8月齡的西藏小型豬早飼前用電子天平稱重;用體尺從兩耳連線中點(diǎn)至尾根部測(cè)體長(zhǎng),從兩前腿后胸肋凸起部測(cè)胸圍,肩胛部最高點(diǎn)站立時(shí)垂直向下測(cè)體高[6]。通過(guò)SPSS13.0對(duì)不同基因型的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行單向方差分析。

2結(jié)果

2.1西藏小型豬基因組DNA的提取

本實(shí)驗(yàn)成功的提取到了西藏小型豬的基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度儀分析DNA提取的結(jié)果，A260/A280均在1.8～2.0之間。據(jù)電泳圖譜中DM15000 Mark的標(biāo)識(shí)判斷對(duì)比，均在約15000 bp以上出現(xiàn)特異性條帶(圖1)。

注：泳道1為DM15000M；泳道2～7為基因組DNA。 圖1　基因組提取產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) Note：Lanes 1: D2000Marker; Lanes 2 ～ 7: Products of DNA extraction. Fig.1　Electrophoretic pattern of PCR products

2.2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得GH 基因片段，電泳檢測(cè)，據(jù)電泳圖譜中DM2000的標(biāo)識(shí)判斷在約605 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶(圖2)。圖中擴(kuò)增條帶清晰，是所需的目的條帶。

注：泳道1為DM2000；泳道2～6為GH基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 圖2　擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) Note：Lanes 1: D2000Marker; Lanes 2～ 6: PCR products of GH gene. Fig.2　Electrophoretic pattern of PCR products

2.3西藏小型豬GH基因的多態(tài)性分析

從表1的結(jié)果我們可以看出：在GH基因擴(kuò)增的這一區(qū)域中，有A12G，T45C，G84A，G93A，C133T 5個(gè)SNP位點(diǎn)，在A12G、G84A、G93A、C133T突變位點(diǎn)上的優(yōu)勢(shì)等位基因分別為G、A、G、C。同時(shí)，對(duì)西藏小型豬進(jìn)行基因變異度程度分析可知GH基因雜合度較高(Ho=0.3704)。GH基因A12G(PIC=0.360), T45C(PIC=0.375), G84A(PIC=0.256), G93A(PIC=0.211), C133T(PIC=0.369) 5個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)信息含量均較高，大部分屬于中度多態(tài)。其中T45C，該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高。所研究西藏小型豬群體GH基因做Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢驗(yàn)，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明：該區(qū)域的西藏小型豬群體均處于平衡狀態(tài)(P> 0.05)。

2.4 GH基因不同基因型的生長(zhǎng)性狀比較分析

從表2的結(jié)果我們可以看出：GH基因在T45C突變位點(diǎn)上TC基因型6～8月齡西藏小型豬的腹圍值較小，G84A突變位點(diǎn)上AA基因型3～5月齡西藏小型豬的體重、體長(zhǎng)值較小，G93A 突變位點(diǎn)上的GG基因型6～8月齡西藏小型豬的體長(zhǎng)、體高值較小。我們推測(cè)在GH基因T45C、G84A、G93A位點(diǎn)突變的TC、AA、GG基因型可能與體型較小有關(guān)。

3討論

成熟的豬生長(zhǎng)激素(PGH)分子由190個(gè)氨基酸形成4個(gè)幾乎平行的α-螺旋束，呈上-上-下-下的排布形式，分子量為22×103，所含的2個(gè)二硫鍵為其生物活性所必需，其生物學(xué)功能主要是促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，增加肌肉重量和蛋白沉積等。豬GH基因全長(zhǎng)2231 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，定位于12q1.2～1.5[7-8]。作為生長(zhǎng)速度的候選基因,對(duì)我國(guó)地方豬胰島素樣生長(zhǎng)因子的研究已有很多, 但對(duì)我國(guó)小型豬GH基因的研究卻很少。近幾年來(lái), 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)豬GH 基因結(jié)構(gòu)做出了大量基礎(chǔ)性工作。自1983年Seeburg等[9]完成對(duì)豬GH 基因的cDNA 克隆, 豬GH 基因的研究取得突破性進(jìn)展。2007年王榮梅等[10]采用變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，在豬生長(zhǎng)激素(GH)基因包含第5外顯子區(qū)的572 bp序列進(jìn)行未知SNPs的篩選，對(duì)有變異的色譜峰型進(jìn)行分類、測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域有4處變異。其中+1579位點(diǎn)的變異可以用基因型頻率(AA、AB、BB)和基因頻率來(lái)估算。2010年侯冠彧等[11]以五指山豬為試驗(yàn)材料，采用 PCR-SSCP 和測(cè)序相結(jié)合技術(shù)，對(duì)GH基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并分析其與生長(zhǎng)性狀(體重質(zhì)量、體高、體長(zhǎng)和胸圍)的相關(guān)性。結(jié)果表明，GH基因第2外顯子存在一處G→A轉(zhuǎn)換，屬沉默突變，該位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，BB基因型的體重顯著高于AA基因型和AB基因型?？梢?jiàn)，由于擴(kuò)增區(qū)域不同，分型的方法不同所以結(jié)果也有所差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)直接測(cè)序和軟件分析、發(fā)現(xiàn)GH基因在檢測(cè)區(qū)域中有5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為A12G，T45C，G84A，G93A，C133T。在GH基因中，GH基因雜合度較高(Ho=0.3704)。GH基因A12G(PIC=0.360), T45C(PIC=0.375), G84A(PIC=0.256), G93A(PIC=0.211), C133T(PIC=0.369)5個(gè)SNP位點(diǎn)，多態(tài)信息含量均較高，大部分屬于中度多態(tài)。其中T45C該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高。這表明西藏小型豬在以上位點(diǎn)遺傳變異程度大，具有較高的雜合度和遺傳多樣性有較大的選擇潛力，可以為選育工作提供比較豐富的素材。

表1　西藏小型豬GH基因的基因型頻率和等位基因頻率

表2　西藏小型豬GH基因不同基因型的生長(zhǎng)性狀的比較

注:*代表TC基因型vs CC基因型的生長(zhǎng)性狀之間有顯著性差異 (P< 0.05)，#代表GG基因型 vs GA基因型的生長(zhǎng)性狀之間有顯著性差異(P< 0.05)，※代表GG基因型 vs AA基因型的生長(zhǎng)性狀之間有顯著性差異(P< 0.05)。

Note：*TC genotype compare with CC genotypeP< 0.05;#GG genotype compare with GA genotypeP< 0.05；※GG genotype compare with AA genotypeP> 0.05.

雜合度又稱基因多樣度反應(yīng)群體在不同基因座位上的遺傳變異，被認(rèn)為是衡量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)，與之對(duì)應(yīng)的是純合度。衡量群體在一個(gè)位點(diǎn)上遺傳變異的指標(biāo)還包括有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量。一般而言，品種的基礎(chǔ)越廣泛，純度則越低，DNA多態(tài)性越豐富，多態(tài)信息含量(PIC)越高。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)；當(dāng) 0.25

對(duì)所研究西藏小型豬群體做Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢驗(yàn)，結(jié)果提示群體基因遺傳平衡，樣本來(lái)自同一蒙德?tīng)柸后w。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GH基因在T45C突變位點(diǎn)上TC基因型6～8月齡西藏小型豬的腹圍值較小，G84A突變位點(diǎn)上AA基因型3～5月齡西藏小型豬的體重、體長(zhǎng)值較小，G93A 突變位點(diǎn)上的GG基因型6-8月齡西藏小型豬的體長(zhǎng)、體高值較小。我們推測(cè)在GH基因T45C、G84A、G93A位點(diǎn)突變的TC、AA、GG基因型可能與體型較小有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃黎珍. 基因修飾克隆西藏小型豬研究[D]. 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)，2010.

[2]黃黎珍，那順巴雅爾，顧為望，等. 西藏小型豬胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及性別鑒定[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(10)：58-60.

[3]程治平. 內(nèi)分泌生理學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社. 1984:64-70.

[4]Etherton T D. Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals[J]. Physio Rev，1998，78：745-761.

[5]宋成義, 經(jīng)榮斌, 陶勇, 等. 豬GH 基因部分突變位點(diǎn)對(duì)生產(chǎn)性能的影響[J]. 遺傳，2001，5：427-430.

[6]詹純列，徐本法，李建軍，等.SPF小型豬階段生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2001,11(2): 95-97.

[7]Vize P D, Wells J R E. Isolation and characterization of porcine growth hormone gene[J]. Gene，1987，55：339-344.

[8]Yerle-M, Lahbib-Mansais Y, Thomsen P D,etal. Localization of the porcine growth hormone gene to chromosome 12p1.2-p1.5 [J]. Animal Genetics, 1993, 24：129-131.

[9]Seeburg P H. Efficient bacterial expression of bovine an d porcine growth hormones[J]. DNA, 1983, 2: 37-45.

[10]王榮梅,蘇榮勝,張綑權(quán),等. 變性高效液相色譜分析豬GH基因單核苷酸多態(tài)性及與生產(chǎn)性能的關(guān)系[J]. 畜牧與獸醫(yī),2007,39(4):20-24.

[11]侯冠彧,曾鴻普,周漢林,等. 五指山豬GH、IGFBP3基因SNPs檢測(cè)及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2010,29(3):4.

〔修回日期〕2014-10-08