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    可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及功能鑒定

    2016-01-09 06:52:34陳麗香,周曉靜,劉文文

    研究報(bào)告

    可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及功能鑒定

    陳麗香1,周曉靜3,劉文文4, 周文江1,任曉楠1,于士顏1, 周曉輝1,2

    (1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海201508;2.復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200032;

    3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,安徽 蚌埠233004;4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 赤峰024000)

    【摘要】目的構(gòu)建可調(diào)控性尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并進(jìn)行相關(guān)鑒定,可為進(jìn)一步構(gòu)建可誘導(dǎo)型肝臟人源化uPA-SCID動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。方法可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)即在強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)誘導(dǎo)下通過(guò)tet-on系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)。為此,需要構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒,分別為pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen,前者引入Gaussia熒光素酶(gaussia enzyme fluorescent element,Gluc)與四環(huán)素反式激活因子(reverse tetracycline transactivator,rtTA)偶聯(lián)表達(dá),以便于監(jiān)測(cè)rtTA表達(dá)水平;后者同時(shí)偶聯(lián)表達(dá)ZsGreen,以便于用熒光顯微鏡觀察基因表達(dá)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行表達(dá)功能鑒定后,將構(gòu)建質(zhì)粒與病毒包裝衣殼蛋白VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細(xì)胞系后獲得具有感染能力的病毒顆粒,利用該病毒感染NIH/3T3細(xì)胞,并用G418篩選出陽(yáng)性細(xì)胞;期間各取部分細(xì)胞,使用PCR方法鑒定其基因組內(nèi)是否含有相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控本。結(jié)果成功構(gòu)建pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen克隆。功能鑒定顯示,pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA克隆可表達(dá)rtTA;pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen克隆轉(zhuǎn)染HepG-Tet-on細(xì)胞,加Dox可誘導(dǎo)uPA表達(dá)。包裝病毒感染NIH/3T3細(xì)胞后通過(guò)G418篩選獲得單細(xì)胞克隆,通過(guò)PCR方法鑒定表明其基因組內(nèi)含有相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本,從而成功構(gòu)建uPA誘導(dǎo)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。結(jié)論本研究初步建立了可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),從而為可誘導(dǎo)肝損的uPA-SCID轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及在此基礎(chǔ)上的肝臟人源化動(dòng)物模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

    【關(guān)鍵詞】可調(diào)控肝臟損傷;Alb;uPA;肝臟人源化小鼠

    [基金項(xiàng)目]國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB519005);上海市科技發(fā)展基金實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究項(xiàng)目(12140900300);上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(20144Y0073);上海市公共衛(wèi)生臨床中心中心科研課題面上項(xiàng)目(2014M08)。

    [作者簡(jiǎn)介]陳麗香(1988-),女,技術(shù)員,本科,研究方向:細(xì)胞生物學(xué),E-mail: xiaripaomo@126.com。

    [通訊作者]周曉輝(1973-),男,副研究員,博士,研究方向:病毒免疫學(xué),E-mail: zhouxiaohui@shaphc.org。

    【中圖分類號(hào)】Q95-33R332【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

    doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.001

    The establishment of the uPA inducible expression system

    CHEN Li-xiang1,ZHOU Xiao-jing3,LIU Wen-wen4,ZHOU Wen-jiang1,REN Xiao-nan1,YU Shi-yan1,ZHOU Xiao-hui1,2

    (1.Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508,China;

    2.Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Ministry of Education and Health, Shanghai Medical College,

    Fudan University, Shanghai 200032,China;3.The first affiliated hospital of bengbu medical college,

    Anhui Bengbu 233004,China;

    4.Affiliated hospital of Chifeng University, Neimenggu Chifeng 024000,China)

    Abstract【】ObjectiveTo establish uPA inducible expression system using recombinant retroviral system for the further construction of inducible uPA-SCID animal model. Methods The Inducible expression system need to construct two plasmids:pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA and pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen respectively. Both plasmids were based on retroviral vector pLNHX, Albumin promoter gene (Alb) and rtTA gene or uPA gene and ZsGreen were obtained by PCR reaction and inserted into pLNHX. The Gaussia enzyme fluorescent element (GLUC) was used to monitor rtTA expression in pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA,and the ZsGreen for uPA expression monitoring in pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen.The correct constructed plasmids were transfected into packaging cell line GP2-293 to gain recombinant viral particles.NIH/3T3 cells were infected with these viral particles and selected with G418.Gene expression in the surviving cells was confirmed by the PCR method. ResultsThe recombinant retroviral vectors harbouring target genes were successfully cloned.The rtTA gene in pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA was expressed, and uPA can be induced to express in pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen by doxycycline (Dox) when the plasmid transfected into the HepG-Tet-on cell. The constructed recombinant two retroviral vectors were transfected into GP2-293 packaging cells respectively to gain infectious viral particles.Then,NIH/3T3 cells were infected with these viral particles and single-cell clones which stably expressed the transgenes were successfully established. Conclusion This study primarily established uPA inducible expression system, it laid a foundation for the murine model of inducible liver damage, and provided a novel technical platform for further building the liver humanised murine models for viral hepatitis studying.

    【Key words】Controlled inducible liver damage;Alb;uPA;Liver-humanized mouse

    尿激酶型纖溶酶原激活物uPA可以激活肝細(xì)胞內(nèi)的纖溶蛋白酶原,導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和壞死[1],目前被認(rèn)為可能是建立理想肝臟損傷小鼠模型最合適的毒力基因。uPA參與多種生理病理過(guò)程,在肝臟再生過(guò)程中,它通過(guò)激活纖溶酶原可以清除壞死細(xì)胞碎片,破壞細(xì)胞外基質(zhì)以促進(jìn)肝臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu),從而有利于移植肝細(xì)胞的成活與增殖[2]。

    肝臟損傷動(dòng)物模型的建立是研究肝細(xì)胞移植和再生的關(guān)鍵性技術(shù)平臺(tái)。外源異種肝細(xì)胞移植要在受體動(dòng)物體內(nèi)嵌合、再生成功,首要條件是受體本身肝臟有損傷,外源植入的肝細(xì)胞才有機(jī)會(huì)克服生存競(jìng)爭(zhēng)而“殖民”成功;同時(shí)為防止免疫排斥往往需要受體動(dòng)物有免疫缺陷。肝損小鼠模型是肝臟人源化小鼠模型建立的基礎(chǔ)。uPA/SCID是目前應(yīng)用較多的一個(gè)肝損/移植模型,在病毒性肝炎等人類肝臟重大疾病研究中發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用uPA/SCID模型,外源人肝細(xì)胞的嵌合重建率最高能達(dá)到99%。

    但現(xiàn)有uPA/SCID小鼠模型也存在很多問(wèn)題和缺陷。例如uPA雜合子對(duì)肝臟的損傷已很嚴(yán)重,純合子新生鼠肝臟的損傷更嚴(yán)重,,造成很高的死亡率[3],使uPA小鼠繁育和保種比較困難。此外,小鼠某些肝細(xì)胞可能通過(guò)重組機(jī)制清除uPA轉(zhuǎn)基因,并快速增殖,直到8~12周恢復(fù)整個(gè)肝臟,對(duì)移植入的肝細(xì)胞增殖能力造成很大的限制。因此,移植手術(shù)一般要在出生后最初兩周內(nèi)完成,以提高移植人肝細(xì)胞的嵌合成功率,但這也給模型建立增加了操作的難度[4-5]。

    本研究通過(guò)建立基于tet-on的可調(diào)控肝臟損傷的uPA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),為進(jìn)一步構(gòu)建可誘導(dǎo)肝損的uPA-SCID動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)uPA毒性基因的可控表達(dá),可克服現(xiàn)有uPA/SCID小鼠模型的缺陷,從而可能為肝炎病毒感染的免疫致病機(jī)制、藥物及疫苗篩選評(píng)價(jià)研究等提供一個(gè)更加有力的研究平臺(tái)。

    1材料和方法

    1.1質(zhì)粒、菌株及試劑

    質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株:pUC19載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNHX購(gòu)自美國(guó)Clontech公司;pTRE2hyg,pLVX-IRES-ZsGreen質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α實(shí)驗(yàn)室保存;包裝細(xì)胞GP2-293細(xì)胞系,NTH3T3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院;人宮頸癌細(xì)胞Hela,人肝癌細(xì)胞HepG2及HepG2-Tet-on細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存;PCR反應(yīng)體系購(gòu)自TaKaRa公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ToYoBo公司;限制性內(nèi)切酶及10×buffer購(gòu)自NEB公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒,DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司;1640、DMEM、胎牛血清購(gòu)自invitrogen公司;胰蛋白酶,強(qiáng)力霉素Dox及G418實(shí)驗(yàn)室保存;5×Passive Lysis Buffer購(gòu)自Promega公司;Dual-Luciferase Reporter System檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;引物合成:博尚生物技術(shù)(上海)有限公司。

    表1 克隆引物序列(包括酶切位點(diǎn))

    1.2儀器與設(shè)備

    Cycler PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司;離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司及Beckman公司;紫外-可見光分析成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司;酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自Thermo公司。

    1.3重組質(zhì)粒構(gòu)建

    1.3.1pUC19載體及pLNHX載體多克隆位點(diǎn)的改造

    由于pUC19、pLNHX載體本身不具有后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的酶切位點(diǎn),所以首先需對(duì)載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造。

    pUC19M獲得:在pUC19載體上插入含有MfeI、KpnI、BamHI、EcoRV、NotI等酶切位點(diǎn)的MCS:利用引物設(shè)計(jì)軟件Vector-NTI設(shè)計(jì)引物,引物序列如表1 U19-O3O4:將設(shè)計(jì)的引物U19-03與U19-04以1∶1的比例混合后直接進(jìn)行變性退火獲得目的基因MCS。用EcoRI-HF/HindIII(Buffer2)對(duì)載體pUC19與MCS進(jìn)行雙酶切,酶切過(guò)夜后,對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收.將回收后的pUC19載體與MCS以1∶3的比例連接,連接條件:15℃連接4 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆進(jìn)行EcoRI-HF/HindIII雙酶切鑒定,對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序;pLNHXO1O2獲得:對(duì)載體pLNHX進(jìn)行改造引入MfeI、NotI位點(diǎn)從而構(gòu)建新的載體pLNHXO1O2;利用引物設(shè)計(jì)軟件Vector-NTI設(shè)計(jì)引物,引物序列如表1 LNHX-O1O2:將設(shè)計(jì)的引物L(fēng)NHXO1與LNHXO2以1∶1的比例直接置于進(jìn)行變性退火獲得目的基因MCS。用XhoI/BglII(Buffer3)對(duì)載體pLNHX進(jìn)行雙酶切,酶切過(guò)夜后,對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收。將回收后的pLNHX載體與MCS以1∶3的比例連接,15℃連接4 h。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆進(jìn)行MfeI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆能夠被酶切為線性條帶,對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序;pLNHXO5O6獲得:在載體上插入含有MfeI、HpaI、BamHI、XhoI、MluI等酶切位點(diǎn)的MCS從而構(gòu)建新的載體pLNHXO5O6:利用引物設(shè)計(jì)軟件Vector-NTI設(shè)計(jì)引物,引物序列如表一LNHX-O5O6:將設(shè)計(jì)的引物L(fēng)NHXO5與LNHXO6以1∶1的比例直接置于進(jìn)行變性退火獲得目的基因MCS。用XhoI/BglII(Buffer3)對(duì)載體pLNHX進(jìn)行雙酶切,酶切過(guò)夜后,對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收。將回收后的pLNHX載體與MCS以1∶3的比例連接,15℃連接4 h。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆進(jìn)行MfeI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆能夠被酶切為線性條帶對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。

    1.3.2白蛋白啟動(dòng)子調(diào)控的rtTA克隆pLNHXO1O2-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA及pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen克隆的構(gòu)建

    利用引物設(shè)計(jì)軟件Vector-NTI設(shè)計(jì)引物,引物序列如表1。

    以Jc1-Flag2質(zhì)粒,pTet-on質(zhì)粒及抽提的小鼠肝臟基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得567 bp的Gluc-FMN2A,1 kb的rtTA基因及308 bp的Alb基因,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收后逐一插入 pUC19M載體后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定,對(duì)鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。將測(cè)序陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切獲得Alb-Gluc-FMN2A-rtTA基因再與pLNHXO1O2連接轉(zhuǎn)化后挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定,對(duì)鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)從而獲得pLNHXO1O2-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA陽(yáng)性質(zhì)粒;以pTRE2hyg質(zhì)粒,pLVX-IRES-ZsGreen質(zhì)粒及鼠腎cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得433 bp的TRE2(四環(huán)素應(yīng)答元件;tetracycline response element;TRE)啟動(dòng)子,1.3 kb的MCS-IRES-ZsGreen及1.3 kb uPA,并通過(guò)cmv引物退火連接獲得70 bp的TRE2 cmv,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收后逐一插入pLNHXO5O6載體后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定,對(duì)鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),從而獲得pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen陽(yáng)性質(zhì)粒;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)序發(fā)現(xiàn)TRE2缺少一段CMV,所以后期通過(guò)引物設(shè)計(jì)退火連接獲得缺失的cmv,與建立的重組載體連接,由于插入了TRE2cmv,所以失去HpaI酶切位點(diǎn),用HpaI酶切鑒定可以初步確定陽(yáng)性克隆。

    1.3.3用于pLNHXO1O2-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA功能鑒定的pTRE2hyg-Fluc構(gòu)建

    利用引物設(shè)計(jì)軟件Vector-NTI設(shè)計(jì)引物,引物序列如表1,以pIFNβ-Fluc為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得1.7 kb的Fluc,將Fluc及pTRE2hyg用BamHI,MluI進(jìn)行酶切,回收,連接,轉(zhuǎn)化,挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定從而獲得pTRE2hyg-Fluc陽(yáng)性質(zhì)粒。

    1.4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體功能鑒定:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)及熒光顯微鏡觀察

    雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法:細(xì)胞鋪板后轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒,48 h后用200 μL 1×Passive Lysis緩沖液裂解并收集上清。用Dual Luciferase Assay System 試劑盒和Lumat LB 9507儀器測(cè)定Fluc、Rluc活性,積分時(shí)間均為10 s,結(jié)果以Fluc和Rluc比值表示。

    熒光顯微鏡檢測(cè)法:細(xì)胞鋪板后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒,48 h后熒光顯微鏡觀察。

    1.5包裝病毒的構(gòu)建

    無(wú)內(nèi)毒素抽提質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)OD260定量后與VSV-G包裝蛋白共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293,轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTm2000進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒。收集病毒即先在4℃ 3861 r/min離心15 min,將上清轉(zhuǎn)移至超離管中再用超速離心機(jī)在4℃,16800 r/min離心2 h,棄去上清液,加入100 μL DMEM重懸并置于4℃溶解8 h使得病毒重新解離為可感染的單體,從而獲得病毒原液用于感染靶細(xì)胞。

    1.6陽(yáng)性細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)

    以NIH-3T3細(xì)胞作為靶細(xì)胞。于感染的前1 d將1×105的NIH-3T3細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)盤中。病毒感染前細(xì)胞先用無(wú)血清DMEM洗滌一次,再補(bǔ)以1.5 mL無(wú)血清DMEM同時(shí)加入100 μL病毒原液。感染2 h后重新更換為正常的新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再加入G418(800 μg/mL)篩選陽(yáng)性克隆。

    1.7PCR檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞中目的基因的表達(dá)

    將體外反復(fù)傳代的陽(yáng)性NIH/3T3細(xì)胞用Trizon裂解后抽提RNA并進(jìn)行定量,用ToYoBo試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR鑒定。

    2結(jié)果

    2.1Fluc、Gluc-FMN2A、MCS-IRES-ZsGreen、rtTA、TRE2、Alb、uPA基因片段擴(kuò)增

    以pIFNβ-Fluc、Jc1-Flag2、pLVX-IRES-ZsGreen、pTet-on、pTRE2hyg質(zhì)粒,抽提的小鼠肝臟基因組DNA和鼠腎cDNA為模板,引物序列見表1。進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增出1.7 kb的Fluc,567 bp的Gluc-FMN2A,1.3 kb的MCS-IRES-ZsGreen,1 kb的rtTA基因,433 bp的TRE2啟動(dòng)子,308 bp的Alb基因和1.3 kb uPA,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。結(jié)果顯示:在預(yù)期位置看到了實(shí)驗(yàn)設(shè)想的條帶。

    注:A:M:DL2000 Marker;1、2、3、4、5分別為Fluc(1.7 kb)、Gluc-FMN2A(567 bp)、MCS-IRES-ZsGreen(1.3 kb)、rtTA(1 kb)、uPA(1.3 kb),B:M:DL2000 Marker;1為Alb(308 bp)。 圖1 Fluc、Gluc-FMN2A、MCS-IRES-ZsGreen、rtTA、uPA、Alb基因PCR產(chǎn)物圖 Note:A:M:DL2000Marker;1:Fluc(1.7kb);2:Gluc-FMN2A(567 bp);3:MCS-IRES-ZsGreen (1.3 kb); 4:rtTA(1 kb);5: uPA(1.3 kb), B: M:DL2000 Marker;1: Alb(308 bp). Fig.1 PCR product of Fluc、Gluc-FMN2A、MCS-IRES-ZsGreen、rtTA、uPA、Alb gene

    2.2重組質(zhì)粒pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA、pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen及pTRE2hyg-Fluc的酶切鑒定

    將改造后的pUC19M載體與PCR擴(kuò)增獲得的Alb,rtTA,Gluc-FMN2A基因片段經(jīng)過(guò)酶切(酶切位點(diǎn)見表1),回收純化,連接反應(yīng)構(gòu)建成功pUC19M-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA,再通過(guò)PCR獲得整個(gè)Alb-GLUC-FMN2A-rtTA基因片段,與改造后的pLNHXO1O2進(jìn)行MfeI/NotI酶切連接反應(yīng),構(gòu)建pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA重組質(zhì)粒。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)MfeI/NotI酶切鑒定獲得5300 bp線性質(zhì)粒和1875 bp Alb-GLUC-FMN2A-rtTA片段(圖2C6),表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA。

    將改造后的pLNHXO5O6載體與PCR擴(kuò)增獲得的TRE2,MCS-IRES-ZsGreen,uPA基因片段及cmv引物退火連接獲得的70 bp TRE2cmv依次連接,陽(yáng)性克隆經(jīng)MfeI/HpaI,XhoI/MluI,XhoI/BamHI酶切可分別獲得均缺失70 bp TRE2cmv的5300 bp線性質(zhì)粒和433 bp TRE2(圖Ea2),5733 bp線性pLNHXO5O6-TRE2和1300 bp IRES-ZsGreen(圖Eb1、2、4),7033 bp線性pLNHXO5O6-TRE2-IRES-ZsGreen和1300 bp uPA(圖Ec3),經(jīng)HpaI酶切鑒定(由于插入TRE2cmv,陽(yáng)性質(zhì)粒在擴(kuò)增中會(huì)失去HpaI酶切位點(diǎn)),陽(yáng)性 pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen不能被酶切(圖Ed4),結(jié)果表明已成功構(gòu)建pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen。

    將pTRE2hyg載體與PCR擴(kuò)增獲得的Fluc基因片段經(jīng)過(guò)BamHI/MluI酶切,回收純化,連接反應(yīng)構(gòu)建pTRE2hyg-Fluc(圖2DE)。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamHI/MluI酶切鑒定獲得5300 bp線性質(zhì)粒和1700 bp Fluc片段見圖2D1、3、5,表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRE2hyg-Fluc。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:陽(yáng)性質(zhì)粒在預(yù)期位置看到實(shí)驗(yàn)設(shè)想的條帶,將陽(yáng)性質(zhì)粒送檢測(cè)序發(fā)現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果一致。

    2.3重組質(zhì)粒pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen功能鑒定

    2.3.1rtTA特異性表達(dá)檢測(cè)

    將重組病毒質(zhì)粒pLNHX-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA通過(guò)Fugen HD轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞系)與HepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞系)。由于Gluc與rtTA偶聯(lián)表達(dá)可以自行分泌到細(xì)胞上清中,轉(zhuǎn)染48 h后吸取細(xì)胞上清檢測(cè)Gluc活性,即可判定rtTA表達(dá)。因?yàn)镠epG2細(xì)胞是肝細(xì)胞來(lái)源,所以可以檢測(cè)到Gluc的表達(dá),而Hela細(xì)胞缺乏調(diào)控白蛋白啟動(dòng)子的特異性轉(zhuǎn)錄因子,不能啟動(dòng)Gluc/rtTA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后熒光檢測(cè)結(jié)果顯示:HepG2細(xì)胞中Gluc表達(dá)量為Hela細(xì)胞的10倍,表明引入的白蛋白啟動(dòng)子序列具有組織特異的生物學(xué)特性(圖3A)。

    2.3.2rtTA可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)

    在HepG2細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染pLNHX-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA和pTRE2hyg-Fluc質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染4 h后進(jìn)行Dox(1 μg/mL)處理,通過(guò)引入Dox(檢測(cè)Fluc活性,轉(zhuǎn)染48 h后雙熒光檢測(cè)結(jié)果顯示:加入Dox后Fluc/Gluc值為未加Dox誘導(dǎo)的2~3倍,確定pLNHX-Alb-Gluc-FMN2A-rtTA克隆表達(dá)的rtTA具有可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子活性(圖3B)。

    2.3.3TRE2-uPA-IRES-ZsGreen表達(dá)的可調(diào)控性檢測(cè)

    將重組質(zhì)粒pLNHXO5O6 -TRE2-uPA-IRES-ZsGreen轉(zhuǎn)染HepG-Tet-on細(xì)胞,轉(zhuǎn)染4 h后進(jìn)行Dox(1 μg/mL)處理,轉(zhuǎn)染48 h后觀察ZsGreen綠色熒光表達(dá),熒光觀察結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的HepG-Tet-on細(xì)胞具有綠色熒光表達(dá),確定了TRE2-uPA-IRES-ZsGreen表達(dá)的可調(diào)控性(彩插1圖5)。

    注:A:Tet-on系統(tǒng)原理圖;B:pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA、pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖;C、D、E:質(zhì)粒 pLNHXO1O2-Alb-GLUC-rtTA、pTRE2hyg-Fluc、 pLNHXO5O6 -TRE2-uPA-IRES-ZsGreen的構(gòu)建; M:DL2000 Marker。 圖2 質(zhì)粒pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA、pTRE2hyg-Fluc和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen的構(gòu)建方法 Note:A:Tet-on system;B:schematic diagram of plasmid pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA、pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen; C、D、E:Construction of plasmid pLNHXO1O2-Alb-GLUC-rtTA、pTRE2hyg-Fluc、pLNHXO5O6 -TRE2-uPA-IRES-ZsGreen;M:DL2000 Marker. Fig.2 Construction of plasmid pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA、pTRE2hyg-Fluc and pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen

    圖3 重組質(zhì)粒pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA功能鑒定 Fig.3 Functional identification of pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA

    2.4陽(yáng)性細(xì)胞NIH/3T3中目的基因表達(dá)的檢測(cè)

    包裝病毒感染NIH/3T3細(xì)胞,通過(guò)G418(800 μg/mL)藥物篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞,抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄后PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá),引物見表1。經(jīng)檢測(cè)Alb-GLUC-rtTA-NIH/3T3細(xì)胞2~4號(hào),TRE2-uPA-IRES-ZsGreen 2~4號(hào)在預(yù)期位置看到實(shí)驗(yàn)設(shè)想的條帶,表明成功建立了uPA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

    圖4 陽(yáng)性細(xì)胞NIH/3T3中目的基因的表達(dá) Fig.4 Expressing of target gene in NIH/3T3

    3討論

    病毒性肝炎及相關(guān)臟器疾病是是危害人類生命和健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染為例,目前全球約有HBV攜帶者3.5億人,中國(guó)約有1.2億人。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染也是一個(gè)世界范圍的嚴(yán)重問(wèn)題。HBV或HCV的感染是導(dǎo)致慢性肝病和肝癌的重要要病因,然而相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明[5-6]。為了有效進(jìn)行病毒性肝炎研究,需要建立可以模擬人類自然感染過(guò)程的合適的小動(dòng)物模型。 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)病毒基因小鼠、病毒基因高壓水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染小鼠模型等,均非自然感染模型[7-17]。

    鑒于HBV或HCV對(duì)人肝細(xì)胞受體的特殊嗜性,比較理想的小動(dòng)物模型是肝臟人源化的小鼠模型,uPA/SCID小鼠模型即屬于其中應(yīng)用較多的一類。然而由于原有的uPA/SCID小鼠模型仍然存在諸多缺陷,對(duì)其更廣泛的應(yīng)用形成了限制。國(guó)際上病毒性肝炎著名學(xué)者Charles M. Rice和Alexander Ploss[18]提出,可誘導(dǎo)型肝損基礎(chǔ)上的人肝/免疫雙嵌合小鼠模型是代表人類肝臟病研究領(lǐng)域中新希望的地平線(new horizon)??烧T導(dǎo)型肝損傷模型無(wú)建模手術(shù)窗口期限制,而且由于毒性基因的可控表達(dá)也解決了種群繁育方面的困難,因此可克服原有uPA小鼠諸多缺點(diǎn)。

    北京大學(xué)鄧宏魁等[2]曾報(bào)道:利用tet-on調(diào)控系統(tǒng)以及腺病毒感染轉(zhuǎn)入uPA基因的方法來(lái)實(shí)現(xiàn) uPA可調(diào)控表達(dá)和定時(shí)肝損的發(fā)生。然而,由于維持uPA表達(dá)需反復(fù)進(jìn)行腺病毒接種感染,宿主小鼠產(chǎn)生針對(duì)前次腺病毒感染產(chǎn)生的抗體可影響后續(xù)腺病毒感染的效率,從而降低uPA表達(dá)水平。而且,由于腺病毒感染本身可激活天然免疫,必然會(huì)干擾后續(xù)作為研究對(duì)象的HBV或HCV等病毒的感染過(guò)程,因此該模型只適合用于肝移植和再生的研究,并不適合用于HBV、HCV等的感染研究。

    構(gòu)建tet-on系統(tǒng)調(diào)控的uPA轉(zhuǎn)基因/免疫缺陷小鼠模型是一個(gè)可完全避開上述通過(guò)腺病毒感染轉(zhuǎn)入uPA基因的模型缺陷的策略[19-20]。本研究建立了基于tet-on的可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)PCR擴(kuò)增成功獲得目的基因Alb、GLUC、rtTA、TRE2、uPA、IRES-ZsGreen(圖1),并將其插入改造后的pUC19、pLNHX載體中,酶切鑒定結(jié)果(圖2)表明:已成功構(gòu)建pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen重組質(zhì)粒。后期我們對(duì)重組質(zhì)粒功能進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果初步確定了Alb啟動(dòng)子、rtTA、TRE2具有表達(dá)活性(圖3)。實(shí)驗(yàn)組Dox誘導(dǎo)后細(xì)胞有綠色熒光表達(dá),可確定TRE2-uPA-IRES-ZsGreen表達(dá)的可調(diào)控性。

    本研究所構(gòu)建的可調(diào)控性u(píng)PA誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)將進(jìn)一步用于構(gòu)建可調(diào)控性u(píng)PA/SCID小鼠模型,所建立的小鼠作為肝臟人源化小鼠模型,可解決以往各種轉(zhuǎn)病毒基因小鼠、病毒基因高壓水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染小鼠模型等的非自然感染過(guò)程的問(wèn)題,同時(shí)由于實(shí)現(xiàn)了毒性基因uPA的可控表達(dá),還可以克服原有uPA/SCID小鼠的品系繁育困難,手術(shù)窗口期限制等缺陷,從而為病毒性肝炎的研究提供一個(gè)更加有力的模型。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Meuleman P,Libbrecht L,De Vos R,etal. Morphological and biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera [J]. Hepatology, 2005,41(4):847-856.

    [2]Song X, Guo Y, Duo S,etal. A mouse model of inducible liver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocyte transplantation[J]. Am J Pathol, 2009,175(5):1975-1983.

    [3]Heckel JL, Sandgren EP, Degen JL,etal. Neonatal bleeding in transgenic mice expressing urokinase-type plasminogen activator[J]. Cell, 1990,62(3):447-456.

    [4]Sandgren EP,Palmiter RD,Heckel JL,etal. Complete hepatic regeneration after somatic deletion of an Albumin-plasminogen activator transgene[J]. Cell, 1991,66(2):245-256.

    [5]Philip Meuleman, Geert Leroux-Roels. The human liver-uPA-SCID mouse:A model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV[J]. Antiviral Research, 2008,80(3): 231-238.

    [6]Trépo C, Chan HL, Lok A. Hepatitis B virus infection[J]. Lancet, 2014,Jun 18.(14)60220-60228.

    [7]Guidotti LG,Rochford R,Chung J,etal. Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection[J]. Science, 1999,284(5415):825-829.

    [8]Baumert TF, Yang C, Schürmann P,etal. Hepatitis B virus mutations associated with fulminant hepatitis induce apoptosis in primary Tupaia hepatocytes[J]. Hepatology, 2005,41(2):247-256.

    [9]Lin E, Luscombe C, Colledge D,etal. Long-term therapy with the guanine nucleoside analog penciclovir controls chronic duck hepatitis B virus infection in vivo[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1998,42(8):2132-2137.

    [10]Dandri M,Lutgehetmann M,Volz T,etal. Small Animal Model Systems for Studying Hepatitis B Virus Replication and Pathogenesis[J]. Seminars in liver disease, 2006,26(2):181-191.

    [11]Kimura K,Kakimi K,Wieland S,etal. Interleukin-18 inhibits hepatitis B virus replication in the livers of transgenic mice[J]. J Virol, 2002,76(21):10702-10707.

    [12]Robek MD,Boyd BS,Wieland SF,etal. Signal transduction pathways that inhibit hepatitis B virus replication [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(6):1743-1747.

    [13]Guidotti LG,Matzke B,Schaller H,etal. High-Level Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mice[J]. Journal of Virology, 1995,69(10):6158-6169.

    [14]Liu F,Song Y,Liu D,etal. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA[J]. Gene Therapy, 1999,6(7):1258-1266.

    [15]Yang PL,Althage A,Chung J,etal. Hydrodynamic injection of viral DNA: A mouse model of acute hepatitis B virus infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(21):13825-13830.

    [16]Konishi M,Tanaka H,Kaito M,etal. Ultrastructural demonstration of hepatitis B virus production in a mouse model produced by hydrodynamic transfection[J]. Int J Mol Med, 2007,20(1):31-36.

    [17]Huang LR,Wu HL,Chen PJ ,etal. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(47):17862-12867.

    [18]De Jong YP, Rice CM, Ploss A. New horizons for studying human hepatotropic infections[J]. J Clin Invest, 2010,120(3):650-653.

    [19]張一,黎曉敏,呂鳳林,等. Cre/Loxp和四環(huán)素系統(tǒng)在基因可控表達(dá)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2007,(1):76-80.

    [20]楊麗華,周常文. Tet-on調(diào)控的基因表達(dá)載體的構(gòu)建與體外表達(dá)研究[J]. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,(2):81-83.

    〔修回日期〕2014-11-20

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